趨化素樣因子超家族6和程序性死亡受體-配體1在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及其與預(yù)后的關(guān)系

鄭永，劉杰

作者單位：解放軍總醫(yī)院三中心神經(jīng)創(chuàng)傷外科，北京100039

腦膠質(zhì)瘤是最為常見的惡性腫瘤，其發(fā)生發(fā)展是由多環(huán)節(jié)多因素共同作用的最終結(jié)果。同時(shí)，筆者考慮其分子特點(diǎn)非常復(fù)雜，故對(duì)其從信號(hào)傳導(dǎo)通路和基因水平等領(lǐng)域進(jìn)行多層次的深入研究。結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)顯示，從分子水平闡明惡性腫瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的病理機(jī)制對(duì)完善癌癥病人診治方案，改善預(yù)后狀況具有重要的價(jià)值［1］。趨化素樣因子超家族6（chemokine-like factor-like MARVEL transmembrane domain-containing family member 6，CMTM6）是由3號(hào)染色體的基因簇編碼而成的，其屬于特殊結(jié)構(gòu)域蛋白（MARVEL），經(jīng)證實(shí)其在分泌蛋白和穿膜蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)期間發(fā)揮重要的作用，且在腫瘤、胚胎發(fā)育和表觀遺傳等方面發(fā)揮重要的作用［2］。在肺腺癌和口腔鱗癌等惡性腫瘤的研究中發(fā)現(xiàn)，CMTM6通過介導(dǎo)程序性死亡受體-配體1（programmed death-ligand 1，PD-L1）的表達(dá)來對(duì)惡性腫瘤病人發(fā)揮重要的免疫調(diào)節(jié)作用［3］。PD-L1是多種免疫細(xì)胞表達(dá)的表面膜蛋白，直接參與惡性腫瘤的分子調(diào)控。目前，已經(jīng)有關(guān)于PD-L1在胃癌、口腔鱗癌和肺腺癌等多種惡性腫瘤中表達(dá)的研究，并就此研制的新型免疫抑制劑也廣泛應(yīng)用于臨床，但對(duì)于PD-L1在腦膠質(zhì)瘤中的研究較為罕見［4］。為了明確CMTM6、PD-L1與腦膠質(zhì)瘤病人預(yù)后狀況的關(guān)系，評(píng)定其在腦膠質(zhì)瘤診治中的價(jià)值，本研究采用免疫組化Envision二步法檢測(cè)腦膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本及正常腦組織標(biāo)本中CMTM6、PD-L1的表達(dá)水平，分析兩者與預(yù)后狀況的關(guān)系，以期為腦膠質(zhì)瘤病人的診治及預(yù)后評(píng)價(jià)提供指導(dǎo)價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2016年1月至2017年1月解放軍總醫(yī)院三中心神經(jīng)外科住院部收治的腦膠質(zhì)瘤病人95例作為觀察組。男51例，女44例，年齡＜40歲41例，年齡≥40歲54例，病灶長(zhǎng)徑＜3 cm 43例，≥3 cm 52例，病理學(xué)分級(jí)：低病理級(jí)別53例作為低病理級(jí)別組（Ⅰ級(jí)11例，Ⅱ級(jí)42例），高病理級(jí)別42例作為高病理級(jí)別組（Ⅲ級(jí)29例，Ⅳ級(jí)13例）。疾病類型：間變性星形細(xì)胞瘤27例，少突-星形細(xì)胞瘤26例，彌漫性星形細(xì)胞瘤14例，少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤17例，毛細(xì)胞型星形細(xì)胞瘤9例，室管膜下巨細(xì)胞型星形細(xì)胞瘤2例。臨床癥狀：眩暈55例，癲癇57例，卡氏功能狀態(tài)評(píng)分（Karnofsky performance scores，KPS）≥70分64例，＜70 分31例。同時(shí)，選擇顱腦外傷去骨瓣減壓術(shù)病人89例作為對(duì)照組，要求兩組在手術(shù)中采集腦組織標(biāo)本。全部病人手術(shù)前均被告知手術(shù)內(nèi)容及其注意事項(xiàng)，并簽署知情同意書。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn) 觀察組經(jīng)影像學(xué)和病理組織學(xué)檢查明確腦膠質(zhì)瘤的診斷，對(duì)照組僅符合顱腦外傷的診斷，初次發(fā)病，首次實(shí)施手術(shù)治療。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn) 手術(shù)前接受化療、放療等，入組前合并腦卒中、腦疝、其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病、精神心理異常，術(shù)后隨訪資料不完整，隨訪期間死亡［5］。

1.3 檢測(cè)方法 采用免疫組化Envision二步法檢測(cè)腦膠質(zhì)瘤組織和正常腦組織的CMTM6、PD-L1蛋白表達(dá)。

1.3.1 試劑與儀器 兔多克隆CMTM6抗體（美國(guó)Abcam公司），兔單克隆PD-L1抗體（Cell Signaling公司），磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）、二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色液、辣根過氧化物酶（horse radish peroxidase，HRP）標(biāo)記的羊抗兔IgG 二抗、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）抗原修復(fù)液等均購自武漢賽維爾生物有限公司。

1.3.2 操作方法 采集的腦組織標(biāo)本即刻采用10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋、連續(xù)組織切片，滴入兔多克隆CMTM6抗體（1∶100稀釋）或兔單克隆PDL1抗體（1∶200稀釋），經(jīng)4 ℃過夜，PBS沖洗后滴入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG 二抗，室溫條件下孵育15 min，將石蠟組織芯片90 ℃烤片3 h，將組織芯片進(jìn)行脫蠟水化處理后于PBS浸洗5 min×3次，電飯鍋隔水加熱至100 ℃，使用EDTA進(jìn)行抗原修復(fù)30 min，芯片緩緩降溫后于3%雙氧水浸泡30 min以封閉內(nèi)源性過氧化物酶，經(jīng)DAB顯色液顯色沖洗、蘇木精復(fù)染、冷水缸返藍(lán)、1%鹽酸-乙醇分化、脫水風(fēng)干后采用中性樹膠封片等處理后選擇染色均勻及清晰的組織芯片進(jìn)行顯微鏡觀察。選取每張免疫反應(yīng)較強(qiáng)的區(qū)域，400倍高倍鏡視野下不重復(fù)觀察5個(gè)視野，計(jì)算CMTM6陽性細(xì)胞數(shù)量。免疫組織化學(xué)計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)［6］：①陽性細(xì)胞百分率≤25%則計(jì)1分，＞25%～50%則計(jì)2分，＞50%～75%則計(jì)3分，＞75%則計(jì)4分。②染色程度：無染色則計(jì)0分，淡黃色則計(jì)1分，黃色或棕褐色則計(jì)2分，褐色則計(jì)3分，以兩者評(píng)分之和作為最終評(píng)分，以0分作為陰性，1～3分則作為弱陽性，4～7分則作為強(qiáng)陽性。由兩位高級(jí)病理科醫(yī)師在雙盲條件下按照陽性細(xì)胞百分比和染色程度進(jìn)行閱片評(píng)分，各切片觀察5個(gè)視野（×400），取平均值，對(duì)于閱片結(jié)果不一致的切片則要求另一名病理科醫(yī)師進(jìn)行閱片，最終閱片結(jié)果由3名醫(yī)師共同鑒定。根據(jù)CMTM6表達(dá)陽性與否將膠質(zhì)瘤病人分為CMTM6陽性表達(dá)組和CMTM6陰性表達(dá)組，PD-L1表達(dá)陽性與否將膠質(zhì)瘤病人分為PD-L1陽性表達(dá)組和PD-L1陰性表達(dá)組。

1.4 觀察指標(biāo) 比較觀察組和對(duì)照組CMTM6、PDL1蛋白表達(dá)的差異，進(jìn)一步比較不同病理學(xué)分級(jí)CMTM6、PD-L1蛋白表達(dá)的差異，明確CMTM6、PDL1蛋白表達(dá)在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中的作用。采用電話、門診結(jié)合微信隨訪獲取術(shù)后5年生存相關(guān)數(shù)據(jù)，比較CMTM6陽性表達(dá)組和CMTM6陰性表達(dá)組累積總生存率和無病生存率，比較PD-L1陽性表達(dá)組和PD-L1陰性表達(dá)組累積總生存率和無病生存率，分析CMTM6、PD-L1表達(dá)水平是否與預(yù)后狀況有關(guān)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件包和MedCalc軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)錄入及統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。應(yīng)用Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)計(jì)量資料是否符合正態(tài)分布，對(duì)于符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，兩組比較采用成組設(shè)計(jì)資料的t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，兩組比較采用配對(duì)χ2檢驗(yàn)，生存分析采用Kaplan-Meier法和log-rank檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組CMTM6、PD-L1蛋白表達(dá)的比較 免疫組化染色結(jié)果顯示，95例腦膠質(zhì)瘤組織（觀察組）和89例正常腦組織（對(duì)照組）CMTM6蛋白主要在細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)，可見棕褐色顆粒狀物質(zhì)。PDL1蛋白主要分布于細(xì)胞膜內(nèi)，呈棕褐色顆粒狀物質(zhì)，少量可見于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。觀察組CMTM6陽性表達(dá)率為85.11%（78/95），明顯高于對(duì)照組的26.97%（24/89），PD-L1陽性表達(dá)率為54.74%（52/95），明顯高于對(duì)照組的13.48%（12/89），兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=56.55，34.47，P＜0.05），見表1。

表1 腦膠質(zhì)瘤95例和腦外傷89例CMTM6、PD-L1蛋白表達(dá)的比較/例（%）

高病理級(jí)別膠質(zhì)瘤組織CMTM6陽性表達(dá)率為95.24%（40/42），明顯高于低病理級(jí)別的71.70%（38/53），PD-L1陽性表達(dá)率為73.81%（31/42），明顯高于低病理級(jí)別的39.62%（21/53），兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=8.84，11.05，P＜0.05），見表2。

2.2 生存分析 95例腦膠質(zhì)瘤病人中，78例CMTM6陽性病人作為CMTM6陽性表達(dá)組，17例CMTM6陰性病人作為CMTM6陰性表達(dá)組。Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示，CMTM6陽性表達(dá)組的累積總生存率較CMTM6陰性表達(dá)組的降低幅度更明顯，兩組1、2、3年累積生存率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而4、5年累積生存率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

表3 腦膠質(zhì)瘤CMTM6陽性表達(dá)組與CMTM6陰性表達(dá)組累積總生存率的比較/例（%）

CMTM6陽性表達(dá)組的無病生存率較CMTM6陰性表達(dá)組的降低幅度更明顯，CMTM6陽性表達(dá)組的1、2、3、4、5年無病生存率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表4。

表4 腦膠質(zhì)瘤CMTM6陽性表達(dá)組與CMTM6陰性表達(dá)組無病生存率的比較/例（%）

2.3 PD-L1表達(dá)與腦膠質(zhì)瘤病人預(yù)后狀況的關(guān)系 在95例腦膠質(zhì)瘤病人中，52例PD-L1陽性病人作為PD-L1陽性表達(dá)組，43例PD-L1陰性病人作為PD-L1陰性表達(dá)組。Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示，PD-L1陽性表達(dá)組的累積總生存率較PD-L1陰性表達(dá)組的降低幅度更明顯，兩組1年累積生存率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而2、3、4、5年累積生存率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表5。

表5 腦膠質(zhì)瘤程序性死亡受體-配體1（PD-L1）陽性表達(dá)組與PD-L1陰性表達(dá)組5年累積總生存率的比較/例（%）

PD-L1陽性表達(dá)組的無病生存率較PD-L1陰性表達(dá)組的降低幅度更明顯，PD-L1陽性表達(dá)組的1年無病生存率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而2、3、4、5年無病生存率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表6。

表6 腦膠質(zhì)瘤程序性死亡受體-配體1（PD-L1）陽性表達(dá)組與PD-L1陰性表達(dá)組無病生存率的比較/例（%）

3 討論

腦膠質(zhì)瘤常呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，增殖侵襲能力較強(qiáng)，且由于化療耐受而限制化療的臨床應(yīng)用，盡管手術(shù)和放射治療技術(shù)的不斷完善，但仍無法降低復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。因此，探尋腦膠質(zhì)瘤的新型治療靶點(diǎn)具有重要的意義。隨著對(duì)CMTM家族各成員研究的不斷深入，CMTM6和腦膠質(zhì)瘤、肺癌、腎癌、胃癌和肝癌等多種惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展具有緊密的關(guān)系。楊小駿等［7］對(duì)42例乳腺癌及癌旁組織進(jìn)行CMTM6表達(dá)水平檢查發(fā)現(xiàn)，癌癥組織CMTM6陽性表達(dá)率明顯高于癌旁組織，且CMTM6高表達(dá)病人生存期明顯縮短，提示CMTM6高表達(dá)是惡性腫瘤病人預(yù)后不良的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因子。PD-L1是各種實(shí)體瘤病人的主要生物標(biāo)志物，其表現(xiàn)為異常激活或過度表達(dá)狀態(tài)，尤其是胃癌、尿路上皮癌、腎細(xì)胞癌、肺癌和黑色素瘤等。張武文、汪付兵［8］研究顯示，PD-L1信號(hào)通路與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后狀況具有明顯的關(guān)系。廖婧等［9］研究則顯示，CMTM6可有效維持PD-L1的穩(wěn)定性，預(yù)防PD-L1在肺癌和黑色素瘤的溶酶體水解，為阻斷PD-1/PD-L1信號(hào)通路的免疫逃逸提供了理論依據(jù)。Cox回歸模型分析顯示，CMTM6高表達(dá)是癌癥病人預(yù)后不良的主要影響因素，其有望成為惡性腫瘤病人的新型治療靶點(diǎn)，并在減少腫瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)、抑制腫瘤生長(zhǎng)繁殖和延長(zhǎng)生存時(shí)間等方面提供新的思路。相關(guān)研究［10］顯示，CMTM6表達(dá)與頭暈具有明顯的相關(guān)性。同時(shí)，作為常見的神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤，癲癇是腦膠質(zhì)瘤的主要癥狀，而李明賀等［11］研究則證實(shí)，CMTM6、PD-L1與癲癇發(fā)作具有明顯的關(guān)系，上述研究提示了可從CMTM6和PD-L1入手，采用免疫組化法測(cè)定CMTM6和PD-L1陽性表達(dá)率，明確兩者表達(dá)是否與病理特征及預(yù)后狀況有關(guān)，假設(shè)該項(xiàng)結(jié)論成立，則將為腦膠質(zhì)瘤病人治療方案的制定與調(diào)整提供新的思路。筆者考慮CMTM6和PD-L1在免疫逃逸中發(fā)揮的協(xié)同效應(yīng)，故本研究就CMTM6和PD-L1在腦膠質(zhì)瘤病人中的表達(dá)及其與預(yù)后狀況進(jìn)行研究，以明確兩者表達(dá)水平在改善預(yù)后狀況中的作用。

本研究結(jié)果顯示，腦膠質(zhì)瘤組織CMTM6、PDL1陽性表達(dá)率明顯高于正常腦組織，而高病理級(jí)別膠質(zhì)瘤組織的陽性表達(dá)率則明顯高于低病理級(jí)別，提示CMTM6、PD-L1在腦膠質(zhì)瘤組織中呈高表達(dá)，且與病理學(xué)分級(jí)具有明顯的關(guān)系。梁博等［12］研究則證實(shí)，CMTM6與癲癇發(fā)作程度具有明顯的關(guān)系，該項(xiàng)研究提示，癲癇主要累及低病理級(jí)別膠質(zhì)瘤病人，但結(jié)合本研究結(jié)果低病理級(jí)別膠質(zhì)瘤組織的CMTM6陽性表達(dá)率則相對(duì)降低，上述結(jié)論是否存在矛盾則需擴(kuò)大樣本量以驗(yàn)證兩者的可靠性。進(jìn)一步就累積生存率和無病生存率的Kaplan-Meier生存分析顯示，CMTM6陽性表達(dá)的腦膠質(zhì)瘤病人4、5年累積總生存率較陰性表達(dá)的病人明顯降低，PD-L1陽性表達(dá)病人的2、3、4、5年累積總生存率和無病生存率也較PD-L1陰性表達(dá)組明顯降低，提示腦膠質(zhì)瘤組織CMTM6、PD-L1與腦膠質(zhì)瘤病人預(yù)后狀況具有緊密的關(guān)系，主要表現(xiàn)為兩者的高表達(dá)往往提示預(yù)后狀況不良［13-15］。究其原因?yàn)椋篊MTM6、PD-L1通過影響抗腫瘤免疫反應(yīng)而導(dǎo)致術(shù)后生存率降低［16-17］。但結(jié)合本研究結(jié)果提示，CMTM6陽性和陰性表達(dá)的腦膠質(zhì)瘤病人累積生存率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其可能與研究樣本量較小具有一定的關(guān)系［18-19］。CMTM6和PD-L1均定位于循環(huán)核內(nèi)體和質(zhì)膜內(nèi)，前者通過介導(dǎo)PD-L1的表達(dá)以促進(jìn)兩者之間的結(jié)合，最終拮抗T細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤反應(yīng)［20-25］。本研究采用定位準(zhǔn)確、敏感性和特異性較高的免疫組化染色技術(shù)，以期提高檢測(cè)結(jié)果的可靠性。因此，筆者確信CMTM6、PD-L1與腦膠質(zhì)瘤病人預(yù)后狀況具有明顯的關(guān)系。

綜上所述，CMTM6、PD-L1與腦膠質(zhì)瘤病人病理學(xué)分級(jí)具有緊密的關(guān)系，且兩者陽性表達(dá)往往提示預(yù)后狀況不良，往后將以CMTM6為靶點(diǎn)拮抗PDL1信號(hào)通路可成為腦膠質(zhì)瘤病人的治療突破點(diǎn)。目前針對(duì)CMTM6、PD-L1在腦膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)的相關(guān)研究較為罕見，往后需大量的人體組織學(xué)樣本進(jìn)行測(cè)定，以進(jìn)一步闡明兩者在腦膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展期間的分子作用機(jī)制。但盡管如此，CMTM6、PD-L1有望為腦膠質(zhì)瘤病人免疫藥物治療靶點(diǎn)及預(yù)后評(píng)價(jià)提供重要的指導(dǎo)意義。