基于生物鐘調(diào)控探討腸安菌泰對腹瀉型腸易激綜合征的作用機制研究

沈丹婷，祝旺，張佳河，侯秋科，劉鳳斌，3（. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 50405；. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院脾胃病科，廣東 廣州 50405；3. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院白云醫(yī)院，廣東 廣州 50470）

腹瀉型腸易激綜合征（Diarrhea-predominant irritable bowel syndrome，IBS-D）是一種臨床表現(xiàn)不僅局限于胃腸系統(tǒng)方面的功能性腸病，大多數(shù)患者還合并了腸外表現(xiàn)，如睡眠障礙、焦慮和抑郁等。研究發(fā)現(xiàn)，腸黏膜低度炎癥是IBS-D的重要發(fā)病機制之一[1-2]，與腹痛、腹瀉和腸道功能障礙等臨床癥狀的出現(xiàn)密切相關(guān)[3]。IBS-D 患者腸黏膜炎癥水平比健康對照者更顯著，改變了過去“沒有形態(tài)學(xué)上的改變，是一種功能性腸道疾病”的說法[4]。NF-κB信號通路是導(dǎo)致IBS-D的核心炎性通路，該通路通過調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的免疫信號途徑，調(diào)節(jié)多種炎性因子的表達，在IBS-D患者長期持續(xù)存在的腸黏膜低度炎癥的病理過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用[5]。

生物鐘參與調(diào)節(jié)機體的生理病理進程[6]，生物鐘基因CRY1 可通過抑制NF-κB 信號通路發(fā)揮抗炎作用[7]。近年來，腸道生物鐘基因表達在功能性腸病中的作用逐漸得到研究者的關(guān)注[8-13]。有研究[14]發(fā)現(xiàn)，在IBS-D 患者結(jié)腸黏膜中生物鐘基因表達節(jié)律紊亂，與IBS-SSS總分和腹痛不適評分呈顯著正相關(guān)。但目前國內(nèi)外有關(guān)結(jié)腸生物鐘基因表達節(jié)律在IBS-D發(fā)病情況中作用及其發(fā)生機制的研究仍鮮見報道。

腸安菌泰（Chang’anJuntai，CAJT）是廣東省名中醫(yī)劉鳳斌教授在臨床上用于治療肝郁脾虛型IBS-D的有效復(fù)方[15-16]，具有疏肝止痛、健脾止瀉、寧心安神之功。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)腸安菌泰對IBS-D的治療作用與晝夜節(jié)律的調(diào)節(jié)密切相關(guān)，但具體作用機制尚不明確?；诖耍狙芯炕谏镧娬{(diào)控探討腸安菌泰對IBS-D的療效及其作用機制，以期為腸安菌泰的臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物從廣東省實驗動物中心購買SPF級C57BL/6J 小鼠9 只，動物質(zhì)量合格證號：44007200095171，其中雄性3 只、雌性6 只，4～6 周齡，體質(zhì)量14～18 g，生產(chǎn)許可證號：SCXK（粵）2018-0002，飼養(yǎng)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院SPF 級實驗動物中心。本研究方案獲得廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準，倫理編號：TCMF1-2021025。

1.2 藥物及試劑腸安菌泰由太子參、茯苓、白術(shù)、白芍、甘草、陳皮、防風、木香、黃連組成，中藥飲片購自廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，經(jīng)該院李得堂副主任中藥師鑒定為正品。匹維溴銨片，美國ABBOTT LABORATORIES LIMITED 公司，批號：714641。乙酸，天津市大茂化學(xué)試劑廠，批號：1110。TRIzolTM試劑、PageRulerTM預(yù)染蛋白分子量標準，美國Thermo Scientific公司，批號分別為：15596026、26616。Evo M-MLV 反轉(zhuǎn)錄試劑預(yù)混液、SYBR?Green Pro Taq HS 預(yù)混型qPCR試劑盒，AG艾科瑞生物公司，批號：AG11706、AG11701。Melatonin 抗體，英國Abbexa 公司，批號：Abx 100179；Aanat 抗體，英國Biorbyt 公司，批號：orb5712；Tryptase 抗體、抗GAPDH 抗體、抗CRY1 抗體、Phospho-IκBα抗體，美國Abcam 公司，批號分別為：ab2378、ab181602、ab104736、ab 133462；IκBα抗體、NF-κB p65 抗體、Phospho-NF-κB p65 抗體、抗兔IgG HRP偶聯(lián)抗體，美國CST 公司，批號分別為：4812、8242、3033、7074S。

1.3 儀器HERATHERM烘箱，美國Thermo Scientific公司；Nanodrop2000 超微量核酸蛋白測定儀、Quanstudio5 實時熒光定量PCR 儀，美國Thermofisher公司；CFX96 逆轉(zhuǎn)錄儀、1658004EDU 垂直電泳儀、1703930 濕轉(zhuǎn)槽、1708195 全自動多功能凝膠成像分析儀，美國BIO-RAD 公司；80i 熒光顯微鏡、FI3 成像系統(tǒng)，日本尼康公司。

1.4 藥物制備腸安菌泰中藥飲片委托廣東一方制藥有限公司制作成腸安菌泰顆粒劑，生產(chǎn)批號：J2007002，蒸餾水稀釋至所需濃度。匹維溴銨用研缽研碎至粉狀，蒸餾水稀釋至所需濃度。

1.5 模型復(fù)制、分組及給藥方法采用母嬰分離、乙酸灌腸聯(lián)合饑飽失常的方法構(gòu)建IBS-D 小鼠疾病模型[17-19]。實驗動物按性別分籠飼養(yǎng)，自由進食、飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按雄雌比例1∶2進行混居繁衍，孕鼠待產(chǎn)前單籠飼養(yǎng)，分娩后每窩子代小鼠保持在5～8 只，以仔鼠出生作為第0 天（Post-natal day 0，PD0）。以抽簽的方式隨機選取2 窩PD0 仔鼠為正常組，其余PD0 仔鼠進行IBS-D 造模。在PD1 至PD21，對仔鼠進行母嬰分離，分離時間為每天09∶00～13∶00。在PD21 至PD28，將幼鼠斷奶，與母鼠分開飼養(yǎng)。在PD28至PD42，進行乙酸灌腸和隔日喂食以模擬饑飽失常狀態(tài)。灌腸具體操作為：灌腸第1周每日取0.5%的乙酸0.5 mL注入小鼠結(jié)腸（距肛門5 cm處），保留30 s；隨后用等量生理鹽水徐徐注入，以稀釋醋酸并沖洗。灌腸第2周，乙酸濃度升高至0.8%，其余操作不變。正常對照組小鼠給予等量生理鹽水灌腸。造模結(jié)束7 d 后，進行IBS-D 模型評價。

篩選出模型復(fù)制成功的IBS-D小鼠，稱質(zhì)量，按隨機數(shù)字法將其分成模型組、腸安菌泰組（2.457 g·kg-1）和匹維溴銨組（22.75 mg·kg-1），每組6 只，雌雄各半。藥物給藥劑量依據(jù)課題組前期實驗給藥方案[20-21]。灌胃給藥前先將腸安菌泰藥液置于37 ℃水浴鍋中溫熱。每天灌胃給藥1次，連續(xù)2周。正常組與模型組小鼠給予等容積的生理鹽水灌胃。

1.6 IBS-D 發(fā)病情況評價①糖水偏嗜實驗（Sucrose preference test，SPT）：計算小鼠24 h 糖水偏嗜率（SP），SP（%）＝[糖水消耗量（g）/總液體消耗量（g）]×100%。②大便含水率測定（Fecal moisture content，F(xiàn)MC）和排便頻率（Fecal frequency，F(xiàn)F）：將小鼠單獨置于一個籠子中，下面放置托盤，收集1 h內(nèi)小鼠排出的糞便并稱質(zhì)量，記錄為大便濕質(zhì)量。隨后放入60 ℃烘箱中干燥24 h 后稱質(zhì)量，記錄為干質(zhì)量。糞便含水量按照《中華人民共和國藥典》水分測定烘干法測定，大便含水率=（大便濕質(zhì)量-大便干質(zhì)量）/大便濕質(zhì)量×100%。排便頻率是1 h 的糞便顆?？倲?shù)。③避水應(yīng)激實驗（Water avoid stress，WAS）：在約60 cm×60 cm×25 cm容器底部中央用磚塊搭建一個固體平臺（6 cm×3 cm×3 cm），盆內(nèi)裝入室溫水，液面高度距離固體平臺頂端1 cm 左右，將待測小鼠單獨置于平臺上；觀察記錄1 h內(nèi)，小鼠的排便顆粒數(shù)（干便）或者次數(shù)（稀便）?？瞻捉M放于同樣的平臺上，水盆內(nèi)不加水。

1.7 實時熒光定量PCR（RT-qPCR）法檢測緊密連接蛋白ZO-1、Occludin、E-cadherin，生物鐘基因CRY1，炎癥因子腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素6（IL-6），褪黑素合成酶Aanat、Asmt，褪黑素受體MT1、MT2 的mRNA 表達情況評價結(jié)束后次日，對小鼠進行頸椎脫臼處死，迅速留取小鼠的結(jié)腸組織，置于-80 ℃冰箱保存。取結(jié)腸組織加入Trizol裂解液充分研磨，提取總的RNA溶液。測濃度后，根據(jù)Evo M-MLV 反轉(zhuǎn)錄試劑預(yù)混液說明書配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)工作液進行RNA逆轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA。再按照SYBR?Green Pro Taq HS 預(yù)混型qPCR試劑盒說明書進行RT-qPCR 擴增實驗。本實驗以管家基因ACTB為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法計算目的基因的相對表達量。所有引物均由上海捷瑞生物工程有限公司設(shè)計與合成，引物序列見表1。

表1 RT-qPCR 引物序列Table 1 Primer sequences for RT-qPCR

1.8 免疫組化法檢測Aanat、褪黑素Melatonin、肥大細胞類胰蛋白酶Tryptase 的蛋白表達情況結(jié)腸樣本經(jīng)固定、脫水、修剪和石蠟包埋后，切成5 μm切片。切片經(jīng)脫蠟至水、抗原修復(fù)、阻斷內(nèi)源性過氧化物酶和血清封閉后，在4 ℃環(huán)境下孵育Aanat 抗體（1∶200）、Melatonin 抗體（1∶200）、Tryptase 抗體（1∶200 000）過夜。次日在室溫條件下孵育二抗和DAB 顯色后，再用蘇木精輕度復(fù)染，最后進行脫水，中性樹膠封片。

1.9 免疫熒光法檢測CRY1、p-IκBα、p65、p-p65的蛋白表達情況切片經(jīng)脫蠟至水、抗原修復(fù)、畫圈自發(fā)熒光淬滅和血清封閉后，在4 ℃條件下孵育CRY1（1∶1 000）、Phospho-IκBα 抗體（1∶500）、NF-κB p65 抗體（1∶1 600）和Phospho-NF-κB p65 抗體（1∶3 000）過夜。次日孵育二抗后，用DAPI避光室溫下復(fù)染細胞核，洗滌后用抗熒光淬滅封片劑封片。

1.10 蛋白免疫印跡（Western Blot，WB）法檢測IκBα、p-IκBα、p65、p-p65 的蛋白表達情況采用RIPA 法裂解小鼠結(jié)腸組織，提取總蛋白，加入蛋白上樣緩沖液，100 ℃變性10 min。取60 μg 樣品進行電泳，轉(zhuǎn)膜和封閉后，加入GAPDH（1∶10 000）、IκBα抗體（1∶1 000）、Phospho-IκBα抗體（1∶10 000）、NF-κB p65 抗體（1∶1 000）和Phospho-NF-κB p65 抗體（1∶1 000），4 ℃孵育過夜，次日加入二抗抗兔IgG HRP偶聯(lián)抗體（1∶1 000）室溫孵育1 h，最后加入化學(xué)發(fā)光液進行顯色。

1.11 統(tǒng)計學(xué)處理方法采用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件分析和處理數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，符合正態(tài)性分布且方差齊性的多組資料則進行單因素方差分析檢驗，組間多重比較運用LSD 檢驗。方差不齊時，采用Welch檢驗，組間多重比較則采用鄧尼特T3檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腸安菌泰對IBS-D 小鼠SP、FMC、FF 和WAS的影響如表2所示，與正常組比較，模型組小鼠SP明顯降低，F(xiàn)MC、FF 和WAS 明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組比較，腸安菌泰組小鼠SP升高，F(xiàn)MC、FF和WAS均明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。以上結(jié)果表明，腸安菌泰對IBS-D 小鼠的SP、FMC、FF和WAS 均有明顯的改善作用。

表2 腸安菌泰對IBS-D 小鼠SP、FMC、FF 和WAS 的影響（ ±s，n=6）Table 2 Effects of Chang’an Juntai on the SP，F(xiàn)MC，F(xiàn)F and WAS in IBS-D mice（ ±s，n=6）

表2 腸安菌泰對IBS-D 小鼠SP、FMC、FF 和WAS 的影響（ ±s，n=6）Table 2 Effects of Chang’an Juntai on the SP，F(xiàn)MC，F(xiàn)F and WAS in IBS-D mice（ ±s，n=6）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

WAS/（顆·h-1）12.000±4.195 19.833±3.545**13.833±3.430##16.500±2.665組別正常組模型組腸安菌泰組匹維溴銨組SP/%88.435±2.402 74.942±3.425**85.900±5.060##85.353±3.490##FMC/%45.912±2.568 69.420±2.497**50.195±5.114##50.404±7.231##FF/（顆·h-1）7.833±3.061 16.833±4.535**11.000±3.464#14.000±4.382

2.2 腸安菌泰對IBS-D 小鼠結(jié)腸組織緊密連接蛋白、炎癥因子、生物鐘基因和褪黑素相關(guān)指標的mRNA 表達的影響如圖1 所示，與正常組比較，模型組小鼠ZO-1、Occludin、E-cadherin、CRY1、Aanat、Asmt、MT1 和MT2 的mRNA 表達水平均明顯降低，炎癥因子TNF-α 和IL-6 的mRNA 表達水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組比較，腸安菌泰組小鼠ZO-1、Occludin、Ecadherin、 CRY1、 Aanat、 Asmt、 MT1 和MT2 的mRNA 表達水平均升高，TNF-α 和IL-6 的mRNA 表達水平均明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。由此可見，腸安菌泰可上調(diào)IBS-D小鼠結(jié)腸組織緊密連接蛋白、生物鐘基因和褪黑素相關(guān)指標的mRNA表達水平，下調(diào)IBS-D小鼠結(jié)腸組織炎癥因子的mRNA表達水平。

圖1 腸安菌泰對IBS-D 小鼠結(jié)腸組織緊密連接蛋白、炎癥因子、生物鐘基因和褪黑素相關(guān)指標的mRNA 表達的影響（ ±s，n=3）Figure 1 Effect of Chang’an Juntai on mRNA expressions of tight junction protein，inflammatory factors，biological clock gene and melatonin-related indicators in colonic tissue of IBS-D mice（ ±s，n=3）

2.3 腸安菌泰對IBS-D 小鼠結(jié)腸組織Aanat、Melatonin和Tryptase 蛋白表達的影響如圖2 所示，與正常組比較，模型組小鼠結(jié)腸組織Aanat和Melatonin蛋白表達的平均光密度值降低，Tryptase 的平均光密度值升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組比較，腸安菌泰組小鼠Aanat和Melatonin蛋白表達的平均光密度值明顯升高，Tryptase 的平均光密度值明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

圖2 腸安菌泰對IBS-D 小鼠結(jié)腸組織Aanat、Melatonin 和Tryptase 蛋白表達的影響（免疫組化，×400； ±s，n=3）Figure 2 Effect of Chang’an Juntai on the protein expressions of Aanat，Melatonin and Tryptase in the colonic tissue of IBS-D mice（ICH，×400； ±s，n=3）

2.4 腸安菌泰對IBS-D 小鼠結(jié)腸組織CRY1、p-IκBα、p65、p-p65 蛋白免疫熒光表達的影響如圖3 所示，與正常組比較，模型組小鼠結(jié)腸組織CRY1蛋白的相對熒光強度降低，p-IκBα 和p-p65 蛋白的相對熒光強度升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組比較，腸安菌泰組小鼠結(jié)腸組織CRY1蛋白相對熒光強度明顯升高，p-IκBα 和p-p65 蛋白相對熒光強度降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。各組小鼠結(jié)腸組織p65 蛋白的相對熒光強度變化不明顯，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。由此可見，腸安菌泰可上調(diào)CRY1的蛋白表達水平，抑制p-IκBα和p-p65蛋白的磷酸化。

圖3 腸安菌泰對IBS-D 小鼠生物鐘基因CRY1、p-IκBα、p65 及p-p65 蛋白表達的影響（免疫熒光，×200； ±s，n=3）Figure 3 Effect of Chang’an Juntai on the protein expressions of biological clock gene CRY1，p-IκBα，p65 and p-p65 in IBS-D mice（IF，×200； ±s，n=3）

2.5 腸安菌泰對IBS-D 小鼠IκBα、p-IκBα、p65和p-p65 蛋白免疫印跡表達的影響如圖4所示，與正常組比較，模型組小鼠p-IκBα 和p-p65 蛋白表達水平升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組比較，腸安菌泰組小鼠p-IκBα 和p-p65 蛋白表達水平降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。綜上，腸安菌泰可能通過抑制NF-κB 信號通路的激活發(fā)揮治療作用。

圖4 各組小鼠結(jié)腸組織中IκBα、p-IκBα、p65 和p-p65 蛋白的表達（ ±s，n=3）Figure 4 Bands of protein expressions of IκBα，p-IκBα，p65 and p-p65 in colonic tissues of various groups of mice（ ±s，n=3）

3 討論

腹瀉型腸易激綜合征（IBS-D）屬中醫(yī)“腹痛”“泄瀉”的范疇，其病機可總結(jié)為肝木疏泄不暢、脾土健運失司、脾腎之陽失于溫煦，最終導(dǎo)致該病由實轉(zhuǎn)虛，虛實夾雜。IBS-D 的臨床表現(xiàn)不僅局限于“腹痛”“腹瀉”等胃腸系統(tǒng)方面，許多患者還合并了腸外表現(xiàn)，如睡眠障礙、焦慮和抑郁等[22]。研究[23]證實，焦慮、抑郁等精神心理因素對IBS-D患者的臨床癥狀產(chǎn)生了一定的影響，而長期的睡眠障礙也會在一定程度上影響到患者的焦慮情緒。中醫(yī)理論認為，IBS-D伴有睡眠障礙問題，主要與患者自身的氣血循環(huán)不暢、相關(guān)的臟腑功能受損、機體的陰陽失調(diào)等因素有關(guān)。中醫(yī)治療強調(diào)“整體觀念”，重視各臟腑器官功能之間的相互聯(lián)系，認為人體自身的陰陽應(yīng)順應(yīng)天地陰陽的晝夜節(jié)律性的消長變化。IBS-D臨床癥狀反復(fù)發(fā)作，易導(dǎo)致患者氣血不和，十二正經(jīng)經(jīng)氣運行紊亂，故其治療應(yīng)重在調(diào)節(jié)人體自身之陰陽。

IBS-D 患者多合并一定程度的睡眠障礙[24]，這是IBS-D 患者的典型腸外表現(xiàn)[25]，也是造成IBS-D 患者晝夜節(jié)律紊亂的重要影響因素。IBS-D患者的臨床癥狀亦多受焦慮、抑郁等精神心理情志障礙的影響，長期的睡眠障礙在一定程度上影響到患者的焦慮情緒[26]。有研究[27]發(fā)現(xiàn)，在睡眠剝奪小鼠模型中，生物鐘基因CRY1的表達減少，會加重血管炎癥和內(nèi)皮功能障礙，而CRY1的過表達則可有效逆轉(zhuǎn)由睡眠剝奪引起的血管內(nèi)皮細胞炎癥。生物鐘基因CRY1的抗炎作用可能是通過抑制NF-κB信號通路實現(xiàn)的。CRY1可抑制腺苷酸環(huán)化酶活性并下調(diào)cAMP 水平，導(dǎo)致PKA 失活，進而阻斷p65 在S276 位點上的磷酸化，阻斷NF-κB 信號通路，減少其下游炎癥因子的產(chǎn)生[7]。

有臨床研究指出抑郁癥患者的IL-6、TNF-α 水平顯著高于非抑郁癥患者[28]；而在IBS-D 患者中，TNF-α 釋放水平與IBS-D 患者的焦慮癥狀呈現(xiàn)正相關(guān)[29]。本研究發(fā)現(xiàn)IBS-D小鼠腸緊密連接蛋白和生物鐘基因CRY1 表達減少，而IL-6 和TNF-α 表達增多。IBS-D患者發(fā)生腹痛、腹瀉和腸道功能障礙可能與患者的結(jié)腸黏膜存在低度炎癥、免疫激活和屏障功能受損相關(guān)[3]。IBS-D 表現(xiàn)出“低度炎癥”和“免疫激活”，引起炎癥-免疫細胞黏膜浸潤的增加，并釋放出多種生物活性物質(zhì)和炎癥介質(zhì)（如TNF-α、IL-6、Tryptase 等），增加結(jié)腸黏膜的通透性，最終破壞結(jié)腸黏膜屏障的完整性，從而引起IBS-D癥狀的發(fā)生[4]。

褪黑素合成酶和褪黑素受體的日常表達與生物鐘基因的表達呈現(xiàn)出同步的節(jié)律性振蕩[30]。已有相關(guān)報道[31]指出褪黑素可被研究作為治療IBS-D的藥物，但其療效及其中可能發(fā)生的具體機制尚不清楚。有研究[30，32]發(fā)現(xiàn)褪黑素可改善睡眠剝奪動物模型的腸道黏膜完整性，褪黑素的治療效益可能與加強腸道屏障，減少腔內(nèi)抗原與黏膜的接觸有關(guān)。NF-κB 信號通路是導(dǎo)致IBS-D的核心炎性通路，該通路通過調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的免疫信號途徑，調(diào)節(jié)多種炎性因子的表達，在IBS-D患者長期持續(xù)存在的腸黏膜低度炎癥的病理過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用[5]。

腸安菌泰由痛瀉要方、四君子湯、香連丸合方加減而成。痛瀉要方補脾瀉肝、祛濕止瀉，是治療腹痛、泄瀉的名方[33]；四君子湯益氣健脾，其類方加減可有效治療脾胃虛弱引起的睡眠障礙[34]；而香連丸清熱化濕、行氣止痛，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究多報道其抗炎效果顯著[35]。三者合方加減，具有疏肝止痛、健脾止瀉、調(diào)和陰陽之功，在改善患者腹痛、腹瀉等腸道癥狀，以及由肝氣郁結(jié)、情志不暢等引起的睡眠障礙等腸外癥狀方面具有很好的臨床效果，使患者達到“陰平陽秘”的平衡狀態(tài)。

課題組前期對腸安菌泰進行液相色譜質(zhì)譜分析，發(fā)現(xiàn)腸安菌泰的有效成分包括黃連堿、小檗堿、巴馬汀、木蘭花堿等9 種有效成分[20-21]。這些有效成分部分對腸上皮屏障能夠起到保護作用。其中，小檗堿能夠通過下調(diào)泛素修飾酶A20 的表達負性調(diào)控TNF-α/NF-κB/MLCK 通路，從而維護腸上皮緊密連接的完整性[18]。黃連堿與巴馬汀在結(jié)腸炎以及高脂血癥模型中也被報道出能夠改善腸屏障通透性，提高緊密連接蛋白的表達[36-37]。本研究發(fā)現(xiàn)腸安菌泰治療不僅能有效改善IBS-D小鼠發(fā)病情況和上調(diào)腸黏膜屏障緊密連接蛋白的表達，還能上調(diào)CRY1，同時下調(diào)IL-6 和TNF-α 的表達水平。此外，腸安菌泰治療還能促進褪黑素合成酶、褪黑素及受體表達，同時有效抑制NF-κB 信號通路的活化，起到降低腸道炎癥，保護腸黏膜屏障的作用。

綜上所述，腸安菌泰能調(diào)控生物鐘，并通過抑制NF-κB 信號通路保護IBS-D 小鼠的腸黏膜屏障。本實驗從生物鐘調(diào)控的角度出發(fā)，為腸安菌泰治療IBS-D的作用機制提供了一定的實驗研究基礎(chǔ)。由于中醫(yī)藥治療疾病具有多靶點，其治療作用背后更具體的機制仍需進一步深入研究。