四川部分地區(qū)雞球蟲(chóng)流行病學(xué)調(diào)查及蟲(chóng)種鑒定

楊雪儷，吉克日洪，李菁菁，鐘 瑩，郝力力，張潤(rùn)慧

(西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610041)

雞球蟲(chóng)病系由頂復(fù)門(mén)的艾美耳屬球蟲(chóng)(Eimeria)寄生在雞的腸道黏膜上皮細(xì)胞內(nèi)所引發(fā)的寄生性原蟲(chóng)疾病，該病呈全球性流行分布，雛雞具有較高的發(fā)病率和病死率，且生長(zhǎng)發(fā)育受到較大影響，而成年雞大多為帶蟲(chóng)者，影響其飼料轉(zhuǎn)化率及產(chǎn)蛋量.即便是在雞球蟲(chóng)病被治愈之后，也會(huì)由于球蟲(chóng)損傷了雞體的消化道，使其無(wú)法徹底恢復(fù)健康，與無(wú)球蟲(chóng)感染史的健康雞相比，生長(zhǎng)發(fā)育的趨勢(shì)較為緩慢[1].因此該病在全球養(yǎng)雞業(yè)中造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失，雞球蟲(chóng)病每年給養(yǎng)雞業(yè)帶來(lái)超過(guò)100 億英鎊的損失[2].目前世界上公認(rèn)的有7 種雞艾美耳球蟲(chóng)，包括柔嫩(E.tenella)、毒害(E.necatrix)、堆型(E.acervulina)、巨型(E.maxima)、和緩(E.mitis)、布氏(E.brunetti)和早熟(E.praecox)艾美耳球蟲(chóng)[3]，這7 種球蟲(chóng)在病變部位、病變程度以及卵囊形態(tài)等方面都具有不同的特征，其中致病性最強(qiáng)的兩種分別為柔嫩艾美耳球蟲(chóng)和毒害艾美耳球蟲(chóng)[4].

對(duì)球蟲(chóng)的蟲(chóng)種鑒定以往多采用傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定，即在光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察球蟲(chóng)卵囊以及孢子化卵囊的形狀、顏色，大小，綜合球蟲(chóng)的卵囊特征、寄生部位、病變特征、潛隱期等進(jìn)行鑒定.但是，在傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定過(guò)程中影響因素較多，且田間多為混合球蟲(chóng)感染，鏡檢所耗時(shí)間較長(zhǎng)，出錯(cuò)率高.第一內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列(Internal transcribed spacers-1，ITS-1)存在于高度重復(fù)的核糖體中，其基因序列的長(zhǎng)度較短且進(jìn)化速度較快，與傳統(tǒng)鑒定方法相比，其敏感性強(qiáng)、準(zhǔn)確度更高[5]，適用于寄生蟲(chóng)種間的遺傳進(jìn)化分析、蟲(chóng)種鑒定以及分類(lèi)[6-7].本研究在2021－2022年從四川省9 個(gè)縣市18 個(gè)養(yǎng)雞場(chǎng)采集新鮮糞便樣品，通過(guò)鏡檢確認(rèn)各地區(qū)樣品的陽(yáng)性率，隨后對(duì)球蟲(chóng)陽(yáng)性樣品進(jìn)行形態(tài)學(xué)、PCR 分子生物學(xué)鑒定以及遺傳進(jìn)化分析，以了解這些地區(qū)雞球蟲(chóng)流行情況.

1 材料與方法

1.1 樣本來(lái)源

在2021－2022年于18 個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)中共采集152份糞便樣品:四川省涼山州普格縣(4 份)、四川省涼山州甘洛縣(24 份)、四川省涼山州寧南縣(32 份)、四川省涼山州喜德縣(24 份)、四川省涼山州雷波縣(8 份)、西昌市太和鎮(zhèn)(32 份)以及資中市(8 份)、德陽(yáng)市(17 份)、綿陽(yáng)市(3 份)9 個(gè)縣市的養(yǎng)雞場(chǎng)中的雞新鮮糞便.

1.2 主要試劑

瓊脂糖、50×TAE、Easy Pure?Stool Genomic DNA Kit、2× Easy Taq?PCR SuperMix、Trans2K?Plus ⅡDNA Marker、GelStain 高靈敏度無(wú)毒核酸染料均為北京全式金生物技術(shù)股份有限公司產(chǎn)品；重鉻酸鉀粉劑購(gòu)自天津市安吉瑞化工有限公司.

1.3 飽和食鹽水漂浮法

采用飽和食鹽水漂浮法對(duì)糞便樣品分別進(jìn)行檢測(cè)，于光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察收集到的糞樣中是否含有球蟲(chóng).取少量的糞便( ＜5 g)，并加入近2 倍體積的清水搗碎混勻，用80 目和200 篩網(wǎng)濾掉糞渣[8]，取1 mL混勻液加入9 mL 飽和食鹽水，靜置15 min.取10 μL表面液體滴在載玻片上，壓片鏡檢觀(guān)察樣品中是否有蟲(chóng)卵.

1.4 雞球蟲(chóng)田間株卵囊純化

將鏡檢觀(guān)察確定為含有球蟲(chóng)卵囊的陽(yáng)性糞便以1∶1 的比例加水混勻后立即用篩網(wǎng)過(guò)濾雜質(zhì)，將濾液以3 000 r/min離心8 min，棄去上清液，再加入飽和食鹽水混勻后繼續(xù)以3 000 r/min離心8 min，取飽和食鹽水漂浮液以1∶4 清水量稀釋漂浮液后重復(fù)離心，直至將所有勻漿收集到1 個(gè)離心管中，最后取沉淀物收集于2.5%重鉻酸鉀溶液中，置于恒溫?fù)u床上培養(yǎng)96 h左右使其孢子化.

1.5 雞球蟲(chóng)田間株形態(tài)學(xué)鑒定

在光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察純化樣品中孢子化球蟲(chóng)卵囊的形態(tài)、顏色、大小等，參照雞球蟲(chóng)卵囊圖譜[9-10]及相關(guān)文獻(xiàn)資料[11]進(jìn)行初步蟲(chóng)種鑒定.

1.6 雞球蟲(chóng)卵囊DNA 的提取

在孢子化卵囊懸液中加入0.4～0.6 mm 玻璃微珠，充分渦旋使卵囊破碎后，按照DNA 提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取球蟲(chóng)卵囊DNA，將其放至－20 ℃保存?zhèn)溆?

1.7 雞球蟲(chóng)ITS-1 序列的PCR 擴(kuò)增

根據(jù)參考文獻(xiàn)[12-14]，合成ITS-1 基因通用型引物以及7 種雞艾美耳屬球蟲(chóng)的ITS-1 基因特異性引物，其中ITS-1 基因通用引物上游為:5′-AAGTTGCGTAAATAGAGCCCTC-3′；下游為:5′-CAAGACATCCATTGCTGAAAGT-3′，各球蟲(chóng)特異性引物見(jiàn)表1，引物均由上海生工生物工程有限公司合成.以提取的孢子化球蟲(chóng)卵囊DNA 為模板進(jìn)行擴(kuò)增，采用25 μL 反應(yīng)體系:PCR SuperMix 12.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，DNA 模板1 μL，ddH2O 9.5 μL.反應(yīng)程序?yàn)?94 ℃，5 min(預(yù)變性)；94 ℃，30 s(變性)，在各特異性引物的退火溫度下退火30 s(見(jiàn)表1)，72 ℃，22 s(延伸)，共35 個(gè)循環(huán)；最后在72 ℃下延伸7 min.取5 μL PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠中120 V 電泳30 min，在成像系統(tǒng)中觀(guān)察結(jié)果并記錄.

表1 各球蟲(chóng)特異性引物Table 1 Specific primers of each Eimeria species

1.8 序列測(cè)定和分析

將通用引物擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序.PCR 產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果在GenBank 上進(jìn)行BLAST 比對(duì)，并通過(guò)DNAStar 軟件進(jìn)行序列比較和分析，構(gòu)建不同蟲(chóng)種間ITS-1 序列的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù).

2 結(jié)果

2.1 鏡檢結(jié)果

鏡檢結(jié)果得出樣品陽(yáng)性率為0.7%(10/152)，從152 個(gè)糞樣中篩選出10 份球蟲(chóng)陽(yáng)性樣品，分別來(lái)自普格縣、雷波縣、西昌市太和鎮(zhèn)、德陽(yáng)市和綿陽(yáng)市，編號(hào)為W1、W2、W3、W4、LB、TH、DY、MY1、MY2、MY3.

2.2 卵囊的形態(tài)觀(guān)察

于光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察到早熟艾美耳球蟲(chóng)(圖1a)卵囊呈球形，大小約為16 μm×16 μm，柔嫩艾美耳球蟲(chóng)(圖1b)呈現(xiàn)出寬卵圓形，卵囊大小約為21 μm×16 μm，卵囊壁較厚且呈現(xiàn)淡綠色，有一極粒.堆型艾美耳球蟲(chóng)(圖1c)卵囊呈卵圓形，大小約為18 μm×13 μm，有一個(gè)極粒.布氏艾美耳球蟲(chóng)(圖1d)在顯微鏡下觀(guān)察呈寬卵圓形，具有一個(gè)極粒，卵囊大小約為22 μm×17 μm，其孢子囊形態(tài)呈現(xiàn)為長(zhǎng)卵圓形.毒害艾美耳球蟲(chóng)(圖1e)同樣為卵圓形，但相較于堆型艾美耳球蟲(chóng)，其卵囊直徑更大，約為20 μm×15 μm.7 種球蟲(chóng)卵囊中直徑最小的是和緩艾美耳球蟲(chóng)(圖1f)，為球形，約為15 μm×14 μm，且卵囊壁呈淡黃綠色.巨型艾美耳球蟲(chóng)(圖1g)體型最大，卵囊大小約為31 μm×20 μm，呈卵圓形，其卵囊壁厚度較為不均勻，有兩個(gè)極粒，見(jiàn)圖1.

圖1 孢子化艾美耳球蟲(chóng)卵囊(400×)Fig.1 Sporulated oocyst of Eimeria (400×)

2.3 PCR 擴(kuò)增結(jié)果

將所提取的球蟲(chóng)DNA 為模板，根據(jù)7 種球蟲(chóng)特異性引物進(jìn)行PCR 檢測(cè)，結(jié)果顯示:MY1 和W1 擴(kuò)增出陽(yáng)性條帶的為毒害、早熟、布氏、巨型和柔嫩艾美耳球蟲(chóng)，W2 混合株擴(kuò)增出陽(yáng)性條帶的為毒害、早熟、布氏和巨型艾美耳球蟲(chóng)，W3 混合株擴(kuò)增出陽(yáng)性條帶的為早熟、布氏、巨型和柔嫩艾美耳球蟲(chóng)，LB 混合株擴(kuò)增出陽(yáng)性條帶的為毒害艾美耳球蟲(chóng)和柔嫩艾美耳球蟲(chóng)，MY2 擴(kuò)增出陽(yáng)性條帶的為毒害、早熟、布氏和柔嫩艾美耳球蟲(chóng).TH 混合株擴(kuò)增出陽(yáng)性條帶的為柔嫩艾美耳球蟲(chóng)和巨型艾美耳球蟲(chóng)，DY 混合株和W4 混合株擴(kuò)增出陽(yáng)性條帶的為柔嫩、巨型及堆型艾美耳球蟲(chóng)，而MY 混合株擴(kuò)增出陽(yáng)性條帶的為柔嫩和堆型艾美耳球蟲(chóng)(圖2).其中毒害艾美耳球蟲(chóng)的條帶大小范圍在250～500 bp 之間，約為290 bp，早熟艾美耳球蟲(chóng)片段大小約為380 bp，布氏艾美耳球蟲(chóng)片段大小約為310 bp，柔嫩艾美耳球蟲(chóng)片段大小約為270 bp，巨型艾美耳球蟲(chóng)條帶范圍在100～250 bp 內(nèi)，約為150 bp.通用引物PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂凝膠電泳結(jié)果顯示(圖3)，10 個(gè)樣品均擴(kuò)增出陽(yáng)性條帶，大小范圍為500～750 bp，約為600 bp.

圖2 部分田間混合樣品球蟲(chóng)種類(lèi)PCR 鑒定結(jié)果Fig.2 Identification of coccidiosis species from the field by PCR

圖3 部分通用型引物擴(kuò)增電泳結(jié)果Fig.3 Electrophoresis of amplification by using general primers

2.4 序列測(cè)定及同源性比對(duì)結(jié)果

對(duì)10 個(gè)田間混合蟲(chóng)株分離株測(cè)序后，將所獲得的序列在NCBI 中經(jīng)過(guò)BLAST 后，其中MY1、MY2、W1、W2、W3、W4、LB 和TH 均與柔嫩艾美耳球蟲(chóng)ITS-1 的同一性達(dá)到最高，DY 序列與和緩艾美耳球蟲(chóng)序列同一性最高達(dá)到89.36%，MY3 與布氏艾美耳球蟲(chóng)ITS-1 序列同一性最高達(dá)到98.47%.選擇與田間混合樣品序列差異最小的蟲(chóng)種與不同地區(qū)的蟲(chóng)株進(jìn)行比對(duì)確認(rèn)(表2)，通過(guò)DNAStar 軟件的CLUSTAL W，將其與不同種之間的ITS-1 序列進(jìn)行同源性比較，分析結(jié)果見(jiàn)表3.除埃及地區(qū)的柔嫩Alexandria 分離株與柔嫩上海分離株(FJ449691) 和柔嫩Houghton 株(AF446075)同源性為75.1%和75.9%，其余柔嫩艾美耳球蟲(chóng)、和緩艾美耳球蟲(chóng)和布氏艾美耳球蟲(chóng)的序列在蟲(chóng)株之間進(jìn)行比較其ITS-1 序列一致性均大于80%.W1、W2、W3、W4、LB、MY1、MY2 和TH 與已登錄GenBank 的柔嫩艾美耳球蟲(chóng)的序列一致性在96.6%～98.5%之內(nèi)(除埃及地區(qū)柔嫩Alexandria 分離株).MY3 的ITS-1 序列與布氏艾美耳球蟲(chóng)最為相似，與布氏艾美耳球蟲(chóng)分離株TN11 之間的同源性最高，達(dá)93.3%.本研究對(duì)這10 個(gè)陽(yáng)性樣品之間ITS-1序列進(jìn)行同源性比較，結(jié)果MY1 和TH 的相似性最大，達(dá)98.9%，MY3 和DY 與其他8 個(gè)序列的相似性均較小(42.7%～64.4%)，而與柔嫩艾美耳球蟲(chóng)最為相似的8 個(gè)樣品之間進(jìn)行ITS-1 序列同源性比較，同源性均在96.9%～98.9%之間.以上結(jié)果表明，每個(gè)地區(qū)所采集的樣品中所包含的球蟲(chóng)種類(lèi)存在一定的差異，除了MY3 和DY 外，另外8 個(gè)樣品中柔嫩艾美耳球蟲(chóng)為優(yōu)勢(shì)蟲(chóng)種，而MY3 的優(yōu)勢(shì)蟲(chóng)種為布氏艾美耳球蟲(chóng).

表2 艾美耳球蟲(chóng)ITS-1 基因序列信息(下載于GenBank)Table 2 The ITS-1 sequence information of Eimeria spp.(downloaded from GenBank)

2.5 ITS-1 序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建

應(yīng)用DNAStar 軟件，以Clustal W 法對(duì)5 個(gè)地區(qū)10 個(gè)樣品中球蟲(chóng)ITS-1 及GenBank 上來(lái)自澳大利亞、埃及、南非、中國(guó)等不同地區(qū)的球蟲(chóng)分離株的ITS-1 部分序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)[15-16](圖4).結(jié)果顯示，無(wú)論地理位置如何，柔嫩艾美耳球蟲(chóng)、緩艾美耳球蟲(chóng)和布氏艾美耳球蟲(chóng)的所有ITS-1 序列都存在明顯的種間聚類(lèi).與柔嫩艾美耳球蟲(chóng)序列相似的8 個(gè)樣品ITS-1 序列同4 個(gè)來(lái)自不同地區(qū)的柔嫩分離株均處于同一分支內(nèi)，且8 個(gè)樣品中ITS-1 序列遺傳距離緊鄰.E.brunettiMY3 與布氏艾美耳球蟲(chóng)分離株聚于一小支，遺傳進(jìn)化關(guān)系較近.E.mitisDY 雖然與其他地區(qū)的和緩艾美耳球蟲(chóng)分離株仍處于進(jìn)化樹(shù)的同一系群，但未聚于同一分支內(nèi)，遺傳距離較遠(yuǎn).

圖4 基于各蟲(chóng)株ITS1 基因構(gòu)建的NJ 進(jìn)化樹(shù)Fig.4 Neighbor joining (NJ) phylogenetic trees based on the ITS1 of each strain

3 討論

球蟲(chóng)傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定法是通過(guò)顯微鏡下觀(guān)察球蟲(chóng)卵囊以及孢子化卵囊的形狀、顏色及大小，綜合球蟲(chóng)的卵囊特征、寄生部位、病變特征、潛隱期等[17]，參照?qǐng)D譜進(jìn)行種類(lèi)鑒定.由于該方法僅需在顯微鏡下觀(guān)察，所需儀器設(shè)備簡(jiǎn)單且結(jié)果呈現(xiàn)直接，目前仍是初步鑒定雞球蟲(chóng)種類(lèi)的常用方法.而通過(guò)PCR 擴(kuò)增出艾美耳球蟲(chóng)DNA 序列中的特定片段，由于該方法具有特異性較強(qiáng)、效率高等優(yōu)點(diǎn)，目前已廣泛應(yīng)用于球蟲(chóng)蟲(chóng)種鑒別.內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)是核糖體DNA 中18S和28S 之間的高度保守的序列，其中分為兩段長(zhǎng)度適中的基因序列，分別是ITS-1 和ITS-2，在種內(nèi)具有較高的保守性，但在不同物種中的基因序列又呈現(xiàn)出不同程度的變異，進(jìn)化速度敏捷[6]，所以已被廣泛用于7 種雞球蟲(chóng)的鑒定，同時(shí)被用來(lái)研究蟲(chóng)種間的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化關(guān)系.本研究利用Jenkins 等[13]設(shè)計(jì)的通用引物，對(duì)采自四川省涼山州普格縣、西昌市太和鎮(zhèn)、雷波縣以及德陽(yáng)、綿陽(yáng)5 個(gè)縣市的10 個(gè)樣品進(jìn)行ITS-1 序列的擴(kuò)增和序列測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同樣品之間ITS-1序列的同源性在42.7%～98.9%，其中MY3 和DY與其他8 個(gè)序列的相似性均較小(42.7%～64.4%).同時(shí)，將10 個(gè)樣品ITS-1 序列分別與GenBank 上下載的不同地區(qū)的柔嫩、和緩和布氏艾美耳球蟲(chóng)進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果顯示，W1、W2、W3、W4、MY1、MY2、LB 和TH 這8 個(gè)序列與4 株其他地區(qū)的柔嫩艾美耳球蟲(chóng)ITS-1 序列一致性均在96.6%～98.5%，而MY3 與布氏艾美耳球蟲(chóng)分離株TN11 之間的同源性最高，達(dá)93.3%，則本研究中大部分地區(qū)的優(yōu)勢(shì)蟲(chóng)種為柔嫩艾美耳球蟲(chóng)，而MY3 的優(yōu)勢(shì)蟲(chóng)種為布氏艾美耳球蟲(chóng).

將田間混種球蟲(chóng)的ITS-1 序列與GenBank 上公布的ITS-1 序列進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)，和柔嫩艾美耳球蟲(chóng)序列相似的8 個(gè)樣品與不同地區(qū)的柔嫩分離株均處于同一分支內(nèi)，親緣關(guān)系較近，且8 個(gè)樣品中ITS-1 序列遺傳距離十分相近，序列差異較小.E.brunettiMY3 與布氏艾美耳球蟲(chóng)分離株遺傳進(jìn)化關(guān)系較近.在進(jìn)行blast 比對(duì)時(shí)，與DY 顯示同一性最高的是和緩艾美耳球蟲(chóng)，但其同一性?xún)H達(dá)到89.36%，E.mitisDY 雖與其他地區(qū)的和緩分離株仍處于進(jìn)化樹(shù)的同一系群，但遺傳距離較遠(yuǎn)，與柔嫩艾美耳球蟲(chóng)分離株聚于一個(gè)分支內(nèi)，因此E.mitisDY 與其他和緩艾美耳球蟲(chóng)分離株相比，可能出現(xiàn)變異情況.從柔嫩艾美耳球蟲(chóng)分支對(duì)應(yīng)同源性分析來(lái)看，可以得知埃及地區(qū)的分離株與其他地區(qū)分離株相比其進(jìn)化距離較遠(yuǎn)，序列同一性相對(duì)較小.本研究調(diào)查的5 個(gè)地區(qū)養(yǎng)殖場(chǎng)內(nèi)雞球蟲(chóng)混種感染中蟲(chóng)種相似性較高，其可能與養(yǎng)雞場(chǎng)的雞源以及飼料等養(yǎng)殖材料的來(lái)源相同有關(guān).

4 結(jié)論

本研究通過(guò)鏡檢從152 份糞樣中檢測(cè)出10 份球蟲(chóng)陽(yáng)性樣本，再通過(guò)形態(tài)學(xué)觀(guān)察卵囊基本特征可初步確定樣品均為混種球蟲(chóng)感染，并利用分子生物學(xué)檢測(cè)方法進(jìn)行蟲(chóng)種鑒定，采用特異性引物和通用引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增后，對(duì)通用引物擴(kuò)增序列進(jìn)行比對(duì)，確定W1和MY1 樣品中感染的球蟲(chóng)種類(lèi)為毒害、巨型、柔嫩、布氏和早熟艾美耳球蟲(chóng)，W2 樣品中包含毒害、巨型、布氏和早熟艾美耳球蟲(chóng)，W3 中包括早熟、柔嫩、巨型和布氏艾美耳球蟲(chóng)，LB 混合感染毒害艾美耳球蟲(chóng)和柔嫩艾美耳球蟲(chóng)，MY2 中包括毒害、柔嫩、布氏和早熟艾美耳球蟲(chóng)，TH 樣品包括柔嫩、毒害、堆型、巨型、早熟、和緩以及布氏7 種艾美耳球蟲(chóng)混合感染，MY、W4和DY 包括柔嫩、巨型、堆型、毒害、和緩以及布氏艾美耳球蟲(chóng).