基因檢測及骨髓切片活檢與血清TK1 在骨髓增生異常綜合征與溶血性貧血鑒別診斷中的研究

盧金金，曹天星

（河南省中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院河南省中醫(yī)院，河南 鄭州 450002）

MDS 是一種血液系統(tǒng)惡性疾病，與造血干細(xì)胞惡性克隆有關(guān)，多表現(xiàn)為造血障礙或衰竭、血細(xì)胞減少等[1-3]，臨床證實MDS 與白血病相關(guān)，約三成MDS 患者易進展至急性髓系白血病[4-5]。MDS 在老年群體中多發(fā)，其病因復(fù)雜尚未明確，可能與長期接觸強電磁場、輻射或有機溶劑有關(guān)[6-7]，目前臨床診斷MDS 的方式主要為骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)及核型檢測[8-9]。MDS 臨床征象表現(xiàn)為貧血，但與HA、巨幼細(xì)胞貧血（Megaloblastic anemia，MA）、再生障礙性貧血（Aplastic anemia，AA）等形態(tài)學(xué)相似，HA 是由紅細(xì)胞存活率下降且滅亡速度超過骨髓代償而導(dǎo)致的貧血，是一種血液系統(tǒng)良性疾病[10-11]，在臨床上與低原始細(xì)胞MDS 核型表現(xiàn)相似，故難以鑒別，給臨床診斷帶來困難。為了讓患者早診斷、早治療、預(yù)后佳，對MDS 及HA 進行準(zhǔn)確鑒定至關(guān)重要[12-13]。血清TK1 是細(xì)胞質(zhì)中與細(xì)胞增殖相關(guān)的一種關(guān)鍵酶，其表達量與細(xì)胞增殖特性相關(guān)，其濃度上升預(yù)示著腫瘤細(xì)胞的增多[14-15]。目前，通過血清TK1 診斷MDS 與HA 的文章稀缺，使用ROC 曲線對其診斷價值做出分析的文章尚無，故本研究通過探究基因檢測、骨髓活檢切片及血清TK1 在MDS 與HA 患者中的診斷價值，為其臨床診斷及治療提供科學(xué)依據(jù)，現(xiàn)將研究結(jié)果報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 將本院2016 年1 月至2020 年12月收治的63 例MDS 患者與57 例HA 患者作為研究對象，回顧性分析其臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：

（1）MDS、HA 的診斷標(biāo)準(zhǔn)均符合2008 年WHO 分類標(biāo)準(zhǔn)；（2）均經(jīng)病理確診為MDS 或HA患者；（3）臨床資料完整；（4）貧血患者檢查前未服用影響造血功能藥物或行輸血。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并認(rèn)知異常、精神疾病；（2）合并其他惡性腫瘤；（3）合并妊娠、哺乳期婦女；（4）合并感染疾??；（5）合并重要臟器功能異常。

1.2 方法 收集所有患者性別、年齡、血紅蛋白、血小板計數(shù)等一般臨床資料。

骨髓活檢切片檢查：骨髓活檢針（B65-01 型）進行局部麻醉后行骨髓穿刺術(shù)，取長度≥0.3 cm骨髓標(biāo)本，脫水包埋處理后切片3 μm 厚，染色后鏡下觀察樣本中是否存在幼紅細(xì)胞簇異常分布、幼稚前體細(xì)胞異常定位（Nomallocalization of immature precursors，ALIP）、單圓核及多圓核病態(tài)巨核細(xì)胞情況。

基因檢測：取2～3 mL 的骨髓標(biāo)本，通過乙二胺四乙酸進行抗凝處理，依據(jù)2：1 比例加入Tizol提取mRNA 后逆轉(zhuǎn)錄cDNA，采用熒光定量PCR檢測患者基因突變、融合、數(shù)量異常增多情況。MDS組與HA 組涉及的經(jīng)典基因異常主要為N-RAS 基因、FMS 樣的酪氨酸激酶3（Fms-like tyrosine kinase 3，F(xiàn)LT3）、急性粒細(xì)胞性白血病1 基因（Acute Myeloid Leukemia 1 Gene，AML1）、逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合位點-1（Cotropicvirusintegrationsite 1，EVI-1）、TEL 基因（ETV6 基因）、混合譜系白血病(Mixed lineage leukemia，MLL)基因、人體抑癌基因p53、干擾素調(diào)節(jié)因子1(Interferon regulatory factor-1，IRF-1)基因突變、融合或異常表達等。

采集所有患者清晨空腹肘靜脈血3 mL，采用3 500 r/min 離心10 min 后分離上層血清，將其放置在-70℃冰箱內(nèi)保存待測。采用酶免疫點印跡化學(xué)發(fā)光法檢測所有患者血清TK1 水平（檢測結(jié)果如圖1-4），儀器為LAS4000 型化學(xué)發(fā)光成像分析儀，試劑盒購自上海語純生物科技有限公司，所有操作過程按照說明書由同一組檢驗人員嚴(yán)格執(zhí)行。

圖1 TK1 染色陰性

圖2 TK1 染色弱陽性

圖3 TK1 染色陽性

圖4 TK1 染色強陽性

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料用n（%）表示，進行χ2檢驗；符合正態(tài)分布的計量資料用（）表示，行t 檢驗，采用ROC 曲線分析血清TK1 對區(qū)分MDS 與HA 的診斷價值，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者一般臨床特征資料比較 MDS 組與HA 組患者性別、年齡、血紅蛋白差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），MDS 組患者血小板計數(shù)顯著低于B組，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 兩組患者一般臨床特征資料比較結(jié)果

2.2 兩組患者基因檢測分析比較 MDS 組患者基因異常30 例（47.62%），HA 組患者基因異常0 例（0.00%），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=36.190，P=0.000＜0.05）。

2.3 兩組患者骨髓活檢切片特征比較 MDS 患者骨髓活檢分析結(jié)果顯示，出現(xiàn)32 例幼紅細(xì)胞簇異常分布、44 例ALIP 與34 例單圓核與多圓核病態(tài)巨核細(xì)胞，HA 組出現(xiàn)29 例幼紅細(xì)胞簇異常分布與5 例ALIP，未發(fā)現(xiàn)單圓核與多圓核病態(tài)巨核細(xì)胞；兩組患者ALIP 與單圓核與多圓核病態(tài)巨核細(xì)胞的組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表2。

表2 兩組患者骨髓活檢切片特征比較結(jié)果

2.4 兩組患者血清TK1 水平比較 MDS 組血清TK1 水平顯著高于HA 組，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表3。

表3 兩組患者血清TK1 水平比較結(jié)果

2.5 血清TK1 對區(qū)分MDS 與HA 的診斷價值分析ROC 曲線分析顯示，血清TK1 區(qū)分MDS 與HA診斷的AUC 為0.936，敏感度為93.7%，特異度為93.0%，數(shù)據(jù)結(jié)果均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表4、圖5。

表4 血清TK1 對區(qū)分MDS 與HA 的診斷價值分析結(jié)果

圖5 血清TK1 對診斷MDS 與HA 的ROC 曲線

3 討論

MDS 患者存在白血病的征兆，已成為危害患者生命健康的惡性疾病，大量患者在MDS 病發(fā)后進展至急性髓系白血病[16-18]，且部分患者因誤診、錯診等因素導(dǎo)致錯過最佳的對癥治療機會，預(yù)后情況較差[19]。MDS 與HA 臨床表現(xiàn)缺乏特異性，兩類患者均存在貧血、乏力情況，常規(guī)使用藥物治療并不能達到理想的治療效果，且對于部分骨髓中原始細(xì)胞低的患者來說，增加了診斷的難度[20-21]。本研究通過分析基因檢測、骨髓活檢切片與血清TK1 在診斷MDS 與HA 患者中的區(qū)別，旨在為兩類患者的鑒別提供有效參考和依據(jù)，為患者治療及預(yù)后保駕護航。

本研究顯示兩組患者一般資料中血小板計數(shù)的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），且MDS 患者比HA患者血小板計數(shù)顯著要低，這是由于MDS 患者的臨床表現(xiàn)多為貧血癥狀，或為外周血三系中的任意系減少、異常，故部分MDS 患者血小板會顯著降低，HA 患者的臨床表現(xiàn)亦為貧血，或外周血三系減少，但血小板計數(shù)的降低并不是它主要特點，故MDS 患者血小板計數(shù)低于HA 患者，但單純血小板這一數(shù)據(jù)的檢測結(jié)果，并不能作為診斷患者具體病情的科學(xué)指標(biāo)。本研究中MDS 患者基因異常檢出率為47.62%，而HA 患者基因異常檢出率為0.00%，表面MDS 患者基因異常情況較HA 多，基因異常在臨床中多與惡性細(xì)胞繁殖、分化或惡性疾病進展、預(yù)后密切相關(guān)，故基因檢測能夠作為鑒別MDS 與HA 的有效輔助手段，能夠一定程度上提升MDS 患者的檢出概率。在MDS 患者診斷中，骨髓活檢切片能夠體現(xiàn)病態(tài)細(xì)胞分布異常情況與原始細(xì)胞在骨髓小梁旁呈現(xiàn)的簇狀定位[22]，本研究結(jié)果顯示MDS 患者骨髓活檢切片中出現(xiàn)ALIP、單圓核與多圓核病態(tài)巨核細(xì)胞的概率顯著高于HA 患者，但兩組患者幼紅細(xì)胞簇異常分布情況差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），由此表明MDS 患者采取該種方式對MDS 粒系、巨核系病態(tài)的檢出率較高，能夠作為臨床輔助診斷的有效方式。TK1 是胸苷激酶（Thymidine kinase，TK）的一種，主要在機體增殖細(xì)胞中表現(xiàn)，存在于脾臟、骨髓等組織中，通過細(xì)胞質(zhì)進行表達，且與DNA 的作用機制相關(guān)。本研究中MDS 患者的血清TK1 表達量顯著高于HA 患者，且TK1 對診斷MDS 與HA 的敏感度較高，預(yù)示著能夠?qū)⒀錞K1 作為鑒別診斷MDS的有效標(biāo)志物，究其原因在于，隨著腫瘤中DNA的大量合成，腫瘤細(xì)胞增殖與分化的速度加快，TK1 表達量突增[23-24]。MDS 是一種造血干細(xì)胞惡性多克隆性疾病，該類患者骨髓及其余造血組織細(xì)胞異常，故TK1 在該類患者機體內(nèi)水平較高，能夠?qū)⑵渥鳛榧?xì)胞異常增殖動力學(xué)標(biāo)志物，為臨床治療提供參考依據(jù)。

綜上所述，MDS 患者基因檢測中基因異常及骨髓活檢切片檢查中出現(xiàn)ALIP 和單圓核與多圓核病態(tài)巨核細(xì)胞的概率均高于HA 患者，且MDS患者血清TK1 表達量高于HA 患者，故基因檢測、骨髓活檢切片及血清TK1 均能作為輔助診斷區(qū)分MDS 與HA 的可靠指標(biāo)，值得臨床參考借鑒。但本研究存在一定的不足，例如樣本數(shù)量有限，在今后的研究中將會進一步擴大樣本容量，使研究結(jié)果更具有說服力。