孫鳳芝 呂珍立 劉福云 邢 強(qiáng) 連姍姍 王 師,2,3 包立隨
(1.中國(guó)海洋大學(xué)海洋生物遺傳學(xué)與育種教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 山東青島 266003; 2.嶗山實(shí)驗(yàn)室海洋生物學(xué)與生物技術(shù)功能實(shí)驗(yàn)室 山東青島 266237; 3.中國(guó)海洋大學(xué)熱帶海洋生物種質(zhì)資源開發(fā)與種業(yè)工程中心 海南三亞 572000; 4.中國(guó)海洋大學(xué)海洋生物多樣性與進(jìn)化研究所 山東青島 266003)
酪蛋白激酶1 (Casein kinase 1,CK1)是生物體內(nèi)一種絲氨酸/蘇氨酸特異性激酶家族, 是最早鑒定的激酶之一, 其在多種動(dòng)物類群中均有報(bào)道。在脊椎動(dòng)物中, 哺乳類共鑒定出7 種CK1家族成員(α、αlike、γ1、γ2、γ3、δ 和ε)以及α、δ、ε 和γ3 的幾種剪接變體(Grossetal, 1998; Knippschildetal, 2005; Fulcheretal, 2020)。在斑馬魚(Daniorerio)中存在6 個(gè)成員(α、γ1、γ2a、γ2b、δ 和ε) (Albornozetal, 2007), 但在無(wú)脊椎動(dòng)物秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans)中發(fā)現(xiàn)了52 個(gè)CK1基因, 其中可能含有很高比例的假基因, 并不行使功能(Manningetal, 2002a, 2002b; Hirstetal, 2020)。所有CK1家族成員在其激酶結(jié)構(gòu)域序列都表現(xiàn)出高度保守性, 經(jīng)典的CK1蛋白激酶基序由序列Ser/Thr-X-X-(X)-Ser/Thr 構(gòu)成(Flotowetal, 1990;Meggioetal, 1992)。它們的差異存在于N 端和C 端的非催化結(jié)構(gòu)域, 其中N 端分子量較小且主要由β-轉(zhuǎn)角組成, C 端分子量較大且主要是由α-螺旋組成。盡管在組織分布和亞細(xì)胞定位方面存在差異, 但CK1基因家族各成員在功能上具有一定的相似性, 主要參與DNA 損傷應(yīng)答和修復(fù)、細(xì)胞增殖和凋亡、胚胎發(fā)育和穩(wěn)態(tài)等重要的生物學(xué)過(guò)程(Cheongetal, 2011)。
CK1激酶家族是面對(duì)應(yīng)激源時(shí)介導(dǎo)細(xì)胞快速、充分進(jìn)行應(yīng)激反應(yīng)的重要介質(zhì)(Knippschildetal, 1997;Xuetal, 2019)。有研究表明, 極端溫度下CK1可以介導(dǎo)Hsp70 和Hsp90 的磷酸化參與組織穩(wěn)態(tài)調(diào)控(Mulleretal, 2013) , 同時(shí)CK1α還參與細(xì)胞程序性凋亡的過(guò)程(Zelenaketal, 2012); 在杜氏利什曼原蟲(Leishmaniadonovani)中,CK1可以磷酸化Hsp23 以維持其溫度應(yīng)激敏感性(Kr?ber-Boncardoetal, 2020);在布氏錐蟲(Trypanosomabrucei)中,CK1能夠與RNA結(jié)合蛋白ZC3H11 發(fā)生作用以應(yīng)對(duì)溫度應(yīng)激和維持細(xì)胞生長(zhǎng)(Miniaetal, 2016)。哺乳動(dòng)物在缺氧應(yīng)激狀態(tài)下,CK1δ能夠?qū)⑷毖跽T導(dǎo)因子(HIF-1α)磷酸化, 以控制HIF-1 的活性從而維持穩(wěn)態(tài)(Kalousietal, 2010)。另外有研究表明, 細(xì)胞處于基因毒性應(yīng)激狀態(tài)時(shí),CK1通過(guò)對(duì)腫瘤抑制因子 p53 的磷酸化作用介導(dǎo)DNA 損傷的修復(fù)(Huartetal, 2009), 這對(duì)于調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)和基因組完整性具有重要作用(Winteretal, 2004;MacLaineetal, 2008)。
扇貝、長(zhǎng)牡蠣等雙殼貝類是我國(guó)的重要經(jīng)濟(jì)貝類,適宜的環(huán)境溫度是維持其正常生命活動(dòng)的必要條件,近年來(lái)夏季海水溫度上升引起高溫應(yīng)激成為導(dǎo)致雙殼貝類出現(xiàn)大規(guī)模死亡的重要原因(Saidetal, 2022)。作為機(jī)體高溫應(yīng)激時(shí)重要的調(diào)節(jié)激酶, 開展雙殼貝類CK1基因的鑒定和研究, 明確其在高溫應(yīng)激時(shí)的表達(dá)規(guī)律, 有助于深入了解其在機(jī)體高溫應(yīng)激的調(diào)節(jié)機(jī)制, 為雙殼貝類良種選育與養(yǎng)殖提供理論基礎(chǔ)。因此, 本研究對(duì)蝦夷扇貝(Patinopectenyessoensis)、櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)、長(zhǎng)牡蠣(Crassostreagigas)和侏儒蛤(Mulinialateralis)等4 種雙殼貝類物種的CK1基因家族進(jìn)行了全基因組鑒定和特征分析。通過(guò)結(jié)構(gòu)比對(duì)和時(shí)空表達(dá)分析探究雙殼貝類中CK1蛋白結(jié)構(gòu)、表達(dá)模式和高溫應(yīng)激反應(yīng)規(guī)律。這是首次對(duì)雙殼貝類動(dòng)物中CK1基因家族的系統(tǒng)篩查和特征描述研究, 為深刻理解雙殼貝類CK1的基因特性、進(jìn)化關(guān)系和調(diào)控功能提供了重要的研究基礎(chǔ)。
為了鑒定雙殼貝類CK1家族成員基因, 在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)、Uniprot (https://www.uniprot.org/)和ENSEMBL (http://ensemblgenomes.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)中下載代表性的脊椎動(dòng)物: 人(Homosapiens)、小鼠(Musmusculus)、非洲爪蟾(Xenopuslaevis)、斑馬魚(D.rerio)和無(wú)脊椎動(dòng)物秀麗隱桿線蟲(C.elegans)的全長(zhǎng)CK1 蛋白序列(表1), 將以上蛋白序列與四種雙殼貝類的基因組和轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行比對(duì)以鑒定CK1家族基因(e<1×10–5) (Altschuletal, 1990)。為了確保CK1基因家族鑒定的完整性, 通過(guò)HMM 搜索方法(http://www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer/search/phmmer) 進(jìn)行序列分析, 并對(duì)所有潛在的雙殼貝類CK1 蛋白的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行了比對(duì)。
表1 分析所用蛋白序列注冊(cè)號(hào)Tab.1 The accession numbers of proteins used for analysis
將候選的雙殼貝類CK1家族成員序列提交給ORF Finder 程序(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)預(yù)測(cè)ORF (開放閱讀框), 并將預(yù)測(cè)的ORF 翻譯成氨基酸序列。使用SMART (Letunicetal, 2021)程序(http://smart.embl-heidelberg.de/)對(duì)翻譯后的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行CK1 保守結(jié)構(gòu)域的識(shí)別。Sequence Manipulation Suite 工具(http://www.bioinformatics.org/sms2/color_align_cons.html)用于序列比對(duì)分析, ProtParam(Wilkinsetal, 1999)工具(https://web.expasy.org/ protparam/)用來(lái)預(yù)測(cè)等電點(diǎn)(PI)、分子量(MV)不穩(wěn)定指數(shù)(Instability index)和疏水性(Gravy)。用IBS1.0.3(Liuetal, 2015)軟件繪制了所有已鑒定的CK1 基因家族成員的蛋白結(jié)構(gòu)。使用SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org)對(duì)所有雙殼貝類CK1 基因家族成員進(jìn)行蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)。
在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)、Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)和Ensembl 數(shù)據(jù)庫(kù)中下載人(H.sapiens)、小鼠(M.musculus)、非洲爪蟾(X.laevis)、青鳉 魚(Oryziaslatipes)、斑馬魚(D.rerio)、海鞘(Cionaintestinalis)、文昌魚(Branchiostoma floridae)、光滑雙臍螺(Biomphalariaglabrata)、赤擬谷盜(Triboliumcastaneum)、秀麗隱桿線蟲(C.elegans)和柱狀珊瑚(Stylophorapistillata)共11 個(gè)物種的CK1蛋白全長(zhǎng)序列(表1), 與鑒定到的4 種雙殼貝類的CK1 蛋白全長(zhǎng)序列共同用于構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹, 使用MEGA7(Kumaretal, 2016)軟件中的ClustalW(Larkinetal, 2007)方法進(jìn)行多序列比對(duì), 使用NJ 方法對(duì)CK1 進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生樹構(gòu)建, Bootstrap 法進(jìn)行重復(fù)檢驗(yàn),重復(fù)1 000 次。使用iTOL 進(jìn)行優(yōu)化與展示。
為了進(jìn)行表達(dá)分析, 從已發(fā)表的蝦夷扇貝(Wangetal, 2017)、櫛孔扇貝(Lietal, 2017)、長(zhǎng)牡蠣(Zhanget al, 2012)和侏儒蛤(實(shí)驗(yàn)室未發(fā)表數(shù)據(jù))的不同胚胎發(fā)育階段和成體組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中計(jì)算CK1基因家族的表達(dá)量TPM (Transcript per Million)值。其中胚胎發(fā)育階段包括受精卵、多細(xì)胞、囊胚、原腸胚、擔(dān)輪幼蟲、D 型幼蟲、殼頂幼蟲前期、殼頂幼蟲中期、殼頂幼蟲后期、匍匐幼蟲、稚貝; 成體組織包括肝胰腺、鰓、外套膜、肌肉、雄性性腺和雌性性腺。為了可視化CK1基因家族在四種雙殼貝類動(dòng)物中的表達(dá)模式,通過(guò)R 軟件包進(jìn)行繪制熱圖。
利用R 中的WGCNA 軟件包(Langfelderetal,2008)構(gòu)建了雙殼貝類個(gè)體發(fā)育的基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò),蝦夷扇貝、櫛孔扇貝、長(zhǎng)牡蠣和侏儒蛤分別有20 418、22 179、23 573、22 941 個(gè)基因參與構(gòu)建基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò), 基因模塊最小基因數(shù)為300?;蚬脖磉_(dá)網(wǎng)絡(luò)不同模塊使用不同顏色進(jìn)行標(biāo)記, 未分配的基因用灰色標(biāo)記, 模塊中基因的關(guān)鍵程度通過(guò)計(jì)算模塊內(nèi)基因連通度來(lái)決定, 并對(duì)CK1家族成員所在模塊進(jìn)行連通度以及KEGG 富集分析。
采集活性好的40 只2 齡蝦夷扇貝個(gè)體進(jìn)行高溫應(yīng)激實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)前, 將所有個(gè)體隨機(jī)平分成兩個(gè)平行組, 并在實(shí)驗(yàn)室分開暫養(yǎng)7 d, 使其適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室養(yǎng)殖環(huán)境, 期間水溫維持在10 °C, 每天換水1/2, 投喂扁藻等單胞藻, 投餌量為5×104ind./mL。實(shí)驗(yàn)時(shí), 將兩個(gè)平行組個(gè)體由10 °C 暫養(yǎng)水體分別同時(shí)迅速轉(zhuǎn)移至兩個(gè)23 °C 水體當(dāng)中(充足供氧)。在溫度驟變后的0、3、6、12 和24 h 分別從兩個(gè)平行組中隨機(jī)取3 只蝦夷扇貝, 迅速解剖并收集其鰓, 組織分離后立刻使用液氮冷凍, –80 °C 保存以備總RNA 的提取。
使用實(shí)驗(yàn)室前期發(fā)表RNA 提取方法(Huetal,2006), 從采樣的蝦夷扇貝的鰓中提取總RNA, 然后用DNaseI 消化。使用Nanovue Plus 分光光度計(jì)測(cè)定RNA 的濃度和純度, 通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳評(píng)估RNA的完整性。使用莫洛尼小鼠白血病病毒(MMLV)逆轉(zhuǎn)錄酶在20 μL 的體系中合成第一鏈cDNA, 每個(gè)樣本總RNA 含量 2 μg 作為模板, 0.5 mg 的Oligo(dT)18作為引物?;旌象w系在65 °C 下變性5 min, 然后在冰上立即冷卻。加入反轉(zhuǎn)錄酶、反應(yīng)緩沖液和dNTPs 后,在以下條件下擴(kuò)增 cDNA: 42 °C 90 min, 72 °C 10 min。將cDNA 稀釋至10 ng/μL, 保存在–20 °C, 作為qPCR 的模板。EF1A被用作反應(yīng)所需的內(nèi)參基因(Santerreetal, 2013; Lietal, 2016), 所有引物都是用Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)的, 使用BLASTN (1×10–10)將所設(shè)計(jì)的引物與蝦夷扇貝基因組進(jìn)行比較以驗(yàn)證其特異性, 并列于表2。使用LightCycler 480 實(shí)時(shí)定量PCR 儀(Roche)進(jìn)行擴(kuò)增。
表2 蝦夷扇貝CK1 基因及內(nèi)參基因引物序列Tab.2 Sequences of primers for CK1 gene and internal reference gene of P.yessoensis
實(shí)時(shí)定量PCR 反應(yīng)過(guò)程如下: 取2 μL cDNA 作為反應(yīng)模板, 加入10 μL SYBR Green I Real-time PCR Master Mix, 上、下游引物(2 μmol/L)各4 μL, 最終得到20 μL 的反應(yīng)體系。反應(yīng)程序如下: 95 °C 10 min; 95 °C 15 s, 53 °C 60 s, 40 個(gè)循環(huán); 95 °C 15 s, 1 個(gè)循環(huán)。進(jìn)一步通過(guò)熔解曲線驗(yàn)證引物特異性, 使用2–ΔΔCt的方法計(jì)算CK1基因的相對(duì)表達(dá)量?;诟骰虻南鄬?duì)表達(dá)水平,使用SPSS 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析, 使用獨(dú)立t 檢驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)軟件包, 分析各CK1基因表達(dá)變化的規(guī)律。
通過(guò)多物種、多組學(xué)的系統(tǒng)比對(duì)策略, 從蝦夷扇貝、櫛孔扇貝、長(zhǎng)牡蠣、侏儒蛤的全基因組中均鑒定出4 個(gè)CK1家族成員, 包括CK1α,CK1αlike,CK1δ,CK1γ3, 并發(fā)現(xiàn)CK1ε,CK1γ1,CK1γ2在雙殼貝類中發(fā)生了丟失。根據(jù)CK1 蛋白結(jié)構(gòu)(表3), CK1δ 和CK1γ3氨基酸序列長(zhǎng)度(>400 aa)明顯大于CK1α 和CK1αlike(300~400 aa)。各CK1 家族成員均是疏水性蛋白質(zhì)且穩(wěn)定性較好。另外, 蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)信息顯示, 除了CgCK1δ 中的α-螺旋數(shù)目最多,其他的蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中的無(wú)規(guī)卷曲的數(shù)目最多, 其次是α-螺旋數(shù)目, β-折疊和β-轉(zhuǎn)角的數(shù)目相似。通過(guò)對(duì)雙殼貝類CK1 的保守結(jié)構(gòu)域的多重序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)CK1 最佳的磷酸化基序均為T-G-T (圖1)。
圖1 雙殼貝類CK1 蛋白序列比對(duì)Fig.1 CK1 protein sequences alignment in four bivalve species
表3 雙殼貝類CK1 基因家族特征總結(jié)Tab.3 Summary in characteristics of CK1 gene family in four bivalves
4 種雙殼貝類動(dòng)物的CK1 均包括一個(gè)分子量較小的N 端, 主要由β-折疊組成, 和一個(gè)分子量較大的C端、主要由α-螺旋狀組成。其中N-末端的分子量范圍0.95~5.80 kDa, C-末端的分子量范圍4.57~22.77 kDa。保守結(jié)構(gòu)域分子量范圍28.20~31.16 kDa, 其中雙殼貝類CK1α 保守結(jié)構(gòu)域分子量范圍為30.87~30.92 kDa,CK1αlike 保守結(jié)構(gòu)域分子量范圍為30.87~30.99 kDa,CK1δ 保守結(jié)構(gòu)域分子量范圍為 29.99~31.16 kDa,CK1γ3 保守結(jié)構(gòu)域分子量范圍為28.2~29.97 kDa, 是保守結(jié)構(gòu)域分子量最小的家族成員(圖2)。各CK1 蛋白的序列存在差異, 但它們的蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)具有相似性(圖3)。
圖2 雙殼貝類CK1 蛋白結(jié)構(gòu)域Fig.2 Structure of CK1 proteins in four bivalve species
圖3 雙殼貝類CK1 蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.3 Tertiary structure prediction of CK1 proteins in four bivalve species
為了確定雙殼貝類CK1基因的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系,我們構(gòu)建了15 種物種的CK1系統(tǒng)發(fā)生樹(圖4)。系統(tǒng)發(fā)育分析表明, 所有的CK1基因被細(xì)分為7 個(gè)成員簇, 包括CK1α,CK1αlike,CK1δ,CK1ε,CK1γ1,CK1γ2,CK1γ3, 且都按照成員分類聚在一起。在每個(gè)成員聚類過(guò)程中, 原口動(dòng)物與后口動(dòng)物分別產(chǎn)生了獨(dú)立進(jìn)化枝, 其中在軟體動(dòng)物形成的相對(duì)獨(dú)立的進(jìn)化枝中,蝦夷扇貝的CK1基因和櫛孔扇貝的CK1基因都具有最近的親緣關(guān)系, 同時(shí)與長(zhǎng)牡蠣、侏儒蛤存在相對(duì)較近的親緣關(guān)系, 符合物種之間的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系。
圖4 CK1 基因家族系統(tǒng)發(fā)生樹Fig.4 The phylogenetic tree of CK1 gene family
基于雙殼貝類胚胎發(fā)育各時(shí)期的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析(圖5a), 所有雙殼貝類CK1基因均在擔(dān)輪幼蟲時(shí)期之前呈現(xiàn)出不同水平的高表達(dá)。其中PyCK1αlike、PyCK1δ、PyCK1γ3、CfCK1δ、CfCK1γ3、CgCK1δ、CgCK1γ3、MlCK1α、MlCK1δ、MlCK1γ3、主要在受精卵到多細(xì)胞期具有相對(duì)較高的表達(dá)量, 并在囊胚期的表達(dá)量下降;CgCK1α、MlCK1αlike在多細(xì)胞期開始具有較高的表達(dá)量,CgCK1α在原腸胚期表達(dá)量開始下降, 而MlCK1αlike在囊胚和原腸胚期的表達(dá)量相對(duì)較低, 在擔(dān)輪幼蟲期表達(dá)量再次上升;PyCK1α、CfCK1α在囊胚期至擔(dān)輪幼蟲期具有相對(duì)較高的表達(dá)量, 其中原腸胚時(shí)期達(dá)到最高, 從擔(dān)輪幼蟲期開始其表達(dá)量開始逐漸下降;CfCK1αlike、CgCK1αlike從囊胚到擔(dān)輪幼蟲期有相對(duì)較高的表達(dá)量, 在原腸胚時(shí)期具有最高表達(dá)量。
圖5 雙殼貝類CK1 基因家族時(shí)空表達(dá)譜Fig.5 Spatio-temporal expression profiles of CK1 family genes in four bivalve species
對(duì)CK1家族基因在雙殼貝類成體組織中的表達(dá)分析顯示(圖5b),不同的基因在成體組織中的表達(dá)模式較為多樣, 其中PyCK1αlike、PyCK1δ、PyCK1γ3、CfCK1αlike、CfCK1δ、CgCK1δ、CgCK1γ3、MlCK1αlike、MlCK1δ、MlCK1γ3在雙殼貝類的鰓中表達(dá)量明顯高于其他組織。另外PyCK1α、CfCK1α、CfCK1γ3、CgCK1α和MlCK1α表達(dá)模式相似, 均在雙殼貝類的雄性性腺中具有最高的表達(dá)量。而值得注意的是,CgCK1αlike在長(zhǎng)牡蠣的肌肉中具有最高的表達(dá)量。
我們構(gòu)建了蝦夷扇貝、櫛孔扇貝、長(zhǎng)牡蠣和侏儒蛤個(gè)體發(fā)育時(shí)期的基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)(圖6a), 網(wǎng)絡(luò)模塊數(shù)目分別為12、14、9 和10 個(gè), 將模塊中的前10% 連通度的基因定義為關(guān)鍵基因。在蝦夷扇貝中PyCK1αlike、PyCK1δ和PyCK1γ3劃分在turquoise 模塊(PyM1), 其中PyCK1δ是該模塊的關(guān)鍵基因,PyCK1α在yellow模塊(PyM2); 在櫛孔扇貝中CfCK1α和CfCK1αlike在brown 模塊(CfM1),CfCK1δ和CfCK1γ3分別被劃分至yellow (CfM2)和pink (CfM3)模塊, 均為關(guān)鍵基因;在長(zhǎng)牡蠣中CgCK1α和CgCK1αlike劃分在blue 模塊(CgM1)且為關(guān)鍵基因,CgCK1δ和CgCK1γ3在yellow模塊(CgM2)。在侏儒蛤中MlCK1α、MlCK1δ和MlCK1γ3劃分在yellow 模塊(MlM1),MlCK1αlike是侏儒蛤網(wǎng)絡(luò)turquoise 模塊(MlM2)的關(guān)鍵基因。對(duì)CK1為關(guān)鍵基因的模塊(PyM1、CfM2、CfM3、CgM1、MlM2)進(jìn)行KEGG 功能富集分析結(jié)果顯示,PyCK1δ、CfCK1δ、CgCK1α和CgCK1αlike在胚胎發(fā)育時(shí)期除了DNA 復(fù)制、RNA 轉(zhuǎn)運(yùn)和降解等基本生物過(guò)程, 還參與了堿基切除修復(fù)、核苷酸切除修復(fù)以及錯(cuò)配修復(fù)等與DNA 損傷修復(fù)相關(guān)的過(guò)程。CfCK1γ3主要參與了核糖體過(guò)程,MlCK1αlike參與調(diào)控蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、MAPK 信號(hào)通路、鈣信號(hào)通路和Wnt 信號(hào)通路。
圖6 雙殼貝類個(gè)體發(fā)育的基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)及KEGG 富集Fig.6 Gene co-expression network and KEGG enrichment in individual development
本研究采用qPCR 方法, 在蝦夷扇貝受到高溫應(yīng)激后0、3、6、12 和24 h 檢測(cè)鰓中CK1基因的表達(dá)水平變化(圖7), 其中誤差線表示平均值±SE (n=6)。結(jié)果顯示,PyCK1α、PyCK1αlike和PyCK1δ在高溫應(yīng)激后總體表達(dá)趨勢(shì)相似, 均在應(yīng)激3 h 時(shí)顯著上調(diào)(分別為0 h 的1.08、1.50、2.39 倍,P<0.05),PyCK1α在應(yīng)激6 h 時(shí)持續(xù)上調(diào)達(dá)到最高值, 隨后表達(dá)量開始下降并于24 h 時(shí)顯著低于0 h (P<0.05)。而PyCK1αlike和PyCK1δ從應(yīng)激3 h 后表達(dá)量開始有所下降, 12 h和24 h 時(shí)相對(duì)表達(dá)量均低于0 h, 在24 h 時(shí)下調(diào)最為顯著(PyCK1αlikeP<0.05,PyCK1δP<0.01)。值得注意的是PyCK1γ3 顯示出不同的響應(yīng)模式, 在應(yīng)激后不同時(shí)間點(diǎn)的相對(duì)表達(dá)量均呈現(xiàn)了下調(diào)趨勢(shì), 3 h、6 h、12 h 和24 h 的相對(duì)表達(dá)量均低于0 h, 并在12 h 和24 h 時(shí)顯著下調(diào)(P<0.05)。
圖7 高溫應(yīng)激后CK1 基因在蝦夷扇貝鰓中表達(dá)情況Fig.7 Gene expression profiling of CK1 genes in the gill after heat stress treatment
本研究聯(lián)合基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對(duì)4 種雙殼貝類CK1基因家族進(jìn)行了全基因組鑒定, 并探究了其時(shí)空表達(dá)特征和高溫應(yīng)激條件下的表達(dá)規(guī)律。雙殼貝類CK1基因均在擔(dān)輪幼蟲時(shí)期之前有相對(duì)較高的表達(dá), 其中PyCK1αlike、PyCK1δ、PyCK1γ3、CfCK1δ、CfCK1γ3、CgCK1δ、CgCK1γ3、MlCK1α、MlCK1δ、MlCK1γ3在受精卵中呈現(xiàn)相對(duì)較高的表達(dá)量, 可能是來(lái)自于母源性mRNA, 并在囊胚或原腸胚時(shí)期基本降解完全;PyCK1α、CfCK1α、CfCK1αlike、CgCK1α、CgCK1αlike、MlCK1αlike在多細(xì)胞或囊胚時(shí)期開始具有相對(duì)較高的表達(dá)量, 具有合子表達(dá)特征。Albornoz等(2007)在研究CK1基因家族在斑馬魚胚胎發(fā)育時(shí)期的表達(dá)模式中也發(fā)現(xiàn)類似規(guī)律, 除了CK1ε,其他CK1基因在胚胎發(fā)育的早期階段普遍表達(dá), 并且具有母源和合子表達(dá)的特征。
PyCK1δ、CfCK1δ、CgCK1α、CgCK1αlike顯著富集到修復(fù)DNA 損傷的相關(guān)通路, 暗示了雙殼貝類胚胎早期細(xì)胞分裂與DNA 復(fù)制活動(dòng)旺盛,CK1家族基因的高表達(dá)可能對(duì)于其維持正常細(xì)胞周期活動(dòng)、DNA 修復(fù)等具有重要作用。Puigvert 等(2013)研究發(fā)現(xiàn)CK1α可以通過(guò)磷酸化作用調(diào)控促凋亡和抗凋亡信號(hào)途徑競(jìng)爭(zhēng)以響應(yīng)DNA 損傷來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞存活。另外,CK1δ在DNA 修復(fù)和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)中起著重要作用(Knippschildetal, 2014), Greer 等(2017)研究發(fā)現(xiàn)CK1δ的表達(dá)有助于DNA 損傷的有效修復(fù)和維持有絲分裂檢查點(diǎn)的正常功能。另外有研究表明,CK1α可以通過(guò)磷酸化Wnt 受體相關(guān)蛋白Dvl 增加與Wnt受體的親和力來(lái)完成對(duì)細(xì)胞行為和細(xì)胞命運(yùn)的嚴(yán)格控制, 從而維持正常的胚胎發(fā)育(Cruciat, 2014;Banerjeeetal, 2019; Lauetal, 2019)。而MlCK1αlike在Wnt 相關(guān)通路的顯著富集也印證了以上發(fā)現(xiàn)。
在成體組織中,PyCK1αlike、PyCK1δ、PyCK1γ3、CfCK1αlike、CfCK1δ、CgCK1δ、CgCK1γ3、MlCK1αlike、MlCK1δ和MlCK1γ3在鰓中有較高的表達(dá)。纖毛是雙殼貝類動(dòng)物的鰓行使呼吸、營(yíng)養(yǎng)吸收等重要生理功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)(Gómez-Mendikuteetal,2005)。有研究表明,CK1激酶能夠通過(guò)調(diào)節(jié)I1 dynein的保守調(diào)節(jié)因子維持纖毛的正常活動(dòng)(Fuetal,2018)。CK1在雙殼貝類鰓中普遍的高表達(dá)現(xiàn)象可能對(duì)維持其纖毛的正常生理活動(dòng)有重要的作用。另一方面,CK1基因家族在細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)中具有突出貢獻(xiàn),雙殼貝類生存環(huán)境復(fù)雜, 鰓絲作為雙殼貝類與外界直接接觸的器官之一, 外界的有害刺激會(huì)直接影響鰓細(xì)胞的狀態(tài)和活力(Nogueiraetal, 2013)。故推測(cè)CK1在鰓中的高表達(dá)可能對(duì)于其抵御外界不良刺激具有重要的意義。PyCK1α、CfCK1α、CfCK1γ3、CgCK1α和MlCK1α在雄性性腺中具有最高的表達(dá)量。有研究表明,CK1可以通過(guò)磷酸化作用促進(jìn)減數(shù)分裂過(guò)程的同源重組(Sakunoetal, 2015)。它們可能在雙殼貝類精子細(xì)胞的減數(shù)分裂過(guò)程中調(diào)節(jié)染色體行為。值得注意的是, 雖然4 種雙殼貝類之間整體CK1基因的表達(dá)趨勢(shì)相似, 但仍存在強(qiáng)烈的物種特異性, 這可能反映了4 個(gè)物種的適應(yīng)性差異。例如,雖然CgCK1αlike在長(zhǎng)牡蠣肌肉中表達(dá)最高, 但在其他貝類的肌肉中幾乎沒(méi)有表達(dá)。這可能與長(zhǎng)牡蠣在潮間帶中的附著生活方式密切相關(guān),CgCK1αlike或參與氧化應(yīng)激反應(yīng)以避免肌肉萎縮(Ohetal, 2021)。
Nielsen 等(2021)通過(guò)對(duì)北極潮間帶貽貝(Mytilus edulis)高溫應(yīng)激實(shí)驗(yàn)明確了高溫可以激發(fā)細(xì)胞產(chǎn)生熱休克蛋白以增加細(xì)胞抵抗能力, Muller 等(2013)發(fā)現(xiàn)CK1基因可以磷酸化Hsp70 和Hsp90 維持細(xì)胞蛋白的折疊和降解的平衡。這或許暗示著PyCK1α、PyCK1αlike 和PyCK1δ參與磷酸化熱激蛋白來(lái)響應(yīng)高溫應(yīng)激反應(yīng)。另一方面, 也有研究表明高溫應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致DNA 損傷(Chengetal, 2018),PyCK1α、PyCK1αlike和PyCK1δ可能參與高溫應(yīng)激引起的DNA 損傷反應(yīng)。有研究表明,CK1γ3活性的下降, 能夠減少細(xì)胞壞死性凋亡(Leeetal, 2019), 故推測(cè)PyCK1γ3在高溫應(yīng)激條件下的表達(dá)下調(diào), 有利于維持鰓細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)從而避免細(xì)胞發(fā)生壞死性凋亡。持續(xù)的高溫應(yīng)激條件下,會(huì)使蝦夷扇貝的細(xì)胞生存狀態(tài)遭到破壞,PyCK1表達(dá)量開始下降。以上結(jié)果暗示了CK1是參與細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)的重要基因, 參與了蝦夷扇貝處于高溫環(huán)境時(shí)的應(yīng)激反應(yīng)。
本研究首次系統(tǒng)鑒定了蝦夷扇貝、櫛孔扇貝、長(zhǎng)牡蠣和侏儒蛤4 種雙殼貝類中的CK1基因, 包括CK1α、CK1αlike、CK1δ和CK1γ3, 并全面分析了其蛋白結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)性質(zhì)以及系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系。通過(guò)胚胎、組織轉(zhuǎn)錄組分析和高溫應(yīng)激實(shí)驗(yàn)探究了雙殼貝類CK1基因家族的時(shí)空表達(dá)和高溫應(yīng)激條件下的表達(dá)規(guī)律。結(jié)果表明, 雙殼貝類CK1可能參與維持早期胚胎發(fā)育的基因組穩(wěn)定性和成體組織穩(wěn)態(tài)。此外,CK1基因家族在高溫應(yīng)激反應(yīng)中的潛在響應(yīng)機(jī)制也得到了細(xì)致的描述。本研究結(jié)果為更好地理解雙殼貝類動(dòng)物CK1基因家族的進(jìn)化關(guān)系、發(fā)育調(diào)節(jié)和應(yīng)激反應(yīng)機(jī)制奠定重要研究基礎(chǔ)。