2013—2021年杭州某綜合醫(yī)院非結(jié)核分枝桿菌肺病流行狀況分析

韓佳穎，覃瑤，何飛

2013—2021年杭州某綜合醫(yī)院非結(jié)核分枝桿菌肺病流行狀況分析

韓佳穎1，覃瑤2，何飛1

1.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬杭州市胸科醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，浙江杭州 310003；2.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬杭州市胸科醫(yī)院結(jié)核科，浙江杭州 310003

分析杭州市結(jié)核病定點(diǎn)診治醫(yī)院2013—2021年非結(jié)核分枝桿菌（nontuberculosis mycobacteria，NTM）肺病的流行狀況，為杭州市該病的臨床防治診療及流行病學(xué)提供依據(jù)。收集2013—2021年浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬杭州市胸科醫(yī)院結(jié)核科及呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科收治的疑似肺結(jié)核患者，經(jīng)抗酸桿菌涂片及BACTEC MGIT960確診為分枝桿菌感染，采用實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群（tuberculosis complex，MTB）與NTM的菌群鑒定，對(duì)鑒定為NTM的菌株采用HAIN基因分型鑒定法及DNA微陣列技術(shù)進(jìn)行菌種鑒定，并對(duì)感染者的相關(guān)資料進(jìn)行總結(jié)分析。2013—2021年，從37 520例疑似肺結(jié)核患者標(biāo)本中分離出NTM菌株1257株，檢出率從2013年的0.8%上升到2021年的6.7%?；颊咧心行哉?0.76%，女性占49.24%。年齡分布上，60～79歲的中老年患者最多，占55.0%。2013年檢出3種NTM菌種，分別是胞內(nèi)分枝桿菌、膿腫分枝桿菌和龜/膿腫分枝桿菌；2021年菌種分布達(dá)13種，前三位分別是胞內(nèi)分枝桿菌、龜/膿腫分枝桿菌和鳥(niǎo)分枝桿菌。2013—2021年杭州地區(qū)NTM檢出率持續(xù)升高，感染人群以男性、60～79歲的中老年為主，感染菌種以胞內(nèi)分枝桿菌、龜/膿腫分枝桿菌和鳥(niǎo)分枝桿菌為主。

分枝桿菌；非結(jié)核分枝桿菌；菌種鑒定；疾病特征；流行病學(xué)

非結(jié)核分枝桿菌（nontuberculosis mycobacteria，NTM）是除結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群（tuberculosis complex，MTB）和麻風(fēng)分枝桿菌以外的其他分枝桿菌的總稱，目前共發(fā)現(xiàn)有菌種約190余種，14個(gè)亞種，大多數(shù)為條件致病菌[1]。近年來(lái)，NTM感染在歐美國(guó)家和包括我國(guó)在內(nèi)的亞洲國(guó)家的發(fā)病率均逐漸上升，已逐步成為威脅人類健康的重要公共衛(wèi)生問(wèn)題[2-3]。目前國(guó)內(nèi)尚缺乏大樣本NTM病的流行病學(xué)調(diào)查資料，了解NTM病的趨勢(shì)和流行對(duì)疾病診治和防控至關(guān)重要[1]。本研究對(duì)2013—2021年杭州市一家定點(diǎn)結(jié)核病診療中心分離培養(yǎng)的NTM菌株進(jìn)行分析，以了解該市NTM的菌種分布、流行狀況，為本病的防治診療提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象及菌株來(lái)源

通過(guò)調(diào)查電子病歷系統(tǒng)、檢驗(yàn)系統(tǒng)的數(shù)據(jù)，收集2013年1月至2021年12月浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬杭州市胸科醫(yī)院結(jié)核科及呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科收治的37 520例疑似肺結(jié)核患者，對(duì)萋–尼氏染色法染色及MGIT960分枝桿菌快速培養(yǎng)陽(yáng)性者，采用實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測(cè)進(jìn)行MTB與NTM的初步菌群鑒定，對(duì)鑒定為NTM的菌株應(yīng)用HAIN基因分型鑒定及DNA微陣列菌種鑒定，同一患者多次培養(yǎng)得到同一種分枝桿菌按重復(fù)菌株剔除。MTB質(zhì)控菌株（標(biāo)準(zhǔn)菌株）H37Rv（ATCC27294）、胞內(nèi)分枝桿菌（ATCC13950）、鳥(niǎo)分枝桿菌（ATCC25291）、膿腫分枝桿菌（ATCC19977）、堪薩斯分枝桿菌（ATCC12478）、龜分枝桿菌（ATCC35752）、偶然分枝桿菌（ATCC6841）均來(lái)源于中國(guó)疾病預(yù)防控制中心國(guó)家結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室傳代培養(yǎng)。NTM病診斷標(biāo)準(zhǔn)參照指南[1]。

1.2 試劑和儀器

1.2.1 試劑 萋–尼氏染色試劑購(gòu)自珠海貝索生物技術(shù)有限公司；BACTEC MGIT960分枝桿菌分析系統(tǒng)（MGIT 960）及其配套試劑MGIT試管、雜菌抑制劑均購(gòu)自美國(guó)BD公司；HAIN基因分型試劑盒（CM/AS）購(gòu)自德國(guó)HAIN Lifescience公司；分枝桿菌核酸檢測(cè)試劑盒、分枝桿菌菌種鑒定試劑盒（DNA微陣列芯片法）購(gòu)自北京博奧生物有限公司。所有試劑均在有效期內(nèi)使用。

1.2.2 儀器 生物顯微鏡（日本奧林巴斯公司）、低溫離心機(jī)（德國(guó)EPPENDORF公司）、熒光定量PCR儀（美國(guó)Roche公司）、全自動(dòng)結(jié)核桿菌培養(yǎng)箱（美國(guó)BD公司）、HybSet微陣列芯片雜交儀、芯片洗干儀、微陣列芯片掃描儀均購(gòu)自北京博奧生物集團(tuán)有限公司。

1.3 研究方法

1.3.1 MGIT960培養(yǎng) 按照《結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)培訓(xùn)教程》[4]進(jìn)行，對(duì)臨床分離株進(jìn)行萋-尼抗酸涂片染色檢測(cè)是否存在抗酸桿菌，采用自動(dòng)化的BACTEC MGIT 960分枝桿菌培養(yǎng)液快速培養(yǎng)，通常在2～4周內(nèi)報(bào)告陽(yáng)性結(jié)果“分枝桿菌生長(zhǎng)”，在42d后報(bào)告陰性結(jié)果。

1.3.2 PCR熒光探針?lè)ǔ醪借b定 按照結(jié)核菌和非結(jié)核分枝桿菌實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)試劑盒說(shuō)明，采用雙重PCR技術(shù)和Taqman探針技術(shù)相結(jié)合，對(duì)標(biāo)本中提取的分枝桿菌核酸進(jìn)行定性檢測(cè)。分別針對(duì)MTB和NTM的特異性序列設(shè)計(jì)引物和探針，兩探針?lè)謩e標(biāo)記對(duì)應(yīng)的熒光發(fā)光基團(tuán)。檢測(cè)時(shí)，當(dāng)反應(yīng)體系中有目的基因存在時(shí)，就會(huì)釋放出熒光。通過(guò)監(jiān)測(cè)FAM及HEX兩通道不同的熒光信號(hào)變化，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)MTB和NTM的檢測(cè)。結(jié)果判定見(jiàn)表1。

表1 PCR熒光探針?lè)z測(cè)結(jié)果及解釋

1.3.3 菌種鑒定 2013—2016年，將培養(yǎng)陽(yáng)性菌種經(jīng)HAIN基因組試劑盒提取DNA，擴(kuò)增200bp片段的23SrRNA；雜交及顯色操作過(guò)程參照試劑盒說(shuō)明書(shū)，示例見(jiàn)圖1。2017—2021年，采用DNA微陣列芯片法鑒定培養(yǎng)陽(yáng)性菌種，將雜交緩沖液和PCR產(chǎn)物吹掃并混合。再將混合物添加到采樣孔中，進(jìn)行洗滌和干燥芯片，采用微陣列芯片掃描儀進(jìn)行掃描和相應(yīng)軟件進(jìn)行信號(hào)讀取，所有NTM菌株都獲得一張清晰的芯片圖，示例見(jiàn)圖2。

圖1 HAIN基因分型試劑盒菌種鑒定雜交示例圖

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)（百分率）[（%）]表示，比較采用2檢驗(yàn)，<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各年度NTM菌株檢出情況

對(duì)37 520份標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，2013—2016年共分離培養(yǎng)出4種NTM，分別為胞內(nèi)分枝桿菌、龜/膿腫分枝桿菌、鳥(niǎo)分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌，共計(jì)245株。2017—2021年共分離培養(yǎng)出12種NTM，分別為胞內(nèi)分枝桿菌、龜/膿腫分枝桿菌、鳥(niǎo)分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、蟾蜍分枝桿菌、偶然分枝桿菌、戈登分枝桿菌、淺黃分枝桿菌、田野分枝桿菌、土分枝桿菌、瘰疬分枝桿菌株共計(jì)1012株，NTM的總分離率為3.4%，具體見(jiàn)圖3和表2。

圖3 患者納入及實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)流程圖

2.2 NTM患者的性別、年齡分布

2013—2021年杭州市NTM感染患者中，男性占50.76%，略高于女性的49.24%?；颊吣挲g7～98歲，平均62.8歲。各年度感染者及男、女性感染者的年齡分布均以60～79歲組最多，具體見(jiàn)表3、表4。2013—2021年，男女構(gòu)成比變化趨勢(shì)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（2=8.218，=0.003），NTM年齡構(gòu)成比變化趨勢(shì)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（2=5.144，=0.023）。

表2 2013—2021年NTM檢出情況

2.3 NTM菌種分布

2013年分離出NTM 31株，共鑒定出胞內(nèi)分枝桿菌、膿腫分枝桿菌、龜/膿腫分枝桿菌3種菌種，有1例MTB及NTM共存；2014—2016年分離出NTM共214株，前三位分別為胞內(nèi)分枝桿菌、膿腫分枝桿菌、鳥(niǎo)分枝桿菌；2017年共分離出NTM 50株，鑒定出8種NTM，前三位分別為胞內(nèi)分枝桿菌、膿腫分枝桿菌、鳥(niǎo)分枝桿菌；2018年105株共鑒定出8種NTM，前三位分別為胞內(nèi)分枝桿菌、龜/膿腫分枝桿菌、鳥(niǎo)分枝桿菌；2019年296株共鑒定出9種NTM，前三位分別為胞內(nèi)分枝桿菌、鳥(niǎo)分枝桿菌、龜/膿腫分枝桿菌；2020年共檢出NTM 283株，包括12種類型，菌種前三位分別為胞內(nèi)分枝桿菌、鳥(niǎo)分枝桿菌、龜/膿腫分枝桿菌；2021年共檢出NTM 278株，包括12種類型，前三位分別為胞內(nèi)分枝桿菌、龜/膿腫分枝桿菌和鳥(niǎo)分枝桿菌，分別占45.7%、15.5%、12.2%，其余還有少許堪薩斯分枝桿菌、蟾蜍分枝桿菌、偶然分枝桿菌、戈登分枝桿菌、淺黃分枝桿菌、田野分枝桿菌、土分枝桿菌、瘰疬分枝桿菌菌株。

表3 NTM患者不同特征在2013—2021年的分布情況[n（%）]

表4 2013—2021年各年齡組NTM患者在不同性別中的分布情況

3 討論

3.1 NTM分離率

我國(guó)目前尚沒(méi)有關(guān)于NTM的大樣本流行病學(xué)調(diào)查資料[1,5]。既往研究顯示，我國(guó)NTM分離率由1979年的4.3%上升至2010年的22.9%，呈明顯的上升態(tài)勢(shì)[6]。一項(xiàng)薈萃分析指出，在中國(guó)疑似結(jié)核患者中，NTM的分離率為4.66%～5.78%，分枝桿菌中NTM的分離率為11.57%[7]。

NTM的分離率在我國(guó)的東南沿海地區(qū)高于其他地區(qū)[8]。本研究結(jié)果顯示杭州地區(qū)2013—2021年總分離率為3.40%，低于2010年流行病學(xué)抽樣調(diào)查的22.90%、北京市37.30%、廣州市24.20%、紹興市10.90%、湖南省10.20%、福建省6.35%、深圳市4.10%[6,9-14]。本研究2021年NTM的分離率為6.7%，與重慶市5.7%、上海市5.9%相近，高于云南的1.6%[15-17]。NTM的流行及檢出有顯著的地域差異，提示不同地區(qū)需根據(jù)當(dāng)?shù)匾咔樽鞒鱿鄳?yīng)的防控策略。

3.2 NTM在人群中的分布

NTM的發(fā)病與年齡呈正相關(guān)，在湖南省14個(gè)地級(jí)市的年齡分布中，40歲以上的中老年患者最多，占39.2%[12,18]；南京地區(qū)50歲以上的患者男性占68.6%，女性占77.8%[19]；深圳地區(qū)患者主要年齡段以55歲以下的青壯年為主，占84.5%，且男、女性患者的分布峰值均以25～34歲年齡組最多，可能與當(dāng)?shù)氐娜丝诮Y(jié)構(gòu)有關(guān)[14]。韓國(guó)男性患者主要集中在60和70多歲，而女性患者則更年輕一些，平均62.7歲[20]。新加坡患者的中位年齡為67歲[21]。美國(guó)65歲以上的患者年患病率也明顯高于其他年齡段[19]。本研究中NTM感染者的男女性分布峰值均在60～79歲，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。

3.3 NTM種群分布比較

NTM為環(huán)境細(xì)菌，菌種分布具有地域差異性，可能與當(dāng)?shù)氐牡乩砦恢?、氣候、生活環(huán)境、實(shí)驗(yàn)室條件等密切相關(guān)[7]。在南京、北京、湖南等地胞內(nèi)分枝桿菌是最常見(jiàn)的致病菌，分別占70.1%、31.8%、27.2%[9,12,19]；上海、伊朗最常見(jiàn)的是堪薩斯分枝桿菌，分別占45.0%、30.5%[16,22]；深圳、新加坡、廣東最常見(jiàn)的是膿腫分枝桿菌，分別占41.6%、49.9%、48.8%[14,21]。而MAC作為大多數(shù)國(guó)家（地區(qū)）的主要菌種，在澳大利亞、韓國(guó)、亞洲、北美、南非、歐洲和南美洲所占比例分別為71.1%、63.6%、53.8%、52.0%、50.5%、36.9%、31.3%[20,23]。

有研究指出，在中國(guó)2015年之前最流行的菌種是膿腫分枝桿菌，2015年后則為胞內(nèi)分枝桿菌[7]。本研究經(jīng)菌種鑒定NTM種群分布達(dá)13種，2013—2021年最常見(jiàn)的均為胞內(nèi)分枝桿菌，與部分文獻(xiàn)內(nèi)容契合。

3.4 NTM菌種鑒定的重要性

NTM感染后可產(chǎn)生與MTB相似的癥狀、體征和影像改變，目前大部分基層醫(yī)院依然使用抗酸染色作為診斷MTB的方法。但在無(wú)菌種鑒定結(jié)果的情況下，抗酸染色不能有效區(qū)分兩者，故不少NTM患者被誤診為MTB感染，并接受持續(xù)無(wú)效的抗結(jié)核治療[1]。因此需要更多的臨床實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展NTM的菌種鑒定及藥敏檢測(cè)，需要臨床醫(yī)生對(duì)本病有更多的認(rèn)識(shí)。

3.5 局限性

本研究在浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬杭州市胸科醫(yī)院進(jìn)行，數(shù)據(jù)無(wú)法完全代表杭州地區(qū)的總體流行病學(xué)，但該院是杭州最大的結(jié)核病定點(diǎn)診治醫(yī)院，對(duì)了解整個(gè)杭州地區(qū)的NTM感染現(xiàn)狀具有一定的代表性；其次，未納入肺外的NTM感染人群，會(huì)導(dǎo)致檢出率的低估；此外，每位患者的環(huán)境因素未納入回顧性研究。

綜上所述，2013—2021年杭州地區(qū)NTM發(fā)病率持續(xù)上升，感染人群以男性、中老年為主，NTM流行菌種以胞內(nèi)分枝桿菌、龜/膿腫分枝桿菌和鳥(niǎo)分枝桿菌為主。由于NTM的發(fā)病率預(yù)計(jì)將持續(xù)增加，因此有必要進(jìn)行前瞻性評(píng)估，并盡早開(kāi)展NTM菌種鑒定，這對(duì)本病的早期診治有重要意義。

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Analysis on the epidemic situation of nontuberculosis mycobacteria pulmonary disease in a general hospital in Hangzhou from 2013 to 2021

HAN Jiaying, QIN Yao, HE Fei

1.Department of Respiratory and Critical Care Medicine, Affiliated Hangzhou Chest Hospital, Zhejiang University School of Medicine, Hangzhou 310003, Zhejiang, China; 2.Department of Tuberculosis, Affiliated Hangzhou Chest Hospital, Zhejiang University School of Medicine, Hangzhou 310003, Zhejiang, China

To analyze the epidemic situation of nontuberculosis mycobacteria (NTM) pulmonary diseases in the tuberculosis designated hospital in Hangzhou city from 2013 to 2021, so as to provide reference for clinical prevention, treatment and epidemiology of NTM disease in Hangzhou city.To collect suspected pulmonary tuberculosis patients admitted to theDepartment ofTuberculosis and Respiratory, Affiliated Hangzhou Chest Hospital, Zhejiang University School of Medicine from 2013 to 2021,who were diagnosed withinfection by acid fast bacilli smears and BACTEC MGIT960, use real-time fluorescent polymerase chain reaction (PCR) to detect the initial flora identification oftuberculosis complex(MTB) and NTM, use HAIN genotyping identification method and DNA microarray technology to identify the strains identified as NTM, and summarize and analyze the relevant data of patients.From 2013 to 2021, 1257 NTM isolates were isolated from 37520 patients, rising from 0.8% in 2013 to 6.7% in 2021. Among patients, 50.76% were male and 49.24% were female. In the age distribution, the middle-aged and elderly patients aged 60-79 years were the most, accounting for 55.0%. Three NTM strains were detected in 2013,including,and/; In 2021, there were 13 NTM strains, with the first three being,and.From 2013 to 2021, the detection rate of NTM in Hangzhou continued to increase. The majority of infected people were men, middle-aged and elderly people aged 60 to 79 years old. The main strains were,mand.

; Nontuberculous mycobacteria; Strain identification; Disease characteristics; Epidemiology

R18；R52

A

10.3969/j.issn.1673-9701.2023.27.002

浙江省中醫(yī)藥科技計(jì)劃項(xiàng)目（2022ZA127）

覃瑤，電子信箱：418497538@qq.com

（2022–12–26）

（2023–09–03）