柔肝方對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠血管內(nèi)皮功能及心肌超微結(jié)構(gòu)的影響

周敏，董玉娟，甘海寧，何鑫，李瑩鴻，鄭家鼎，靳利利（. 廣東省第二中醫(yī)院，廣東 廣州 50095；. 廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院/廣東省中醫(yī)藥研究開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 50095；. 廣州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，廣東 廣州 5080）

高血壓是心血管疾病的主要危險(xiǎn)因素，目前我國心血管患病總?cè)藬?shù)為3.3億，其中高血壓2.45億，其患病率呈逐年上升趨勢(shì)，且高血壓病知曉率、治療率和控制率低，為人類健康與社會(huì)發(fā)展帶來了沉重的疾病負(fù)擔(dān)，是當(dāng)前的主要公共衛(wèi)生問題[1-3]。隨著患者病情的發(fā)展，高血壓可引起靶器官如心臟、腦、腎臟、眼底、大血管等的損傷[4-6]。

《臨證指南醫(yī)案·肝風(fēng)》[7]曰：“經(jīng)云，東方生風(fēng)，風(fēng)生木，木生酸，酸生肝，故肝為風(fēng)木之臟，因有相火內(nèi)寄，體陰用陽”，總結(jié)出肝的生理功能為“體陰而用陽”，提出了“肝為剛臟，非柔潤不能調(diào)和”的思想?！额愖C治裁·肝氣肝風(fēng)肝火論治》[8]有“肝為剛臟，職司疏泄，用藥不宜剛而宜柔，不宜伐而宜和”。治肝之病，故以疏肝性、柔肝體、平肝火為要。柔肝方是我院心血管科靳利利教授在以上理論基礎(chǔ)上創(chuàng)建的自擬方，目前運(yùn)用柔肝方治療高血壓肝陽上亢證患者的臨床療效已得到肯定，能降低患者血壓，同時(shí)對(duì)高血壓所出現(xiàn)的相關(guān)癥狀如頭暈頭痛、急躁易怒等也能明顯改善[9-10]。

血管內(nèi)皮功能障礙與高血壓的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，并高度預(yù)測(cè)著未來的心血管事件，因此改善血管內(nèi)皮功能障礙是防控高血壓的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一[11-13]?；诖耍狙芯繑M繼續(xù)探討柔肝方的降壓效果和對(duì)高血壓病血管內(nèi)皮功能及心肌組織形態(tài)學(xué)的影響，以期為該復(fù)方的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物無特異性病原體的SPF 級(jí)Wistar-Kyoto（WKY）大鼠10只、SHR大鼠50只，雌雄各半，體質(zhì)量160～180 g，8周齡，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：110011191105 8365-68，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2021-0006。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)環(huán)境：廣東省第二中醫(yī)院（廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院）SPF 級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，使用許可證號(hào)：SYXK（粵）2020-0059。本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)廣東省第二中醫(yī)院（廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)：048725。

1.2 藥物及試劑柔肝方，組方為天麻10 g、鉤藤10 g、牛膝10 g、白芍10 g、茯苓10 g、桑寄生20 g、杜仲20 g、酸棗仁30 g，飲片來源于廣東省第二中醫(yī)院中藥房，為廣州至信藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)。取比例組方藥材加水煎煮2 次，每次加10 倍量水，煎煮1 h，合并煎液，濾過，濾液減壓濃縮成含生藥量2 g·mL-1藥液，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。厄貝沙坦片，?guī)格：75 mg/片，浙江華海藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：0000032576。內(nèi)皮素（ET）、一氧化氮（NO）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、細(xì)胞間黏附分子1（ICAM-1）、血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子1（VCAM-1）ELISA試劑盒，均購于江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司，批號(hào)均為：20200109NC3。Trizol RNA 裂解液，北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：20 210808；RT-PCR 測(cè)試盒，湖南艾科瑞公司，批號(hào)：AG11701；特異性引物，廣州瑞真生物技術(shù)公司合成；氯仿、異丙醇、無水乙醇均為分析純，購自廣州化學(xué)試劑廠。

1.3 主要儀器JJ3000 動(dòng)物電子秤，美國G＆G 公司；BS224S 電子天平（1/10 000），德國Sartorius 公司；-80 ℃超低溫冰箱，美國Thermo公司；CODA系列雙通道無創(chuàng)血壓記錄系統(tǒng)，美國Kent 公司；5424小型高速離心機(jī)，德國Eppendorf 公司；StepOnePlu熒光定量PCR 儀，德國Biometm 公司；Varioskan Flash 型全波長多功能酶標(biāo)儀，美國Thermo 公司；SmartSpec PLUS 核酸蛋白測(cè)定儀，美國BIO-RAD 公司；Milli Q PLUS 超級(jí)純水儀，美國Millipore 公司；HH-6 數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市富華儀器有限公司；超薄切片機(jī)，德國Leica 公司；鉆石切片刀，瑞士Daitome公司；透射電子顯微鏡，日本Hitachi公司。

1.4 分組及給藥方法適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，取WKY大鼠10 只，雌雄各半，作為正常組；取SHR 大鼠50 只，雌雄各半，作為高血壓模型組。給藥前，測(cè)量WKY大鼠及SHR大鼠的血壓，隨機(jī)將SHR大鼠分為5 組，分別為模型組、厄貝沙坦（13.5 mg·kg-1）組及柔肝方高、中、低劑量（21.6、10.8、5.4 g·kg-1）組，每組10 只，雌雄各半。分組后各給藥組按劑量灌胃給藥。參考《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》中人和動(dòng)物間按體表面積折算的等效劑量比值表，根據(jù)臨床用藥劑量換算得到實(shí)驗(yàn)劑量，其中柔肝方臨床常規(guī)給藥劑量為中劑量，高劑量為中劑量的2倍，低劑量為中劑量的0.5倍。正常組、模型組同法灌胃給予等體積蒸餾水。每天1次，連續(xù)8周。

1.5 血壓監(jiān)測(cè)用無創(chuàng)尾動(dòng)脈測(cè)壓法分別檢測(cè)給藥前后各組大鼠收縮壓、舒張壓，重復(fù)測(cè)量3次，取平均值，觀察各組血壓變化情況。

1.6 ELISA 法檢測(cè)大鼠血清中ET、NO、SOD、MDA、ICAM-1、VCAM-1 的含量測(cè)完血壓，大鼠腹腔注射2%依托咪酯（3 mL·kg-1），麻醉后仰臥固定于實(shí)驗(yàn)臺(tái)，用組織剪打開腹腔，暴露腹主動(dòng)脈，從腹主動(dòng)脈取血，并將血液標(biāo)本以3 000 r·min-1離心10 min（離心半徑10 cm）分離血清，按試劑盒說明書操作步驟檢測(cè)血清中各指標(biāo)含量。

1.7 RT-qPCR 法檢測(cè)大鼠血管內(nèi)皮組織ICAM-1、VCAM-1 mRNA 表達(dá)水平引物序列：ICAM-1，F(xiàn)：5’-GTGATGCTCAGGTATCCATCCA-3’，R：5’-CACAGTTCTCAAAGCACAGCG-3’；VCAM-1，F(xiàn)：5’-AAAAGGCTCTTGTTTGCCGA-3’；R：5’-TCTTGGG GGAGGTGTAGACT-3’。用眼科剪取下胸主動(dòng)脈，仔細(xì)分離干凈血管周圍脂肪組織，-80 ℃凍存。取血管內(nèi)皮組織，采用Trizol法提取血管內(nèi)皮總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA 為模板，根據(jù)Primerbank 提供的基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，通過PCR 儀檢測(cè)各基因的表達(dá)。

1.8 心肌超微結(jié)構(gòu)電鏡觀察取各組大鼠左心室心肌組織，切成體積＜1 mm3大小，迅速投入電鏡固定液4 ℃固定2～4 h；漂洗后，于1%的鋨酸（pH7.4 的0.1 moL·L-1磷酸緩沖液配置）室溫（20 ℃）固定2 h，逐級(jí)酒精、丙酮脫水，包埋；超薄切片，鈾鉛雙染色后在透射電子顯微鏡下觀察，采集圖像。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法采用SPSS 20.0 軟件，所有計(jì)量資料以均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。多組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析；組間均值兩兩比較，先進(jìn)行方差同質(zhì)性檢驗(yàn)，當(dāng)方差齊時(shí)采用LSD 法，方差不齊時(shí)改用Dunnett’s T3 法。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 柔肝方對(duì)SHR 大鼠血壓的影響見表1。給藥前，與正常組比較，其余各組的收縮壓、舒張壓均明顯升高（P＜0.01）；給藥8 周后，與模型組比較，厄貝沙坦組及柔肝方高、中、低劑量組大鼠收縮壓、舒張壓均明顯降低（P＜0.01）。

表1 柔肝方對(duì)自發(fā)性高血壓（SHR）大鼠血壓的影響（ ±s，mmHg；n=10）Table 1 Effects of Rougan Decoction on blood pressure in spontaneous hypertensive（SHR）rats（ ±s，mmHg；n=10）

表1 柔肝方對(duì)自發(fā)性高血壓（SHR）大鼠血壓的影響（ ±s，mmHg；n=10）Table 1 Effects of Rougan Decoction on blood pressure in spontaneous hypertensive（SHR）rats（ ±s，mmHg；n=10）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01

給藥后舒張壓70.54 ± 7.06 118.01 ± 3.50**84.51 ± 4.55##98.41 ± 3.48##99.52 ± 4.49##103.25 ± 4.01##組別正常組模型組厄貝沙坦組柔肝方高劑量組柔肝方中劑量組柔肝方低劑量組劑量/（g·kg-1）--13.5 mg·kg-1 21.6 10.8 5.4給藥前收縮壓108.49 ± 4.97 167.08 ± 6.41**166.67 ± 6.88**167.34 ± 8.43**165.71 ± 6.77**166.96 ± 5.21**給藥前舒張壓72.75 ± 3.69 116.08 ± 5.83**114.96 ± 6.77**116.33 ± 5.16**114.36 ± 5.90**116.90 ± 7.15**給藥后收縮壓107.81 ± 5.30 172.71 ± 5.86**127.78 ± 5.74##138.25 ± 9.41##139.02 ± 8.81##145.04 ± 7.76##

2.2 柔肝方對(duì)SHR 大鼠血清中血管活性因子ET、NO 含量水平的影響見圖1。與正常組比較，模型組大鼠血清中收縮因子ET 含量明顯升高，舒張因子NO 含量明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組比較，厄貝沙坦組及柔肝方高、中、低劑量組大鼠血清ET含量均明顯降低，NO含量均明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），

圖1 柔肝方對(duì)自發(fā)性高血壓（SHR）大鼠血清中內(nèi)皮素（ET）、一氧化氮（NO）含量的影響（ ±s，n=10）Figure 1 Effects of Rougan Decoction on ET and NO content in serum of SHR rats（ ±s，n=10）

2.3 柔肝方對(duì)SHR 大鼠血清中氧化應(yīng)激因子SOD、MDA 的影響見圖2。與正常組比較，模型組大鼠血清中抗氧化指標(biāo)SOD 含量明顯降低，氧化應(yīng)激水平指標(biāo)MDA 含量明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組比較，厄貝沙坦組及柔肝方高、中、低劑量組大鼠血清SOD 含量均明顯升高，MDA 含量均明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。

圖2 柔肝方對(duì)自發(fā)性高血壓（SHR）大鼠血清中超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）含量的影響（ ±s，n=10）Figure 2 Effects of Rougan Decoction on SOD and MDA content in serum of SHR rats（ ±s，n=10）

2.4 柔肝方對(duì)SHR 大鼠血清中血管內(nèi)皮損傷標(biāo)志物ICAM-1、VCAM-1 含量的影響見圖3。與正常組比較，模型組大鼠血清中ICAM-1、VCAM-1 含量均明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。與模型組比較，厄貝沙坦組及柔肝方高、中、低劑量組大鼠血清ICAM-1、VCAM-1 含量均明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。

圖3 柔肝方對(duì)自發(fā)性高血壓（SHR）大鼠血清中細(xì)胞間黏附分子1（ICAM-1）、血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子1（VCAM-1）含量的影響（ ±s，n=10）Figure 3 Effects of Rougan Decoction on ICAM-1 and VCAM-1 content in serum of SHR rats（ ±s，n=10）

2.5 柔肝方對(duì)SHR 大鼠血管內(nèi)皮組織中ICAM-1、VCAM-1 mRNA 表達(dá)水平的影響見圖4。與正常組比較，模型組大鼠血管內(nèi)皮組織中ICAM-1、VCAM-1 mRNA 表達(dá)均明顯增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組比較，厄貝沙坦組及柔肝方高、中、低劑量組大鼠血管內(nèi)皮組織中ICAM-1、VCAM-1mRNA表達(dá)水平均明顯減弱，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

圖4 柔肝方對(duì)自發(fā)性高血壓（SHR）大鼠血管內(nèi)皮組織中細(xì)胞間黏附分子1（ICAM-1）、血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子1（VCAM-1）mRNA 表達(dá)水平的影響（ ±s，n=10）Figure 4 Effects of Rougan Decoction on mRNA expressions of ICAM-1 and VCAM-1 in vascular endothelial tissue of SHR rats（ ±s，n=10）

2.6 各組心肌透射電鏡觀察結(jié)果見圖5。正常組的肌原纖維排列規(guī)則整齊，明暗帶清楚，肌節(jié)Z線清晰平直，線粒體結(jié)構(gòu)完整、數(shù)量豐富，近卵圓形，嵴結(jié)構(gòu)清晰。模型組的肌原纖維曲直不齊，并出現(xiàn)大量萎縮、斷裂，肌絲溶解空化，肌節(jié)Z線斷裂或模糊不清，線粒體稀疏，結(jié)構(gòu)不清，部分出現(xiàn)空泡形成、破裂壞死，邊緣不規(guī)則等。經(jīng)治療后，各藥物組的SHR 大鼠的肌原纖維排列較整齊，部分肌原纖維節(jié)段性溶解，肌節(jié)Z 線較清晰，線粒體數(shù)量增加，結(jié)構(gòu)尚完整，少量線粒體膜破裂，線粒體部分的嵴模糊。

圖5 各組大鼠的心肌透射電鏡圖（×7 000）Figure 5 Myocardial transmission electron micrograph of rats in each group（×7 000）

3 討論

靳利利教授通過調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)高血壓患者中以肝陽上亢者居多，主要臨床表現(xiàn)為眩暈、頭痛、耳鳴、面紅目赤、肢體麻木、失眠多夢(mèng)、口干口苦等[9-10]，遂自擬柔肝方治療高血壓肝陽上亢證。柔肝方中天麻性平，主歸肝經(jīng)，主要作用是平抑肝陽；《本草匯言》曰：“主頭風(fēng)，頭痛，頭暈虛旋，癲癇強(qiáng)痙，四肢攣急，語言不順，一切中風(fēng)，風(fēng)痰等癥”。鉤藤性味甘涼，歸肝、心包經(jīng)，善于息風(fēng)止痙、清熱平肝；《本草綱目》曰：“大人頭旋目眩，平肝風(fēng)，除心熱”。天麻和鉤藤相得益彰，共奏平肝之功，用之為君。白芍性味酸甘，質(zhì)地柔潤，歸肝、脾經(jīng)，主要作用為養(yǎng)血柔肝、還有斂陰之效；《本草備要》曰：“補(bǔ)血，瀉肝，益脾，斂肝陰”，治療因血虛陰氣不足，導(dǎo)致肝陽偏亢，肝失柔和之證。（川）牛膝性味酸苦甘，歸肝、腎經(jīng)，具有“能引諸藥下行”之美稱，其功效為補(bǔ)益肝腎，引血下行。白芍和牛膝聯(lián)用，用之為臣，共起斂陰柔肝之功。

人體血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放的活性因子，如收縮因子ET、舒張因子NO等，調(diào)控著血管的收縮及舒張，收縮因子與舒張因子兩者之間的動(dòng)態(tài)平衡是維持正常血壓的重要因素[14-16]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見模型組大鼠處于ET高水平分泌、NO合成減少狀態(tài)，各劑量組柔肝方能明顯升高NO 水平，降低ET 水平，糾正失衡，從而降低血壓。目前研究發(fā)現(xiàn)高血壓患者體內(nèi)存在氧化與抗氧化二者水平失衡，細(xì)胞大量產(chǎn)生O2-、H2O2及過氧化脂質(zhì)產(chǎn)物，導(dǎo)致低炎癥狀態(tài)，在高血壓過程中促進(jìn)氧化應(yīng)激，導(dǎo)致血管功能障礙和靶器官損傷，進(jìn)而加速高血壓的進(jìn)程[17]。SOD是最重要的抗氧化酶之一，MDA 是氧自由基形成的過氧化物，二者的變化體現(xiàn)出機(jī)體內(nèi)氧自由基產(chǎn)生和清除的動(dòng)態(tài)平衡過程，通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激水平可保護(hù)血管內(nèi)皮并控制血壓[18-19]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明柔肝方能夠通過增高SHR大鼠血清SOD活性并降低MDA水平來改善氧化應(yīng)激狀態(tài)，提高機(jī)體抗氧化能力，從而改善血管內(nèi)皮功能，達(dá)到降低血壓的效果。ICAM-1、VCAM-1是免疫球蛋白超家族的細(xì)胞黏附分子，在血管內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)強(qiáng)，可與白細(xì)胞表面的α4β1整聯(lián)蛋白相結(jié)合，促進(jìn)白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞之間黏附，參與誘導(dǎo)內(nèi)皮血管各種炎癥反應(yīng)，引發(fā)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷[20-21]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見模型組大鼠血清中ICAM-1、VCAM-1指標(biāo)含量明顯升高，柔肝方可有效降低血清中兩者指標(biāo)的含量，且進(jìn)一步驗(yàn)證可明顯下調(diào)血管內(nèi)皮組織中ICAM-1、VCAM-1 的mRNA 表達(dá)，結(jié)果表明了柔肝方可保護(hù)血管內(nèi)皮，減輕血管損傷程度。

本研究顯示，柔肝方的調(diào)控效果沒有陽性藥明顯，可能與其復(fù)方的作用機(jī)制有關(guān)，柔肝方中天麻和鉤藤主要通過降低外周血管、腦血管和冠狀血管阻力以及改善血管內(nèi)皮功能等來達(dá)到降壓作用[22-23]，白芍、牛膝可影響血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）形成，抑制腎素血管緊張素醛固酮系統(tǒng)（RAAS）活性，茯苓、杜仲通過利尿作用來進(jìn)行降壓[24]。相對(duì)于AngⅡ受體抑制劑厄貝沙坦而言，柔肝方降壓的作用可能較為緩和，因而在一些指標(biāo)的調(diào)控效果上，柔肝方不如厄貝沙坦明顯。

綜上，本研究表明柔肝方具有明顯的降低舒張壓和收縮壓的效果，提示其作用機(jī)制與改善血管內(nèi)皮細(xì)胞功能有關(guān)。隨著高血壓病情的加重，會(huì)損害包括心臟在內(nèi)的靶器官。本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠的心肌超微結(jié)構(gòu)損傷嚴(yán)重，經(jīng)治療后大鼠的心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)損傷與模型組相比有所改善，心肌纖維、線粒體等組織受到的破壞明顯減少，說明柔肝方在改善心肌超微結(jié)構(gòu)方面有一定優(yōu)勢(shì)。此研究有助于該復(fù)方后續(xù)的進(jìn)一步深入研究，對(duì)其臨床運(yùn)用有重要的指導(dǎo)意義。