益氣活血通絡方調(diào)控Drp1 抑制血管新生減輕單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎纖維化

張孟娟，王洪雙，許暢，劉佳志，何珍，徐賀朋，周文平，鐘艷，2，3，王箏，2，3，王香婷，2（. 河北中醫(yī)藥大學，河北 石家莊 050200；2. 河北省中西醫(yī)結(jié)合肝腎病證研究重點實驗室，河北 石家莊 05009；3. 河北中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結(jié)合研究所，河北 石家莊 05009）

慢性腎臟?。–hronic kidney disease，CKD）是以腎臟結(jié)構(gòu)損傷及腎功能下降為特征的一類常見慢性疾病，全球發(fā)病率為7%～12%，我國患病率約為10.8%，嚴重危害人們健康[1-2]。CKD呈慢性不可逆進展，最終發(fā)展為終末期腎功能衰竭，而腎臟纖維化是各種CKD 進展為終末期腎功能衰竭的共同病理途徑，包括腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化，腎纖維化是反映腎功能下降程度和判斷預后的重要指標，延緩甚至逆轉(zhuǎn)腎臟纖維化是CKD 治療的主要目標[3]。研究[4-6]發(fā)現(xiàn)，血管新生在腎臟病發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，參與腎臟損傷，加重腎纖維化。線粒體分裂后，細小的線粒體分布到細胞絲狀偽足和片狀偽足形成區(qū)域，為細胞偽足生成和運動提供能量，促進細胞遷移及血管新生[7]。動力相關蛋白1（Dynamin-related protein 1，Drp1）是調(diào)節(jié)線粒體分裂的核心角色[8]，可調(diào)控血管新生，在CKD纖維化進展中發(fā)揮重要作用。

益氣活血通絡方是本研究團隊創(chuàng)始人趙玉庸教授在“久病入絡”中醫(yī)理論指導下，根據(jù)CKD “腎絡瘀阻”的病機學說而創(chuàng)立的，臨床上對CKD 療效確切[9-10]。本課題組前期研究[11-12]證實，益氣活血通絡方可通過調(diào)節(jié)細胞自噬，抑制腎小管上皮細胞表型轉(zhuǎn)化，減輕腎臟病理損傷，延緩腎纖維化進程，但其拮抗腎纖維化的作用機制尚未完全明確。故本研究擬建立單側(cè)輸尿管梗阻（Unilateral ureteral obstruction，UUO）大鼠模型，探討益氣活血通絡方調(diào)控Drp1 抑制血管新生，進而延緩腎纖維化的可能作用機制，以期為益氣活血通絡方的臨床應用提供理論依據(jù)，并為CKD 的新藥開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 動物健康雄性Wistar 大鼠48只，SPF級，體質(zhì)量180～200 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2016-0011。動物飼養(yǎng)在溫度為（21±3）℃、相對濕度為50%～70%的環(huán)境中，自由進食飲水。本動物實驗經(jīng)河北中醫(yī)藥大學實驗動物管理和倫理委員會審核，批準編號：DWLL2021085。

1.2 藥物及試劑益氣活血通絡方由黃芪、蟬蛻、地龍、僵蠶、烏梢蛇、丹參、川芎、龜板中藥顆粒劑組成，購自神威藥業(yè)集團公司，批號分別為：21071121、21021881、21012421、21041461、20081171、21070231、21020621、19 120961；氯沙坦鉀片，杭州默沙東制藥公司，批號：T029726。PCR 純化試劑盒，美國Omega Bio-Tek 公司，批號：R6934-01；SweScript All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR（One-Step gDNA Remover，批號：G3337-50）、2×Universal Blue SYBR Green qPCR Master Mix（批號：G3326-05）、血管內(nèi)皮生長因子A（VEGF-A）抗體（批號：GB11034B）、血管內(nèi)皮生長因子受體2（VEGFR2）抗體（批號：GB11190），武漢賽維爾生物科技公司；通用SP 試劑盒（批號：SP-9000）、DAB顯色試劑盒（批號：ZLI-9018），北京中杉金橋生物技術公司；α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）抗體（批號：ab202509）、波形蛋白（Vimentin）抗體（批號：ab92547），英國Abcam 公司；I 型膠原蛋白（Col Ⅰ）抗體（批號：67288-1-lg）、GAPDH 抗體（批號：10494-1-AP），武漢三鷹生物技術公司；CD34抗體（批號：NB600-1071），美國Novus Biologicals 公司；Drp1 抗體（批號：YT1414）、Ser616 位點磷酸化Drp1（p-Drp1S616）抗體（批號：YP1318），美國Immunoway 公司；熒光二抗（批號：D00825-14），美國LI-COR Biosciences公司。

1.3 儀器165-8000 小型垂直電泳槽、221BR61190型半干轉(zhuǎn)膜儀、ABI 7500 型實時熒光定量PCR 儀，美國Bio-Rad 公司；Odyssey 紅外成像掃描儀，美國LI-COR Biosciences 公司；DP72-CCD 型顯微照相儀、BX53 型顯微鏡、病理圖文分析系統(tǒng)，日本Olympus 公司；超低溫保存箱，日本SANYO 公司；冷凍高速離心機，美國Thermo Fisher科技公司。

1.4 分組、模型復制及給藥將48只雄性Wistar大鼠隨機分為假手術組、模型組、氯沙坦鉀組（20 mg·kg-1）、益氣活血通絡方組（1.92 g·kg-1顆粒劑，相當于11.7 g·kg-1生藥量），每組12 只。模型組、氯沙坦鉀組與益氣活血通絡方組大鼠采用單側(cè)輸尿管結(jié)扎的方式復制腎纖維化動物模型[12]。異氟烷吸入麻醉大鼠后，切開左下腹，游離左側(cè)輸尿管，于上1/3及下1/3處分別結(jié)扎，從中間剪斷，逐層縫合皮膚；假手術組只游離輸尿管但不結(jié)扎。術后第1天開始按照上述劑量灌胃給藥，假手術組及模型組大鼠給予同等容量蒸餾水灌胃，每日1次，連續(xù)14 d。實驗過程觀察大鼠一般狀態(tài)的變化，如精神狀態(tài)、毛發(fā)外觀及活動度等。

1.5 取材末次給藥后大鼠禁食不禁水24 h，麻醉后股動脈取血；然后摘取左側(cè)腎臟，剝離包膜并用生理鹽水沖洗；沿腎長軸橫切一分為二，一半腎組織于4%多聚甲醛溶液中固定保存，一半腎組織在-80 ℃冰箱保存。

1.6 腎組織病理學觀察取固定后的腎組織，經(jīng)梯度乙醇脫水、透明、浸蠟后，石蠟包埋，切片；分別進行蘇木素-伊紅（HE）染色及Masson 染色，中性膠封片后，于光學顯微鏡下觀察腎組織病理變化。計算：腎組織纖維化水平（%）=（Masson 藍染色面積/總面積）×100%。

1.7 免疫組化法檢測腎組織ColⅠ、Vimentin、α-SMA、VEGF-A、CD34 蛋白表達取腎組織石蠟切片，加入3% H2O2去離子水阻斷內(nèi)源性過氧化物酶；PBS 洗凈后，加入枸椽酸緩沖液進行抗原修復；滴加10%山羊血清封閉后，分別加入Col Ⅰ、α-SMA、Vimentin、VEGF-A、CD34 抗體（稀釋比例均為1∶200），4 ℃下過夜；滴加生物素標記的二抗孵育后，滴加辣根過氧化物酶；PBS 清洗后，經(jīng)DAB顯色、蘇木精復染、水洗返藍、梯度乙醇脫水、二甲苯透明后，用中性樹脂封片；利用圖像采集系統(tǒng)拍照，以棕黃色為陽性染色，計算每個視野中的平均光密度值（IOD/Area），作為目的蛋白表達水平。

1.8 Western Blot 法檢測腎組織α-SMA、Vimentin、VEGF-A、VEGFR2、Drp1、p-Drp1S616 蛋白表達取腎組織100 mg，加入含蛋白酶抑制劑及磷酸酶抑制劑的RIPA 裂解液1 mL，勻漿后靜置裂解30 min，取上清；100 ℃煮沸10 min 變性，然后用10%分離膠進行凝膠電泳，25 V半干轉(zhuǎn)30 min，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF 膜；5%脫脂牛奶封閉后，分別加入一抗α-SMA（1∶3 000）、Vimentin（1∶1 000）、VEGF-A（1∶1 000）、VEGFR2（1∶1 000）、Drp1（1∶1 000）、p-Drp1S616（1∶1 000）、GAPDH（1∶3 000），4 ℃下孵育過夜；清洗，室溫下孵育二抗（1∶20 000）；TBST清洗后，采用紅外激光成像，掃描；采用ImageJ 軟件分析蛋白條帶灰度值，計算：目的蛋白相對表達水平=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參蛋白（GAPDH）條帶灰度值。

1.9 Real-time PCR 法檢測腎組織VEGF-A、CD34、VEGFR2 mRNA 表達取各組大鼠腎組織適量，充分研磨破碎后，加入Trizol 充分裂解；分別提取各樣品的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，逆轉(zhuǎn)錄反應條件：25 ℃、10 min，50 ℃、30 min，85 ℃、5 s。以cDNA為模板，進行實時熒光定量PCR擴增反應，三步法反應：預變性95 ℃、30 s，變性95 ℃、15 s，退火延伸60 ℃、30 s，共40 個循環(huán)。進行熔解曲線分析，根據(jù)擴增曲線讀取Ct 值，以GAPDH 為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計算目的基因的相對表達水平；假手術組基因相對表達水平設為1，實驗重復3 次。引物由武漢賽維爾生物科技公司提供，引物序列見表1。

表1 Real-time PCR 引物序列Table 1 Primer sequences of Real-time PCR

1.10 統(tǒng)計學處理方法采用SPSS 26.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析；計量資料以均數(shù)± 標準差（±s）表示；數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布且方差齊時，多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩兩比較采用SNK-q法；數(shù)據(jù)不符合正態(tài)性或方差不齊時，多組間比較采用Kruskal-WallisH檢驗，兩兩比較采用秩和檢驗；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 益氣活血通絡方對UUO 大鼠一般情況的影響各組大鼠造模前進食、飲水均正常，皮毛光滑柔亮，對周圍環(huán)境刺激反應較為靈敏，適應性喂養(yǎng)期間大小便均正常，體質(zhì)量有所增加。單側(cè)輸尿管結(jié)扎手術后，大鼠精神萎靡、消瘦，活動減少。本課題組前期研究[13]證明，模型組大鼠的尿素氮（BUN）和肌酐（Scr）水平較假手術組明顯升高（P＜0.05）；而與模型組比較，益氣活血通絡方組大鼠的BUN、Scr 水平均明顯下降（P＜0.05）。

2.2 益氣活血通絡方對UUO 大鼠腎組織病理變化的影響結(jié)果見圖1、圖2。假手術組大鼠腎臟結(jié)構(gòu)正常，腎小球、腎小管及間質(zhì)均無異常改變。與假手術組比較，模型組大鼠腎組織出現(xiàn)明顯的腎小管上皮細胞變性、壞死、脫落，大量炎性細胞浸潤，腎小管萎縮，腎間質(zhì)膠原纖維沉積明顯增多（P＜0.05）。與模型組比較，氯沙坦鉀組及益氣活血通絡方組大鼠腎臟組織的炎性細胞浸潤有一定程度減輕，膠原纖維沉積明顯減少（P＜0.05）。結(jié)果表明，益氣活血通絡方可以明顯改善UUO 大鼠的腎臟組織病理變化，減少膠原纖維沉積。

圖1 益氣活血通絡方對單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎組織病理變化的影響（HE 染色，×400）Figure 1 Effect of Yiqi Huoxue Tongluo Recipe on pathological changes of renal tissue in unilateral ureteral obstruction rats（HE staining，×400）

圖2 益氣活血通絡方對單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎組織纖維化的影響（Masson染色，×400； ±s，n=6）Figure 2 Effect of Yiqi Huoxue Tongluo Recipe on renal fibrosis in unilateral ureteral obstruction rats（Masson staining，×400； ±s，n=6）

2.3 益氣活血通絡方對UUO 大鼠腎組織中ColⅠ、α-SMA、Vimentin、VEGF-A、CD34 蛋白表達水平的影響結(jié)果見圖3。與假手術組比較，模型組大鼠腎間質(zhì)中的ColⅠ、α-SMA、Vimentin、CD34蛋白表達量及胞質(zhì)中VEGF-A 蛋白表達量均明顯升高（P＜0.05）。與模型組比較，氯沙坦鉀組及益氣活血通絡方組大鼠腎間質(zhì)中的Col Ⅰ、 α- SMA、Vimentin、CD34 蛋白表達量及胞質(zhì)中VEGF-A 蛋白表達量均明顯降低（P＜0.05）。

圖3 益氣活血通絡方對單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎組織中α-SMA、Vimentin、ColⅠ、VEGF-A、CD34 蛋白表達水平的影響（免疫組化，×400； ±s，n=6）Figure 3 Effects of Yiqi Huoxue Tongluo Recipe on the protein expressions levels of α-SMA，Vimentin，ColⅠ，VEGF-A and CD34 in renal tissue of unilateral ureteral obstruction rats（IHC，×400； ±s，n=6）

2.4 益氣活血通絡方對UUO 大鼠腎組織中α-SMA、Vimentin、VEGF-A、VEGFR2、Drp1、p-Drp1蛋白表達的影響結(jié)果見圖4。與假手術組比較，模型組大鼠腎組織中α-SMA、Vimentin、VEGF-A、VEGFR2 及p-Drp1/Drp1 蛋白表達水平均明顯升高（P＜0.05）。與模型組比較，氯沙坦鉀組及益氣活血通絡方組大鼠腎組織中α-SMA、Vimentin、VEGF-A、VEGFR2 及p-Drp1/Drp1 蛋白表達水平均明顯降低（P＜0.05）。

圖4 益氣活血通絡方對單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎組織中α-SMA、Vimentin、VEGF-A、VEGFR2、Drp1、p-Drp1 蛋白表達的影響（ ±s，n=3）Figure 4 Effects of Yiqi Huoxue Tongluo Recipe on the protein expressions of α-SMA，Vimentin，VEGF-A，VEGFR2，Drp1 and p-Drp1 in renal tissue of unilateral ureteral obstruction rats（ ±s，n=3）

2.5 益氣活血通絡方對UUO 大鼠腎組織中VEGF-A、VEGFR2、CD34 mRNA 表達的影響結(jié)果見圖5。與假手術組比較，模型組大鼠腎組織中VEGF-A、VEGFR2、CD34 mRNA 表達水平均明顯升高（P＜0.05）。與模型組比較，氯沙坦鉀組及益氣活血通絡方組大鼠腎組織中VEGF-A、VEGFR2、CD34 mRNA表達水平均明顯降低（P＜0.05）。

圖5 益氣活血通絡方對單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎組織中VEGF-A、VEGFR2、CD34 mRNA 表達的影響（ ±s，n=3）Figure 5 Effects of Yiqi Huoxue Tongluo Recipe on the mRNA expressions of VEGF-A，VEGFR2 and CD34 in renal tissue of unilateral ureteral obstruction rats（ ±s，n=3）

3 討論

腎纖維化的主要病理改變?yōu)槟I小管萎縮、炎癥細胞浸潤和細胞外基質(zhì)（ECM）異常增多及過度沉積[14-15]。單側(cè)輸尿管梗阻是制備腎纖維化動物模型的經(jīng)典方法[16]，簡單可靠，且不受血糖、血脂及藥物影響。本研究通過單側(cè)輸尿管結(jié)扎術建立了UUO 大鼠模型，通過腎組織病理形態(tài)學觀察發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠腎小管出現(xiàn)不同程度萎縮，大量炎性細胞浸潤，間質(zhì)增寬且膠原纖維沉積增多，間充質(zhì)細胞標志蛋白α-SMA、Vimentin 及間質(zhì)基質(zhì)成分ColⅠ表達量明顯升高，提示腎纖維化大鼠模型復制成功。

血管新生也稱為血管生成（Angiogenesis），指在原有血管的基礎上，血管內(nèi)皮細胞遷移、增殖、出芽形成新血管的過程[17]。腎血管系統(tǒng)結(jié)構(gòu)復雜，對于維持腎臟的正常功能至關重要，而新生血管不成熟、雜亂無序、易滲漏，會影響腎臟的正常生理功能，所以血管新生在腎臟病發(fā)生發(fā)展過程中具有重要意義，參與腎臟損傷，加重腎纖維化[18-19]。VEGF是目前發(fā)現(xiàn)的作用最強且與血管新生關系最緊密的細胞因子，VEGF 蛋白家族包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、胎盤生長因子（PlGF）、病毒編碼的VEGF-E和蛇毒衍生的VEGF-F[20]，其中VEGF-A是最具特征的家族成員，可促進內(nèi)皮細胞激活、增殖、遷移和管形成，調(diào)節(jié)新生血管的增殖和分化，是血管生成過程中最有效的刺激物。VEGF通過與細胞表面的酪氨酸激酶受體（VEGFR）結(jié)合刺激細胞反應，VEGFR 有VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3 三型，VEGF-A 主要與VEGFR1、VEGFR2 結(jié)合來驅(qū)動血管生成。VEGFR1 與VEGF-A 的親和力明顯高于VEGFR2，但VEGFR1介導的促血管生成活性遠低于VEGFR2，目前認為VEGFR2具有最強的促血管生成活性[21-22]。研究[23]表明，VEGF 能夠強烈刺激成纖維細胞的增殖，腎小管VEGF表達增強的轉(zhuǎn)基因小鼠的腎臟表現(xiàn)出明顯的纖維化。CD34 在血管內(nèi)皮細胞中特異性表達，對內(nèi)皮細胞分化非常敏感，可用于標記未成熟的微血管或新生的血管內(nèi)皮細胞，能夠反映新生血管的形成情況和新生血管密度，常與其他血管生物標記物聯(lián)合評估血管生成[24-25]。本研究通過檢測VEGF-A、VEGFR2 及CD34 來反映大鼠腎組織血管新生情況，結(jié)果顯示模型組大鼠腎臟中血管新生指標的表達水平均顯著提高，表明腎臟纖維化與血管新生關系密切。而益氣活血通絡方干預后，UUO 大鼠腎組織中VEGF-A、VEGFR2 及CD34 表達均明顯下調(diào)，提示其具有抗血管新生的作用。

血管新生通過血管內(nèi)皮細胞遷移、增殖來實現(xiàn)，而細胞遷移依賴于肌動蛋白細胞骨架重組形成的絲狀偽足和片狀偽足[26]。研究[27-28]發(fā)現(xiàn)，當線粒體分裂較少、體積較大時，會阻礙其分布到細胞絲狀偽足和片狀偽足形成區(qū)域，無法滿足該區(qū)域大量ATP 需求，阻礙細胞偽足的生成和運動，影響細胞遷移。因此，線粒體分裂與細胞遷移、血管新生密切相關。線粒體分裂由動力相關蛋白1（Drp1）和線粒體分裂蛋白1（Fis1）負責。Drp1 是動力蛋白超家族的GTP酶，是調(diào)節(jié)線粒體裂變的核心角色。Drp1 可通過各種修飾活化調(diào)節(jié)線粒體形狀和功能，磷酸化是Drp1最具特征的翻譯后修飾方式，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)其多個磷酸化位點，如通過Ser616 的磷酸化激活Drp1，能促進線粒體分裂[29-30]。研究[7，31]證明，Drp1Ser616磷酸化后能顯著刺激線粒體分裂，分裂后的細小線粒體分布到細胞絲狀偽足和片狀偽足形成區(qū)域，為其提供能量，促進內(nèi)皮細胞的遷移，促進血管生成。本研究檢測了大鼠腎組織中Drp1、p-Drp1S616 蛋白表達水平，Drp1 蛋白表達水平在各組間的差異無統(tǒng)計學意義，但與假手術組比較，模型組的p-Drp1S616 蛋白表達水平明顯升高，經(jīng)益氣活血通絡方干預后明顯下調(diào)。說明益氣活血通絡方可能通過調(diào)控Drp1 磷酸化，發(fā)揮抗UUO 大鼠腎組織血管新生及腎纖維化的作用。

腎纖維化屬于中醫(yī)“腎勞”“關格”“虛勞”“尿濁”范疇，為本虛標實之證[32]。趙玉庸教授系統(tǒng)總結(jié)了腎臟病的病因、臨床表現(xiàn)，結(jié)合實驗室檢查和病理學變化，提出CKD “腎絡瘀阻”病機學說。其遵循“去菀陳莝”治則，結(jié)合本病病機和“絡以通為用”的特性，以益氣活血通絡為法，創(chuàng)立益氣活血通絡方，由黃芪、丹參、川芎、蟬蛻、地龍、僵蠶、烏梢蛇、龜板組成。根據(jù)“氣為血之帥”及“病久必虛”理論，方中重用黃芪以補氣扶正，助通絡藥物行血，同時利水消腫；丹參活血養(yǎng)血化瘀，川芎活血化瘀行氣，龜板滋陰益腎；根據(jù)“久病入絡” “久病必瘀”的中醫(yī)理論，腎纖維化病程日久，瘀血阻于腎絡，故選用性喜走竄、善入絡脈的蟲類藥物烏梢蛇、蟬蛻、地龍、僵蠶以搜風祛痰、化瘀通絡。諸藥相伍，通補并用，標本兼顧，在臨床應用時隨癥加減，療效確切[33]。

綜上所述，益氣活血通絡方能夠減輕UUO 大鼠腎纖維化水平，其機制可能與下調(diào)Drp1 磷酸化水平、抑制血管新生有關。本研究結(jié)果可為益氣活血通絡方的臨床應用及相關機制研究提供參考。