基于生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)分析FOXM1 在肝癌中的表達(dá)及其臨床預(yù)后意義

蘇永發(fā)，陳金圖

（福建醫(yī)科大學(xué)附屬泉州第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，福建 泉州 362000）

肝癌是全球常見(jiàn)的惡性實(shí)體腫瘤之一，在我國(guó)存在高發(fā)病率和致死率[1-2]。肝癌起病隱匿，術(shù)后總體預(yù)后差[3-4]。其發(fā)生發(fā)展機(jī)制十分復(fù)雜,至今仍未明確,因此探索新的、有價(jià)值的腫瘤標(biāo)志物對(duì)肝癌的診療及預(yù)后具有重要意義。

FOXM1 是屬于Fox 家族的一種轉(zhuǎn)錄因子亞型，其表達(dá)及轉(zhuǎn)錄依賴于細(xì)胞周期分化過(guò)程[5]。FOXM1 能夠調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞一系列病理活動(dòng)，包括增殖，侵襲及轉(zhuǎn)移，因此FOXM1 的表達(dá)水平將為腫瘤的診斷和預(yù)后提供重要的指標(biāo)[6-7]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)FOXM1 在癌癥，如宮頸癌[8]、乳腺癌[9]、卵巢癌[10-12]、膀胱癌[13-14]等中異常高表達(dá)，逐漸成為腫瘤研究的熱點(diǎn)，然而關(guān)于FOXM1 在肝細(xì)胞癌的研究較少。本研究主要采用生物信息的方法，挖掘分析Oncomine、GEPIA 和HPA 公共數(shù)據(jù)庫(kù)中FOXM1在肝癌中的表達(dá)情況及其潛在的臨床預(yù)后意義。另外，最近的大量實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，靶向的FOXM1抑制劑具有有效的抗癌作用，表明FOXM1 將有機(jī)會(huì)為抗癌藥物開(kāi)發(fā)和腫瘤治療提供潛在的新靶標(biāo)[15]。

1 資料與方法

1.1 Oncomine 數(shù)據(jù)庫(kù)的在線分析 Oncomine 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.oncomine.org/）是采用基因芯片技術(shù)建立的腫瘤數(shù)據(jù)庫(kù)[16]，其中一項(xiàng)重要功能就是進(jìn)行腫瘤和正常組織的基因差異表達(dá)分析。本研究預(yù)設(shè)的檢索條件如下：（1）目的基因: FOXM1；（2）分析類別：癌癥組vs 正常組；（3）腫瘤類型：肝癌；（4）數(shù)據(jù)類型: mRNA；（5）樣本類型：臨床標(biāo)本；（6）數(shù)據(jù)集篩選標(biāo)準(zhǔn)：P ＜0.0001，fold change 2，gene rank=Top 10%。將所有結(jié)果匯總進(jìn)行綜合比較分析。

1.2 GEPIA 數(shù)據(jù)庫(kù)的在線分析 GEPIA 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://gepia.cancer-pku.cn/）是一個(gè)可用于整合分析癌癥表達(dá)譜數(shù)據(jù)的交互式分析網(wǎng)站[17]。本研究預(yù)設(shè)的檢索條件如下：（1）“Expression DIY” 模塊：Boxplot 中選擇FOXM1 及Match TCGA normal data and GTEx data；Stage plot 中選擇FOXM1、“Yes”Log Scale（2）“Survival”模塊：Survival Plots 中選擇FOXM1、Overall Survival 或Disease Free Survival；（3）“Correlation”模塊：選擇FOXM1 分別與MLH1、MSH2、MSH3、MSH4、MSH5 和MSH6 等DNA 修復(fù)基因及PIK3CA、AKT1、mTOR、HIF1A 和VEGFA等PI3K/AKT 信號(hào)通路關(guān)鍵分子進(jìn)行相關(guān)性分析。

1.3 HPA 數(shù)據(jù)庫(kù)分析FOXM1 蛋白表達(dá)差異 HPA在線網(wǎng)站（https://www.proteinatlas.org/）是一個(gè)利用各種組學(xué)和技術(shù)整合人體不同組織和器官的蛋白質(zhì)表達(dá)圖譜的網(wǎng)站[18]。本研究主要利用該網(wǎng)站分析FOXM1 在肝癌及肝正常組織的免疫組織化學(xué)染色情況及差異表達(dá)信息。

1.4 WB 進(jìn)行相關(guān)蛋白驗(yàn)證 采用Western blot 檢測(cè)FOXM1 過(guò)表達(dá)HepG2 細(xì)胞株錯(cuò)配修復(fù)基因及PI3K/AKT 信號(hào)通路關(guān)鍵分子蛋白表達(dá)水平，進(jìn)一步驗(yàn)證生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用t 檢驗(yàn)分析肝癌組與正常組中FOXM1 基因表達(dá)差異，采用單因素方差分析方法進(jìn)行不同臨床階段之間FOXM1 基因表達(dá)的比較，采用皮爾森統(tǒng)計(jì)方法對(duì)相關(guān)性進(jìn)行分析，繪制Kaplan-Meier 曲線進(jìn)行預(yù)后分析，P＜0.001 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同腫瘤類型FOXM1 基因的表達(dá)情況 Oncomine 數(shù)據(jù)庫(kù)中共提供455 項(xiàng)FOXM1 基因在不同類型腫瘤的數(shù)據(jù)集。其中FOXM1 表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的研究結(jié)果共有78 個(gè)，F(xiàn)OXM1 表達(dá)增高的研究有75 個(gè)，降低的僅有3 個(gè)。在常見(jiàn)的惡性腫瘤中，F(xiàn)OXM1 在肺癌的研究結(jié)果中高表達(dá)有11個(gè)，在乳腺癌和淋巴瘤的研究高表達(dá)各有8 個(gè)，結(jié)直腸癌的研究中高表達(dá)有6 個(gè)，在子宮頸癌的研究中高表達(dá)有4 個(gè)，在胰腺癌和胃癌的研究中高表達(dá)各有2 個(gè)，其中高表達(dá)于肝癌中的研究有4個(gè)。從圖中我們還可以得到，Oncomine 數(shù)據(jù)庫(kù)目前收集到的FOXM1 基因低表達(dá)的研究?jī)H有3 個(gè)，均存在于白血病中，見(jiàn)圖1。

圖1 FOXM1 基因在Oncomine 數(shù)據(jù)庫(kù)所有腫瘤研究中的表達(dá)

2.2 肝癌中FOXM1 基因的表達(dá)情況 Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)顯示自2002 年至今的研究中，其中有4 個(gè)子數(shù)據(jù)集對(duì)肝癌組與正常組進(jìn)行分析，共760 例標(biāo)本，見(jiàn)圖2。對(duì)上述4 個(gè)數(shù)據(jù)集結(jié)果進(jìn)行薈萃分析發(fā)現(xiàn)，與正常肝臟組織比較，F(xiàn)OXM1 基因在所有差異表達(dá)基因中的中位秩為272.5，P 值為1.18E-7，其差異顯著，說(shuō)明FOXM1 高表達(dá)于肝癌中。

圖2 FOXM1 基因在Oncomine 數(shù)據(jù)庫(kù)肝癌中的表達(dá)

2.3 不同肝癌研究中FOXM1 基因的表達(dá)情況 獲取Oncomine 數(shù)據(jù)庫(kù)中不同肝癌數(shù)據(jù)集與肝臟正常組織FOXM1 基因的表達(dá)數(shù)據(jù)，對(duì)相關(guān)數(shù)據(jù)作箱式圖對(duì)比分析。FOXM1 mRNA 高表達(dá)于肝癌中（P均＜0.001），見(jiàn)圖3。GEPIA 數(shù)據(jù)庫(kù)中共檢索到369例肝癌及160 例正常肝臟組織，包含F(xiàn)OXM1 mRNA 的表達(dá)含量信息，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，GEPIA數(shù)據(jù)集分析結(jié)果與Oncomine 數(shù)據(jù)庫(kù)相一致（P＜0.001），見(jiàn)圖4。

圖3 Oncomine 數(shù)據(jù)庫(kù)FOXM1在不同肝癌研究數(shù)據(jù)集中的表達(dá)

圖4 GEPIA 數(shù)據(jù)庫(kù)FOXM1 在肝癌與正常組織中的表達(dá)差異

應(yīng)用HPA 數(shù)據(jù)庫(kù)在線分析了肝癌組織和正常組織FOXM1 的蛋白表達(dá)情況，驗(yàn)證蛋白與mRNA的表達(dá)差異水平是否一致。結(jié)果顯示FOXM1 蛋白在肝癌組織中的表達(dá)水平顯著高于正常組織，該蛋白染色結(jié)果與mRNA 表達(dá)一致。見(jiàn)圖5。

圖5 FOXM1 蛋白在肝癌組織及正常組織間的表達(dá)差異。A為正常肝組織FOXM1 蛋白表達(dá)；B 為肝癌組織中FOXM1 蛋白表達(dá)

2.4 FOXM1 基因表達(dá)水平與肝癌臨床病理分期的關(guān)系 在GEPIA 數(shù)據(jù)庫(kù)中分析FOXM1 基因表達(dá)與肝癌臨床病理分期的關(guān)系，結(jié)果顯示在不同的腫瘤臨床分期各組間FOXM1 mRNA 表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），見(jiàn)圖6。

圖6 GEPIA 數(shù)據(jù)庫(kù)FOXM1 基因在不同肝癌分期中的表達(dá)情況

2.5 FOXM1 基因表達(dá)水平與肝癌患者生存期的關(guān)系 從GEPIA 數(shù)據(jù)庫(kù)獲得364 例肝癌患者資料信息，進(jìn)行Kaplan-Meier 生存曲線分析，其結(jié)果顯示FOXM1 mRNA 表達(dá)水平對(duì)肝癌患者的總生存期和無(wú)瘤生存期均存在顯著影響。FOXM1 高表達(dá)組患者比低表達(dá)組明顯縮短（P 均<0,001）,見(jiàn)圖7。

圖7 GEPIA 數(shù)據(jù)庫(kù)FOXM1 表達(dá)與肝癌患者預(yù)后的關(guān)系

2.6 FOXM1 基因表達(dá)量與錯(cuò)配修復(fù)基因表達(dá)的相關(guān)性 為探索FOXM1 在肝癌中的表達(dá)及影響臨床預(yù)后的潛在分子機(jī)制，本文利用TCGA 數(shù)據(jù)分析對(duì)FOXM1 基因表達(dá)情況與MLH1、MSH2、MSH3、MSH4、MSH5 和MSH6 等一系列錯(cuò)配修復(fù)基因的表達(dá)進(jìn)行Pearson 相關(guān)性分析，我們發(fā)現(xiàn)FOXM1與MSH4 相關(guān)性低，而與MLH1、MSH2、MSH3、MSH5 和MSH6 基因的表達(dá)呈現(xiàn)顯著正相關(guān)性（P均＜0.001），見(jiàn)圖8A，其中與MSH2 和MSH6 相關(guān)性尤為顯著。

圖8 GEPIA 數(shù)據(jù)庫(kù)FOXM1 表達(dá)與錯(cuò)配修復(fù)基因及PI3K/AKT 信號(hào)通路關(guān)鍵分子表達(dá)的相關(guān)性。

2.7 FOXM1 與PI3K/AKT 信號(hào)通路關(guān)鍵分子在肝癌中的表達(dá)相關(guān)性 采用GEPIA 數(shù)據(jù)庫(kù)中相關(guān)性分析功能，分析在肝癌中FOXM1 與PI3K/AKT 信號(hào)通路的關(guān)聯(lián)程度。皮爾森相關(guān)性分析結(jié)果顯示，在肝癌組織中FOXM1 基因的表達(dá)與PIK3CA、mTOR、AKT1、HIF1A 及VEGFA 的表達(dá)均呈現(xiàn)正相關(guān)（P 均＜0.001），見(jiàn)圖8B。

2.8 WB 驗(yàn)證FOXM1 過(guò)表達(dá)株中錯(cuò)配修復(fù)基因與PI3K/AKT 信號(hào)通路關(guān)鍵分子蛋白表達(dá)情況 本研究小組成功構(gòu)建FOXM1 過(guò)表達(dá)HepG2 細(xì)胞株見(jiàn)圖9A。采用Western Blot 進(jìn)行蛋白檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相較于正常組，過(guò)表達(dá)組MLH1、MSH2、MSH3、MSH5、MSH6、PIK3CA、mTOR、AKT1、HIF1A和VEGFA 的表達(dá)水平在一定程度上有所提高，該結(jié)果與生物信息學(xué)分析結(jié)果相互驗(yàn)證。

圖9 過(guò)表達(dá)FOXM1 HepG2 細(xì)胞株相關(guān)蛋白表達(dá)情況。注：A 為成供構(gòu)建FOXM1 過(guò)表達(dá)株FOXM1 的表達(dá)水平；B 顯示錯(cuò)配修復(fù)基因蛋白表達(dá)水平；C 顯示PI3K/AKT 信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)水平。

3 討論

大量臨床研究顯示FOXM1 是具有細(xì)胞增殖特異性的腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子。本研究通過(guò)檢索大型癌癥公共數(shù)據(jù)庫(kù)中肝癌組織FOXM1 的表達(dá)數(shù)據(jù)，深度挖掘分析了FOXM1 在肝癌中的表達(dá)水平及其臨床預(yù)后意義。Oncomine 和GEPIA 的數(shù)據(jù)均顯示了FOXM1 基因在肝癌中的表達(dá)水平明顯高于正常組織。HPA 在線檢索網(wǎng)站發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXM1 在肝癌中的蛋白表達(dá)水平呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，該結(jié)果與上述兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)FOXM1 mRNA 分析結(jié)果相互驗(yàn)證。本研究發(fā)現(xiàn)FOXM1 與肝癌患者臨床預(yù)后密切相關(guān)。這一結(jié)果與Zhao 等[11]的研究發(fā)現(xiàn)存在相似之處。大量研究發(fā)現(xiàn)FOXM1 在腫瘤化療耐藥中起著至關(guān)重要的作用。Zhou 等[12]研究發(fā)現(xiàn)FOXM1在卵巢癌耐藥標(biāo)本中高表達(dá)，增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞對(duì)化療藥物順鉑的耐藥性；Okada 等[19]研究發(fā)現(xiàn)在接受化療治療的晚期胃癌患者中FOXM1 過(guò)表達(dá)與多西紫杉醇耐藥性顯著相關(guān)。Liu 等[20]發(fā)現(xiàn)非小細(xì)胞肺癌中FOXM1 的陽(yáng)性表達(dá)率與順鉑敏感性和預(yù)后不良有關(guān)，提示FoxM1 在順鉑耐藥中起關(guān)鍵作用。本研究驗(yàn)證了FOXM1 轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)水平與肝癌臨床分期的關(guān)系。通過(guò)GEPIA 數(shù)據(jù)庫(kù)分析，發(fā)現(xiàn)有顯著差異。后續(xù)研究中，可以對(duì)其進(jìn)一步展開(kāi)探究。

肝癌是由遺傳和環(huán)境因素引起的復(fù)雜疾病?；蚪M不穩(wěn)定是其發(fā)生的關(guān)鍵性因素之一。錯(cuò)配修復(fù)基因（Mismatch repair，MMR）是一組遺傳相關(guān)基因，任意一個(gè)基因突變，將影響DNA 堿基錯(cuò)配修復(fù)功能，引發(fā)腫瘤。通過(guò)GEPIA 數(shù)據(jù)庫(kù)相關(guān)性分析功能，本研究對(duì)FOXM1 分別與MSH2 等錯(cuò)配基因一一進(jìn)行分析驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)與MLH1、MSH2、MSH3、MSH5 和MSH6 基因的表達(dá)呈現(xiàn)顯著正相關(guān)性。PI3K/AKT 信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖分化。采用GEPIA 數(shù)據(jù)庫(kù)相關(guān)性分析功能，本研究分析了肝癌中FOXM1 與PI3K/AKT 通路關(guān)鍵性分子的表達(dá)相關(guān)性，為后續(xù)腫瘤發(fā)生分子機(jī)制的探究提供參考依據(jù)。本研究使用大型癌癥數(shù)據(jù)庫(kù)分析了FOXM1 轉(zhuǎn)錄因子在HCC 中的表達(dá)及其臨床預(yù)后意義及其相關(guān)分子機(jī)制，探索其作為肝癌預(yù)后的新標(biāo)志物和基因治療靶標(biāo)的潛能。大量研究證明，單一的腫瘤標(biāo)志物無(wú)法及時(shí)、有效地輔助腫瘤診斷。本研究小組后期將聯(lián)合FOXM1、AFP、GP73 及DCP 等肝癌輔助診斷項(xiàng)目，進(jìn)一步探尋更為有效的腫瘤標(biāo)志物組合，幫助臨床實(shí)現(xiàn)早期診斷與治療。