基于TGF-β1/Smad2/3信號通路研究蓮心堿對高血壓小鼠腎間質(zhì)纖維化的保護作用

王美玲，陳達鑫，2，3，賈沛芝，趙春雨，許瑤瑤，姚 琳，林 珊，2，3*

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建 福州 350122；2.福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點實驗室，福建 福州 350122；3.福建省中西醫(yī)結(jié)合防治重大心血管慢病協(xié)同創(chuàng)新中心，福建 福州 350122）

高血壓病是一種常見的心腦血管疾病，而腎臟損害是高血壓重要的靶器官損害之一，高血壓已成為導(dǎo)致終末期腎病的第二大病因［1］。腎臟纖維化既是高血壓腎病的最終標志，又是慢性腎臟病進展為終末期腎臟病的最終病理歸途［2-4］，其發(fā)生、發(fā)展與腎素-血管緊張素系統(tǒng)（renin-angiotensin system，RAS）系統(tǒng)激活引起的血管緊張素Ⅱ（angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ）異常表達密切有關(guān)［5-6］。轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transform growth factor-β1，TGF-β1）是AngⅡ的重要下游因子［7］，Ang Ⅱ濃度的異常升高可刺激腎臟成纖維細胞合成和分泌TGF-β1［8］，后者可通過激活Smad 依賴途徑協(xié)同調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄及蛋白表達，誘導(dǎo)腎纖維化過程［9］。

蓮子心是睡蓮科睡蓮屬植物蓮Nelumbo nuciferaGaertn.成熟種子中間綠色去除子葉的胚［10］，性寒味苦，具有清心安神、交通心腎、澀精止血的作用。蓮子心主要活性成分包括生物堿類和黃酮類等成分［11-12］，蓮心堿是蓮子心的重要活性成分之一，具有降血壓、抗心律失常、抗脂質(zhì)氧等作用［13］。目前蓮心堿降低血壓和改善腎臟纖維化的機制研究尚不明確，因此本課題組基于TGF-β1/Smad2/3 信號通路探討蓮心堿對高血壓小鼠腎纖維化的作用機制，進一步研究蓮心堿治療高血壓減輕靶器官損害的作用機制，為蓮心堿的臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 6周齡健康C57BL/6雄性小鼠18只，體質(zhì)量25～30 g，購自上海斯萊克實驗動物責(zé)任有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2017-0005，置于福建中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心飼養(yǎng)。飼養(yǎng)環(huán)境溫度20.8～24.3 ℃，每日溫差＜4 ℃；相對濕度47.2%～67.2%，換氣15 次/h；12 h 光/暗交替；喂養(yǎng)正常飼料，自由飲水和飲食，每2～3 d 更換墊料。

1.2 實驗藥物 蓮心堿（C37H42N2O6，北京索萊寶科技有限公司，批號：SL8100），溶于生理鹽水，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3 實驗試劑 天狼星紅染色液、蘇木素染色液、Alzet 植入式膠囊滲透壓泵均購自北京索萊寶科技有限公司（貨號：G1472、G1080、alzet-2004）；TGFβ1、Smad2/3 均 購 自 美 國Abbkine 公 司（貨 號：ABP52598、ABP0158）；p-Smad2/3（美國CST公司，貨號：8828S）；可溶性膠原蛋白（Collagen）Ⅰ、CollagenⅢ和二抗均購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司（貨號：66761-1-lg、22734-1-AP、SA00001-2）；Ang Ⅱ（英國Abcam 公司，貨號：ab120183）。

1.4 實驗儀器 無創(chuàng)鼠尾血壓儀（美國Kent Scientific 公司）；病理切片機（德國Leika 公司）；石蠟包埋機、生物組織自動脫水機均購自湖北孝感亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司；垂直電泳槽、Chemi Doc XRS＋化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad 公司）；DM2700P偏振光顯微鏡（德國Leica 公司）。

2 實驗方法

2.1 分組和造模 18 只C57BL/6 雄性小鼠隨機分成對照組、模型組和蓮心堿組各6 只。對照組小鼠背部皮下植入含生理鹽水的滲透微型泵，模型組和蓮心堿組小鼠背部皮下植入含同等體積Ang Ⅱ溶液的滲透微型泵，并以500 ng/（kg·min）持續(xù)釋放28 d。該造模方式為國際公認的高血壓研究模型，埋泵后出現(xiàn)收縮壓（systolic blood pressure，SBP）＞120 mm Hg，提示建模成功。

2.2 干預(yù) 于造模后第2 天開始給藥，蓮心堿組按5 mg/（kg·d）腹腔注射150 μL 蓮心堿溶液，對照組、模型組腹腔注射等體積生理鹽水，均連續(xù)干預(yù)4周。

2.3 血壓測量 分別在造模前1 天和造模后第0、7、14、21、28 天檢測小鼠的尾動脈SBP、舒張壓（diastolic blood pressure，DBP）和平均動脈壓（mean arterial pressure，MAP）。將小鼠裝入小鼠固定器中，在距小鼠尾部約0.5 cm 的位置套上閉塞套，然后套入容積壓力傳感器，讓小鼠在黑暗環(huán)境下平息10 min后，開始進行血壓測量。每只小鼠至少測量20個循環(huán)，記錄小鼠的SBP、DBP 和MAP。

2.4 取材 末次給藥后，麻醉小鼠，打開腹腔，去除小鼠腎臟表面脂肪組織和被膜，快速剝離兩側(cè)腎臟組織。將小鼠的兩側(cè)腎臟置于標尺表方格中，于相同高度對3 組腎臟進行觀察拍照，對比3 組腎臟大小。將腎臟組織自腎門處作冠狀切面對半剖開，取左側(cè)腎臟組織的1/2 置于4%多聚甲醛固定24 h，常規(guī)脫水、石蠟包埋。

2.5 天狼星紅染色法觀察腎臟膠原纖維沉積情況 腎組織經(jīng)固定、包埋、切片以及脫蠟，滴加天狼星紅染色液后置于濕盒室溫孵育1 h。將腎組織玻片放入蘇木素溶液中浸泡1 min 后，置于PBS 溶液中洗凈，晾干，滴加中性樹膠封片，置于室溫晾干。使用偏振光顯微鏡進行觀察并采集圖像，觀察腎臟組織內(nèi)膠原纖維分布。

2.6 Western blot 檢測腎組織相關(guān)蛋白表達 提取腎臟組織蛋白，充分裂解后取上清，BCA 法檢測蛋白濃度。提取的蛋白經(jīng)變性、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，置 于TGF-β1（1∶1 000）、Smad2/3（1∶1 000）、p-Smad2/3（1∶1 000）、Collagen Ⅰ（1∶1 000）、CollagenⅢ（1∶1 000）一抗中4 ℃孵育過夜。TBST 清洗后置于二抗（1∶10 000）中室溫搖床孵育1 h。滴加顯影液曝光，運用ImageJ 軟件對目的條帶的灰度值進行相對表達量分析。

2.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 23.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料符合正態(tài)分布以（±s）表示，組內(nèi)不同時間點比較采用重復(fù)測量方差分析；多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 3 組造模后血壓指標比較 與對照組比較，模型組造模第7、14、21、28 天SBP、DBP 及MAP 均明顯提高（P＜0.05）；與模型組比較，蓮心堿組造模第14、21、28天SBP、DBP及MAP均明顯降低（P＜0.05）。見圖1。

圖1 3 組造模后血壓指標比較

3.2 3 組腎臟重量比較 與對照組比較，模型組腎臟重量明顯提高（P＜0.05）；與模型組比較，蓮心堿組腎臟重量明顯降低（P＜0.05）。見圖2、圖3。

圖2 3 組腎臟形態(tài)圖

圖3 3 組腎臟重量比較

3.3 3組腎臟組織膠原纖維沉積情況比較 對照組腎間質(zhì)中未見明顯膠原纖維沉積；模型組腎間質(zhì)可見大面積呈紅色或黃色的Ⅰ型膠原纖維，并伴有部分綠色Ⅲ型膠原纖維；蓮心堿組腎間質(zhì)纖維化程度較模型組明顯下降。見圖4。

3.4 3 組腎臟組織相關(guān)蛋白表達量比較 與對照組比較，模型組小鼠腎臟組織Collagen Ⅰ、CollagenⅢ、TGF-β1 蛋白表達量及p-Smad2/3 和Smad2/3比值均明顯提高（P均＜0.05）；與模型組比較，蓮心堿組腎臟組織Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、TGF-β1蛋白表達量及p-Smad2/3 和Smad2/3 比值均明顯降低（P均＜0.05）。見表1、圖5。

表1 3 組腎臟組織相關(guān)蛋白表達量比較（±s）

表1 3 組腎臟組織相關(guān)蛋白表達量比較（±s）

注：與對照組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05。

Collagen Ⅲ0.95±0.15 1.39±0.051）1.12±0.092）組別對照組模型組蓮心堿組n3 3 3 TGF-β1 0.99±0.03 1.32±0.121）1.10±0.072）p-Smad2/3和Smad2/3比值0.54±0.06 1.16±0.021）0.75±0.242）Collagen Ⅰ1.27±0.01 1.94±0.151）1.37±0.022）

圖5 3 組腎臟組織相關(guān)蛋白條帶圖

4 討 論

腎臟作為調(diào)節(jié)血壓的重要器官，同時也是高血壓所致?lián)p害的靶器官。高血壓病不僅會累及腎小球，持續(xù)性的高血壓還會損傷腎小管細胞，導(dǎo)致腎小管間質(zhì)纖維化［14］。TGF-β1/Smads 信號通路在腎纖維化中起著至關(guān)重要的作用，是腎纖維化最主要和最經(jīng)典的信號通路之一［15］。當血壓持續(xù)升高時，Ang Ⅱ釋放增多，可直接調(diào)控TGF-β1 基因轉(zhuǎn)錄，也可以通過其他通路間接引起TGF-β1 轉(zhuǎn)錄、釋放增多［16］。TGF-β1 是促進腎纖維化的重要細胞因子之一［17］，其通過Smad 蛋白家族的磷酸化和激活下游相關(guān)基因如Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ來誘導(dǎo)腎成纖維細胞分化［18］。因此，抑制TGF-β1 及其下游基因的活性可能會減少腎成纖維細胞的形成和過度聚集，從而有效緩解腎損傷中的纖維化病變［19］。

近年研究發(fā)現(xiàn)，蓮心堿用于治療高血壓，具有明顯的抗炎、抗氧化作用，并能有效減輕腎臟損傷［20-23］。研究結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組小鼠收縮壓、舒張壓及平均動脈壓等血壓指標均明顯提高，小鼠重量明顯升高，腎臟組織經(jīng)天狼星紅染色后可見膠原纖維沉積，腎臟組織Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、TGF-β1蛋白表達量及p-Smad2/3和Smad2/3比值均明顯提高。經(jīng)蓮心堿干預(yù)后小鼠血壓指標明顯降低，腎臟重量明顯下降，腎臟組織膠原纖維沉積明顯下降，腎臟組織Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、TGF-β1 蛋白表達量及p-Smad2/3 和Smad2/3 比值均明顯降低。可見，高血壓能夠引起腎臟組織腎臟腫大及腎間質(zhì)纖維化，而蓮心堿能夠有效改善腎臟損傷，減少腎組織膠原沉積，且與TGF-β1/Smad2/3信號通路密切相關(guān)。

綜上，蓮心堿可有效抑制高血壓所致的腎臟腫大及腎組織膠原纖維沉積，其改善腎損傷的作用機制可能與TGF-β1/Smad2/3 信號通路發(fā)揮作用有關(guān)。