HtrA1 在潰瘍性結(jié)腸炎患者腸黏膜和外周血中的表達及臨床意義

陳智成，蘇麗婷，李義諾

（1.武警河南省總隊醫(yī)院消化內(nèi)科，河南 鄭州 450052；2.河南省第三人民醫(yī)院綜合內(nèi)科，河南 鄭州 450052）

潰瘍性結(jié)腸炎(UC)是炎癥性腸病的主要類型，其特征是反復(fù)發(fā)作的慢性非特異性胃腸道炎癥[1]。研究發(fā)現(xiàn)血小板炎癥反應(yīng)參與了UC 的病理生理過程[2-3]，UC 患者具有顯著的血小板活化，可能需要高溫需求絲氨酸蛋白酶A（High temperature requirementprotein A，HtrA）活化，然后分泌炎癥因子IL-1β，參與炎癥過程。HtrA1 是一種熱誘導(dǎo)基因，對于細菌在高溫下的生存必不可少，HtrA1 可以在高溫下降解周質(zhì)中錯誤折疊的蛋白質(zhì)[4]。HtrA1 參與了多種炎癥性疾病，如自身免疫性疾病、感染和敗血癥。在硫酸葡聚糖誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠模型中，HtrA 表達在第5 天增加并在2 周內(nèi)保持在高水平[5-6]。與野生型小鼠相比，表達HtrA1 過表達突變體的轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)出STAT3 的磷酸化增加，且遭受的結(jié)腸炎更嚴重。在2,4,6-三硝基苯磺酸誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠模型中，HtrA1 在腸粘膜淋巴細胞中高表達，HtrA1 低表達小鼠隨著年齡的增長而自發(fā)發(fā)展為結(jié)腸炎[7-8]。本研究旨在研究HtrA1 在UC 患者腸黏膜和外周血中的表達及臨床意義，為UC 的診斷及治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2018 年1 月至2020 年12 月武警河南總隊醫(yī)院收治的潰瘍性結(jié)腸炎患者130例為病例組，所有病例組的病理診斷由本院病理學家確診。病例組全結(jié)腸病變33 例，左側(cè)結(jié)腸病變68 例，乙狀結(jié)腸病變15 例，直腸病變病14 例。依據(jù)改良的Mayo 評分系統(tǒng)對疾病進行分期：活動期輕度（排便次數(shù)＜4 次/d，無明顯臨床癥狀，ESR低于20 mm·h-1）45 例，活動期重度（腹瀉次數(shù)≥6次/d，明顯血便，體溫高于37.8℃、脈搏＞90 次/min，Hb 小于75%正常值，ESR 大于30 mm·min-1）25例，活動度中度（上述癥狀或體征介于輕度和重度之間）60 例。依據(jù)預(yù)后情況分為預(yù)后良好組（黏膜愈良好、無復(fù)發(fā)、無并發(fā)癥）（101 例），預(yù)后不良組（黏膜愈合欠佳、復(fù)發(fā)、合并并發(fā)癥或接受結(jié)腸切除術(shù)治療）（29 例）。納入標準：（1）年齡≥18 歲；（2）符合 《炎癥性腸病診斷與治療的共識意見(2012，廣州)》以及的《中國炎癥性腸病標準診治共識分析》；（3）患者與家屬知情同意。排除標準：（1）腸結(jié)核；（2）癌癥史；（3）妊娠期婦女。選擇同期非潰瘍性結(jié)腸炎患者（結(jié)腸鏡檢查正常結(jié)腸組織）130 例為對照組。

1.2 方法

1.2.1 腸黏膜和外周血中HtrA1 mRNA 測定 常規(guī)獲取血清；組織樣本在結(jié)腸鏡檢查或手術(shù)時獲得，對直腸乙狀結(jié)腸（肛門近端10～20 cm）進行活檢。在結(jié)腸鏡檢查時獲得的組織用鑷子收集，并立即置于RNAlater 或快速冷凍中。手術(shù)樣本由人體組織研究中心通過在結(jié)腸切除術(shù)后不久對粘膜進行剝離并置于RNAlater 或快速冷凍中獲得。在4℃下2 至4 周后，去除多余的RNAlater，并將組織儲存在-80℃。使用帶有無RNAase 珠子的BulletBlender（NextAdvance，AverillPark，NewYork）將組織勻漿，并使用QiagenAllprepDNA/RNA/miRNA 提取試劑盒（Hilden，德國）提取總RNA。使用Agilent2100 生物分析儀測量RNA 完整性。分析中使用的所有樣品的RNA 完整性值為0.6。對于HtrA1 mRNA PCR，使用通用cDNA 合成試劑盒(Exiqon)從250 ng 總RNA 制備cDNA。HtrA1、GAPDH 的引物由Exiqon 設(shè)計和合成。使用ExiLENTSYBRGreenmastermix (Exiqon) 使用Roche Light Cycler480(Roche Indianapolis IN)進行定量實時逆轉(zhuǎn)錄PCR。HtrA1、GAPDH 序列如下：HtrA1(F:TCGTCGATGCTAGTCGATCGATCGTAGCTAGCTAGCTGATCGATCGTAGCTAGC，R:TTGCGATCGATGCTAGCTAGCTAGTCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATGC)，GAPDH (F:TCGAGCGATCGTACGTAGCTAGCTGACTGATCGATCGTAGCTAGCTAGC，R:TGTCGTAGCTAGTCGATCGTAGCTAGCTAGTCGATCGTAGCTAGCTAGCTAGCTAGTC)。使用2-DDCt方法進行HtrA1 水平定量。

1.2.2 AST、ALT、TBIL、ALB、ESR、PT、PTA 指標測定 貝克曼AU-680 全自動生化分析儀（美國庫爾特公司）以及CA-7000 全自動凝血分析儀（希森美康）測定白蛋白（Albumin，ALB）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（Alanine aminotransferase，ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（Aspartateamino transferase，AST）、總膽紅素（Total bilirubin，TBil）、總膽固醇（Total cholesterol，TC）、甘油三脂（Triglyceride，TG）、凝血酶原時間（Prothrombintime，PT）、凝血酶原活動度（Prothrombin activityprothrombin time activity，PTA）；血沉（Erythrocyte sedimentation rate，ESR）。

1.3 統(tǒng)計分析 采用SPSS 25.0 對數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差表示，采用t 檢驗或單因素方差分析比較，相關(guān)分析采用Pearson 分析，多因素Logistic 回歸分析探討潰瘍性結(jié)腸炎預(yù)后的相關(guān)因素，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 對照組、病例組一般臨床資料比較 表1 可見，與對照組比較，病例組ALB、TBIL、PT、PTA、MELD 水平升高（P＜0.05）；而兩組性別、年齡、ALT、AST、TC、TG 等比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表1 對照組、病例組一般臨床資料情況比較

2.2 對照組、病例組腸黏膜、外周血HtrA1 表達水平比較 表2 可見，與對照組比較，病例組腸黏膜、外周血HtrA1mRNA 表達水平升高（P＜0.05）。

表2 對照組、病例組腸黏膜、外周血HtrA1 表達水平比較

2.3 輕度組、中度組、重度組腸黏膜、外周血HtrA1表達水平比較 表3 可見，與輕度組比較，中度組、重度組腸黏膜、外周血HtrA1 表達水平升高，隨著潰瘍性結(jié)腸炎患者病情嚴重程度的增加，腸黏膜、外周血HtrA1 表達水平逐漸升高（P<0.05）。

2.4 不同預(yù)后組HtrA1 表達水平比較 表4 可見，與預(yù)后良好組比較，預(yù)后不良組腸黏膜、外周血HtrA1 表達水平升高（P<0.05）。

表4 不同預(yù)后組HtrA1 表達水平比較

2.5 HtrA1 與各指標的相關(guān)性分析 表5 可見，腸黏膜、外周血HtrA1 mRNA 與TBIL、PT、PTA 正相關(guān)，與PTA、ALB、ESR 負相關(guān)（P<0.05）。

表5 HtrA1 與各指標的相關(guān)性分析

2.6 潰瘍性結(jié)腸炎患者預(yù)后多因素Logistic 回歸分析 表6 可見，以潰瘍性結(jié)腸炎預(yù)后為應(yīng)變量（預(yù)后不良=1，預(yù)后良好=0），單因素分析有意義的因素為自變量進行多因素Logistic 逐步回歸分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高水平腸黏膜HtrA1 mRNA、外周HtrA1 mRNA 均為潰瘍性結(jié)腸炎預(yù)后的危險因素（P<0.05）。

表6 潰瘍性結(jié)腸炎患者預(yù)后多因素Logistic 回歸分析

3 討論

UC 的病因和發(fā)病機制非常復(fù)雜，由環(huán)境、免疫和遺傳等多種因素引起的黏膜免疫系統(tǒng)異常引起的炎癥過程在UC 的發(fā)病中發(fā)揮著重要作用。近年來，UC 的發(fā)病率呈上升趨勢，重癥患者的報告病例也較多。臨床研究表明，UC 是一種慢性炎癥性腸病,其特征是黏膜免疫反應(yīng)失調(diào)，微血管炎癥引起的腸道多灶性梗死已成為UC 發(fā)病的重要機制。持續(xù)的高凝狀態(tài)可能與UC 的臨床進展有關(guān)并具有促進炎癥發(fā)生發(fā)展的作用。本研究通過檢測UC 組織中分子生物標志物HtrA1 的表達，為闡明UC 的發(fā)病機制提供進一步的信息。

HtrA1 是一種具有236 個氨基酸的蛋白質(zhì)，包含一個胞外域、一個跨膜域和一個胞質(zhì)域。細胞外結(jié)構(gòu)域?qū)τ谂cFVII 的結(jié)合和外源性凝血途徑的啟動至關(guān)重要，并且具有促凝血活性和蛋白水解功能[9-10]。胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域末端3 個絲氨酸殘基的磷酸化可介導(dǎo)細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo),促進血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的轉(zhuǎn)錄和合成[13]。HtrA1 引發(fā)的凝血過程是通過外源性凝血途徑，這是凝血的啟動階段，HtrA1 在生理止血和病理性血栓形成中具有重要意義，并參與炎癥反應(yīng)?？缒そY(jié)構(gòu)域也可能在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮作用，但胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的功能是近年來HtrA1 研究的熱點[11-12]。在人肺成纖維細胞中，HtrA1依賴的VEGF 表達需要FVII 與HtrA 結(jié)合，而FVII 與失活的活性位點和HtrA1 結(jié)合可抑制VEGF 的產(chǎn)生，VEGF 參與了UC 的發(fā)病機制,并與疾病的嚴重程度有關(guān)[14]。HtrA1 與其受體FVIIa 結(jié)合觸發(fā)細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制并誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的上調(diào)，其參與組織修復(fù)并且在炎癥性疾病中具有非常重要的意義[15]。大量研究證實，MMPs 參與UC 患者的基底炎癥組織修復(fù)、血管生成和白細胞趨化,且MMPs 在UC 組織中高表達，并隨著炎癥的加重而增強。本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，病例組腸黏膜、外周血HtrA1 mRNA 表達降低（P<0.05）。隨著潰瘍性結(jié)腸炎患者病情嚴重程度的增加，腸黏膜、外周血HtrA1 表達逐漸降低（P<0.05）。這表明UC 組織和正常結(jié)腸組織之間HtrA1 的表達水平不同，提示HtrA1 可能與UC 的發(fā)生有關(guān)，高凝狀態(tài)和腸道微血栓形成可能介導(dǎo)了HtrA 在UC 中的作用。

近期研究發(fā)現(xiàn)，HtrA1 主要由TH2 細胞表達，HtrA1 負向調(diào)節(jié)IL-12 到STAT4Th1 通路，是介導(dǎo)TH2 反應(yīng)所必需的。HtrA1 表達與哮喘和特應(yīng)性皮炎、眾所周知的TH2 型疾病的病理以及過敏人類患者血清IgE 水平之間的強相關(guān)性；HtrA1 轉(zhuǎn)基因小鼠在氣道高反應(yīng)模型系統(tǒng)中增加了TH2 反應(yīng)。因此，HtrA1 在調(diào)節(jié)TH2 介導(dǎo)的免疫疾病的發(fā)生和維持中具有重要作用[16]。最近有報道通過腺病毒HtrA1 基因轉(zhuǎn)移在肺中過表達HtrA1 增強了IgG免疫復(fù)合物誘導(dǎo)的肺損傷。因此，在有炎癥的粘膜中高水平表達的HtrA1 可能在UC 中具有病理作用[17-18]。此外，腸黏膜、外周血HtrA1 mRNA 與TBIL、PT、PTA 正相關(guān)，與PTA、ALB、ESR 負相關(guān)（P<0.05）。這說明HtrA1 作為間接炎癥介質(zhì)刺激其他炎癥介質(zhì)釋放并誘發(fā)炎癥反應(yīng)，可能參與了這一過程，表明HtrA1 與UC 疾病炎癥特征相關(guān)。在小鼠模型中，HtrA1 mRNA 主要在DSS 處理的結(jié)腸炎的增生上皮細胞和固有層單核細胞中表達，同時，HtrA1 蛋白增加并主要定位于固有層淋巴細胞，在結(jié)腸炎小鼠模型的隱窩上皮細胞中表達水平較高。本實驗研究數(shù)據(jù)顯示，HtrA1 mRNA 的表達與組織學炎癥的程度密切相關(guān)。因此，炎性固有層免疫細胞的積累可能是HtrA1 mRNA 增加的主要來源之一。HtrA 表達與UC 嚴重程度之間的相關(guān)性提出了一種可能性，即患者中HtrA1 高表達可能歸因于TH2 細胞在固有層中的積累，導(dǎo)致粘膜炎癥的惡化，這需要進一步研究HtrA1 在細胞中的定位。

此外，本研究也發(fā)現(xiàn)，預(yù)后不良組腸黏膜、外周血中HtrA1 表達水平升高（P<0.05）；高水平腸黏膜HtrA1 mRNA、外周HtrA1 mRNA 均為潰瘍性結(jié)腸炎預(yù)后的危險因素（P<0.05），這說明HtrA1 是影響UC 預(yù)后的因素。

綜上所述，HtrA1 在潰瘍性結(jié)腸炎患者腸黏膜和外周血中的表達升高，HtrA1 是影響UC 病情及預(yù)后不良的影響因素之一。