微RNA-223在慢性阻塞性肺疾病血清外泌體中的表達(dá)

任明慧

作者單位：濟(jì)寧市第一人民醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)科，山東 濟(jì)寧272000

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是常見(jiàn)的呼吸系統(tǒng)疾病，主要表現(xiàn)為咳嗽、咳痰、氣促、喘息、胸悶、疲乏等癥狀，有慢性致殘、反復(fù)發(fā)作的特點(diǎn)，且肺功能不可逆轉(zhuǎn)，嚴(yán)重時(shí)可發(fā)展為肺心病與呼吸衰竭，給病人身心健康帶來(lái)很大影響［1-2］。因此，對(duì)COPD病人早期診斷、判斷病情具有重要意義。外泌體（exosomes）是細(xì)胞外囊泡，可攜帶多種蛋白質(zhì)、脂類(lèi)和核酸，可在細(xì)胞間進(jìn)行信息傳遞，在免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)等過(guò)程中發(fā)揮重要作用［3］。微RNA（microRNA，miRNA）有多種生理學(xué)功能，可參與COPD、肺結(jié)核、哮喘、肺癌等肺部疾病的發(fā)病過(guò)程［4］。miRNA-223在先天免疫、炎癥反應(yīng)等多種生理病理過(guò)程中具有關(guān)鍵作用，與多種炎癥性疾病有關(guān)［5］。在肺結(jié)核大鼠中，過(guò)表達(dá)miR-223可抑制STAT3信號(hào)通路增強(qiáng)肺泡巨噬細(xì)胞的吞噬能力［6］。miRNA-223在COPD病人肺組織、COPD小鼠模型中miR-223的表達(dá)水平升高，體外實(shí)驗(yàn)顯示，在肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中miR-223靶向組蛋白去乙?；?（HDAC2）調(diào)控趨化因子水平，參與COPD的炎癥反應(yīng)［7］。以上表明，miRNA-223在肺部疾病中發(fā)揮重要作用，miRNA-223在COPD病人血清外泌體中的研究尚未見(jiàn)報(bào)道，本研究檢測(cè)COPD病人血清外泌體中miRNA-223表達(dá)情況，探討miRNA-223表達(dá)與COPD疾病嚴(yán)重程度相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2019年3月至2021年6月在濟(jì)寧市第一人民醫(yī)院呼吸科治療的穩(wěn)定期COPD病人113例作為觀察對(duì)象（COPD組），其中男67例，女46例，年齡范圍為38～74歲，年齡（57.20±11.50）歲。根據(jù)肺功能將COPD病人分為輕度組40例、中度組31例、重度組25例和極重度組17例。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合2013年中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)COPD診斷標(biāo)準(zhǔn)［8］；（2）病人臨床資料完整；（3）病人近期未使用相關(guān)藥物進(jìn)行治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）急性肺栓塞、肺結(jié)核、哮喘、肺癌等其他呼吸系統(tǒng)疾病的病人；（2）合并肝腎功能不全、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等自身免疫系統(tǒng)疾病及其他系統(tǒng)炎癥性疾病病人；（3）合并高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病病人；（4）合并其他腫瘤病人；（5）孕婦或產(chǎn)婦；（6）癡呆、認(rèn)知功能障礙的病人。

另選取同期在濟(jì)寧市第一人民醫(yī)院體檢的100例健康體檢人員作為對(duì)照組，其中男59例，女41例，年齡范圍為40～76歲，年齡（56.80±11.30）歲。兩組男女比例（P=0.965）、年齡（t=0.26，P=0.799）比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具可比性。

本研究中病人或其近親屬知情同意，并簽署知情同意書(shū)。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.2 主要試劑與儀器 人C反應(yīng)蛋白（C-reactive protein，CRP）（EK194）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）（EK182）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）（EK106）檢測(cè)試劑盒購(gòu)自聯(lián)科生物科技有限公司，兔抗人CD63、CD9、TSG101多克隆抗體購(gòu)自Elabsceience公司，Trizol試劑、外泌體提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScriptTMRT reagent kit）、miScript SYBR Green PCR Kit購(gòu)自Takara公司。PowerCyclerPCR儀購(gòu)自德國(guó)Analytikjena公司，JEM-2100透射電子顯微鏡購(gòu)自日本JEOL公司，P800型全自動(dòng)生化分析儀購(gòu)自羅氏公司。

1.3 研究方法

1.3.1 血清外泌體的提取與鑒定 分別采集COPD病人和健康體檢人員空腹內(nèi)靜脈血5 mL，室溫下以3 000g離心30 min，然后再以16 000g離心15 min，分離血清，置于-80 ℃冰箱保存。采用外泌體提取試劑盒提取血清中外泌體，按照試劑盒操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，電鏡觀察外泌體形態(tài)，采用蛋白質(zhì)印跡法鑒定外泌體表面蛋白CD63及CD9。

1.3.2 血清外泌體miRNA-223水平檢測(cè) 采用RT-qPCR檢測(cè)血清外泌體miRNA-223相對(duì)表達(dá)量。Trizol試劑提取血清外泌體總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA后，進(jìn)行RT-qPCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性600 s；95 ℃變性75 s，65 ℃退火60 s，72 ℃延伸15 s，40個(gè)循環(huán)。miRNA-223正向引物序列（5′-3′）：CGTGTATTTGACAAGCTG，反向引物序列（5′-3′）：GAACATGTCTGCGTATCTC；U6正向引物序列（5′-3′）：CTCGCTTCGGCAGCACAT，反向引物序列（5′-3′）：TTTGCGTGTCATCCTTGCG。以對(duì)照組人員血清為對(duì)照，校正每個(gè)樣本外泌體數(shù)量，以U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算外泌體miRNA-223相對(duì)表達(dá)量。

1.3.3 肺功能指標(biāo)及炎性因子水平檢測(cè) 肺功能指標(biāo)：對(duì)所有觀察者進(jìn)行肺功能檢測(cè)，采用肺功能檢測(cè)儀檢測(cè)靜息狀態(tài)下第1秒用力呼氣容積（forced expiratory volume in 1 second，F(xiàn)EV1）、FEV1占預(yù)計(jì)值百分比（FEV1%pred）、FEV1占用力肺活量（forced vital capacity，F(xiàn)VC）百分比（FEV1/FVC）。

采用酶聯(lián)免疫吸附（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法檢測(cè)血清炎性因子CRP、TNF-α、IL-6水平，檢測(cè)下限分別為0.44 ng/L、0.42 ng/L、0.37 ng/L，具體操作參照其試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 利用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料符合正態(tài)分布，以表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)；采用Pearson分析COPD病人血清外泌體miRNA-223與TNF-α、IL-6、CRP、FEV1%pred、FEV1、FEV1/FVC相關(guān)性。若P＜0.05，表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 COPD組與對(duì)照組肺功能指標(biāo)比較 COPD組病人肺功能指標(biāo)FEV1%pred、FEV1、FEV1/FVC顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 COPD組與對(duì)照組肺功能指標(biāo)比較/

表1 COPD組與對(duì)照組肺功能指標(biāo)比較/

注：FEV1為第1秒用力呼氣容積，F(xiàn)EV1%pred為FEV1占預(yù)計(jì)值百分比，F(xiàn)EV1/FVC為FEV1占用力肺活量百分比。

FEV1/L 2.83±0.44 1.77±0.62 14.22＜0.001組別對(duì)照組COPD組t值P值例數(shù)100 113 FEV1%pred 101.87±12.45 62.05±11.38 24.38＜0.001 FEV1/FVC/%86.47±8.08 64.01±11.52 16.27＜0.001

2.2 血清外泌體提取與鑒定 電鏡下結(jié)果顯示，血清外泌體為圓形或橢圓形囊泡狀結(jié)構(gòu)，直徑約100 nm；蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示，對(duì)照組與COPD組外泌體均表達(dá)特異性蛋白CD63、CD9、TSG101，見(jiàn)圖1。說(shuō)明成功提取血清外泌體，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 血清外泌體的鑒定：A為電鏡下顯示外泌體為圓形或橢圓形囊泡狀結(jié)構(gòu)，直徑約100 nm；B為對(duì)照組與COPD組外泌體CD63、CD9、TSG101蛋白表達(dá)

2.3 COPD組與對(duì)照組血清外泌體miRNA-223表達(dá)及炎性因子水平比較 與對(duì)照組比較，COPD組病人血清外泌體miRNA-223、TNF-α、IL-6、CRP水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 COPD組與對(duì)照組血清外泌體miRNA-223表達(dá)及炎性因子水平比較/

表2 COPD組與對(duì)照組血清外泌體miRNA-223表達(dá)及炎性因子水平比較/

注：COPD為慢性阻塞性肺疾病，miRNA-223為微RNA-223，TNF-α為腫瘤壞死因子α，IL-6為白細(xì)胞介素6，CRP為C-反應(yīng)蛋白。

CRP/（mg/L）1.35±0.47 6.72±1.21 41.68＜0.001組別對(duì)照組COPD組t值P值例數(shù)100 113 miRNA-223 1.01±0.12 3.05±0.47 42.19＜0.001 TNF-α/（ng/L）2.83±0.81 5.23±1.14 17.50＜0.001 IL-6/（ng/L）2.47±0.58 5.43±1.05 25.01＜0.001

2.4 不同嚴(yán)重程度COPD病人血清外泌體miRNA-223水平及炎性因子比較 結(jié)果顯示，輕度、中度、重度、極重度COPD病人血清外泌體miRNA-223表達(dá)水平依次升高，組內(nèi)兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；重度、極重度COPD病人血清TNF-α、IL-6、CRP水平顯著高于輕、中度病人（P＜0.05），輕度與中度、重度與極重度COPD病人之間血清TNF-α、IL-6、CRP水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表3。

表3 不同嚴(yán)重程度COPD病人血清外泌體miRNA-223水平比較/

表3 不同嚴(yán)重程度COPD病人血清外泌體miRNA-223水平比較/

注：miRNA-223為微RNA-223，TNF-α為腫瘤壞死因子α，IL-6為白細(xì)胞介素-6，CRP為C反應(yīng)蛋白。①與輕度組比較，P＜0.05。②與中度組比較，P＜0.05。③與重度組比較，P＜0.05。

組別輕度組中度組重度組極重度組F值P值CRP/（mg/L）6.20±1.05 6.45±1.21 7.16±0.95①②7.78±1.13①②10.42＜0.001例數(shù)40 31 25 17 miRNA-223 2.62±0.25 2.89±0.32①3.21±0.39①②3.52±0.40①②③36.18＜0.001 TNF-α/（ng/L）4.83±0.81 5.12±0.92 5.62±0.85①②5.75±0.91①②6.76＜0.001 IL-6/（ng/L）4.89±0.88 5.25±0.82 5.87±0.91①②6.44±0.93①②15.16＜0.001

2.5 COPD病人血清外泌體miRNA-223與炎性因子及肺功能指標(biāo)相關(guān)性 相關(guān)性分析顯示，COPD病人血清外泌體miRNA-223水平與TNF-α、IL-6、CRP水平呈正相關(guān)，與FEV1%pred 、FEV1、FEV1/FVC呈負(fù)相關(guān)（均P＜0.05），見(jiàn)表4。

表4 COPD病人血清外泌體miRNA-223與炎性因子及肺功能指標(biāo)相關(guān)性分析結(jié)果

3 討論

COPD主要為各種因素引起的肺部持續(xù)性的異常慢性炎癥反應(yīng)，其中TNF-α、IL-6、CRP為炎性因子，是評(píng)價(jià)COPD病人病情及炎癥程度的標(biāo)志物［9］；FEV1%pred、FEV1、FEV1/FVC是判斷肺功能的重要指標(biāo)，可用于評(píng)價(jià)COPD病人病情嚴(yán)重程度［10］。本研究結(jié)果顯示，COPD組病人TNF-α、IL-6、CRP水平顯著高于對(duì)照組，肺功能指標(biāo)FEV1%pred、FEV1、FEV1/FVC顯著低于對(duì)照組，提示COPD病人體內(nèi)存在炎癥反應(yīng)和肺功能損傷。

外泌體是一種直徑40～100 nm的囊泡，內(nèi)含包括蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、miRNA等分子結(jié)構(gòu)，外泌體及其miRNA在肺癌、肺纖維化、哮喘、肺損傷等肺部疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，成為疾病診斷與治療的標(biāo)志物［11-12］。研究顯示，多種外泌體miRNA與COPD疾病相關(guān)，如謝羽飛等［13］研究表明，COPD病人血清外泌體中miRNA-186相對(duì)表達(dá)量明顯高于正常對(duì)照組，且其與COPD病人的FEV1%預(yù)計(jì)值呈負(fù)相關(guān)。miRNA-223為miRNA的一種，與多種炎癥性疾病有關(guān)，Neudecker等［14］研究顯示，在急性肺損傷小鼠模型中，miR-223從中性粒細(xì)胞到肺上皮細(xì)胞的細(xì)胞間轉(zhuǎn)移可能通過(guò)抑制聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1（PARP-1）來(lái)抑制急性肺損傷。另有研究顯示［15］，哮喘病人中miRNA-223水平升高，且與FEV1、FEV1/FVC比值呈負(fù)相關(guān)。本研究結(jié)果表明，COPD組病人血清外泌體miRNA-223水平顯著高于對(duì)照組，提示miRNA-223與COPD病人發(fā)病有關(guān)；且在輕度、中度、重度、極重度COPD病人中血清外泌體miRNA-223表達(dá)水平依次升高，提示miRNA-223與COPD病人病情的嚴(yán)重程度有關(guān)。研究顯示［16］，miRNA-223可通過(guò)抑制TLR4/NF-KB信號(hào)通路并抑制NLRP3炎癥小體的活化，減輕甲型流感病毒誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。推測(cè)miRNA-223可能通過(guò)參與調(diào)控炎癥反應(yīng)參與COPD的發(fā)生發(fā)展。

COPD的具體發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，其主要特征為炎性反應(yīng)、氣道重塑、氣流受限和肺功能下降。研究顯示［17］，COPD病人急性期IL-6、CRP水平高于穩(wěn)定期，且COPD急性加重期IL-6、CRP水平更高，表明炎性因子與COPD病人病情有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，重度、極重度COPD病人血清TNF-α、IL-6、CRP水平顯著高于輕、中度病人，輕度與中度、重度與極重度COPD病人之間血清TNF-α、IL-6、CRP水平差異不顯著，在多數(shù)炎癥性疾病中，炎性因子均有升高，提示TNF-α、IL-6、CRP水平可反映COPD的炎癥狀態(tài)，不能反映COPD疾病嚴(yán)重程度。相關(guān)性分析顯示，COPD病人血清外泌體miRNA-223水平與TNF-α、IL-6、CRP水平呈正相關(guān)，表明miRNA-223可能通過(guò)炎癥反應(yīng)參與COPD的發(fā)病過(guò)程，COPD病人TNF-α、IL-6、CRP等炎性因子水平增加，可能與NF-κB等炎癥相關(guān)信號(hào)通路有關(guān)。NF-κB的激活可誘導(dǎo)多種促炎基因的表達(dá)和炎癥小體的激活，研究顯示，miR-223在培養(yǎng)的人支氣管上皮細(xì)胞（HBECs）中表達(dá)，下調(diào)miR-223可導(dǎo)致NF-κB信號(hào)激活［17］。且多數(shù)報(bào)道顯示，miR-223主要發(fā)揮抗炎的作用，下調(diào)miR-223的表達(dá)可增加炎癥反應(yīng)，過(guò)表達(dá)miR-223可抑制促炎因子的釋放［18］。而本文中COPD病人血清外泌體中miRNA-223水平雖升高，但不足以降低TNF-α、IL-6等炎性因子的釋放，此外，miR-223的大多數(shù)靶基因在COPD中升高，可能是由于肺局部組織腔室的改變，miR-223的保護(hù)作用受損或不足以降低哮喘和COPD中的高炎癥反應(yīng)。本研究還發(fā)現(xiàn)COPD病人血清外泌體miRNA-223水平與FEV1%pred、FEV1、FEV1/FVC呈負(fù)相關(guān)，進(jìn)一步證實(shí)miRNA-223與COPD病人病情的嚴(yán)重程度有關(guān)，血清外泌體miRNA-223水平可反映COPD病人肺功能情況，其可能作為預(yù)測(cè)COPD發(fā)生及其病情嚴(yán)重程度的標(biāo)志物之一。本研究?jī)H分析COPD病人血清外泌體miRNA-223水平與炎性因子及肺功能的相關(guān)性，miRNA-223在COPD中的具體作用機(jī)制仍需結(jié)合動(dòng)物模型做更深入的研究。

綜上所述，miRNA-223在COPD病人血清外泌體中表達(dá)水平升高，與病人疾病嚴(yán)重程度有關(guān)，可能作為判斷COPD病情嚴(yán)重程度的潛在標(biāo)志物，為臨床COPD診治提供一定參考，但其具體作用機(jī)制仍需做進(jìn)一步研究。