光化性角化病病人皮膚組織Toll樣受體7蛋白表達及其臨床意義

劉珈言，李二龍，梅蓉，楊禮鳳，趙文彬，韓成龍，周慧

作者單位：四川大學(xué)華西醫(yī)院皮膚性病科，四川 成都610041

光化性角化?。╝ctinic keratosis，AK）是一類由長期日照或電離輻射導(dǎo)致的以皮膚表皮角化過度為主的皮膚病，多發(fā)于老年人與長期日曬群體［1］。既往報道表明［2］，AK是最常見的一種皮膚癌前病變，易發(fā)展為皮膚鱗狀細胞癌（cutaneous squamous cell carcinoma，cSCC），進而侵襲骨骼、肌肉等組織，甚至威脅病人生命。目前AK發(fā)展為cSCC的發(fā)病機制尚不明確，故探討影響AK發(fā)展為cSCC的可能因素對臨床治療改善AK病人預(yù)后十分重要。李莎［3］等研究表明，Toll樣受體7（toll like receptor 7，TLR7）蛋白是一種主要分布于免疫細胞的天然免疫受體蛋白，其可誘導(dǎo)機體的免疫反應(yīng)，引發(fā)炎癥，可能參與了AK的發(fā)病過程，其表達量隨表皮病變惡化程度增加而上漲；此外，腫瘤與癌前病變會引發(fā)機體強烈的天然免疫，致使效應(yīng)分子TLR7蛋白水平上調(diào)，而TLR7引發(fā)的持續(xù)性炎癥會進一步促進腫瘤發(fā)展［4］，提示TLR7的表達可能與AK發(fā)展為cSCC存在一定的相關(guān)性。鑒于此，本研究特選取134例AK病人，探究其皮膚組織中TLR7蛋白的表達量與預(yù)后情況之間的關(guān)系，并分析AK病人皮膚組織中TLR7蛋白表達對其預(yù)后的預(yù)測效能，以期為AK病人的預(yù)后分析和早期治療提供臨床參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015年1月至2019年1月四川大學(xué)華西醫(yī)院134例AK病人的皮損皮膚蠟塊標本作為觀察組，選取同時期收集的129例健康人員的皮膚蠟塊標本作為對照組。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

納入標準：①觀察組均符合《臨床皮膚病學(xué)》［5］中AK的診斷表準，且均經(jīng)病理學(xué)檢查確診；②AK病人確診后均行激光-光動力療法治療；③受試者或其近親屬對本研究知情同意。排除標準：①合并其他良惡性腫瘤；②脂溢性角化、基底細胞癌等其他皮膚疾?。虎燮つw組織獲取前3個月內(nèi)進行過治療。

1.2 方法

1.2.1 皮膚組織TLR7檢測方法 蠟塊均連續(xù)4 μm切片，切片進行常規(guī)脫蠟水化，0.01 mol/L PBS沖洗，置于0.01 mol/L枸櫞酸液（武漢博士得生物工程有限公司）中浸泡后，微波爐高火修復(fù)13 min，再冷卻，PBS沖洗5 min，3%雙氧水37 ℃孵育20 min，滴加正常山羊血清37 ℃封閉30 min，舍去血清，加入一抗兔抗人TLR7抗體（1∶50稀釋）與鼠抗人TLR8抗體（1∶100稀釋）后，4℃冰箱中孵育過夜。次日取出37 ℃復(fù)溫60 min，加入生物素標記的二抗孵育0.5 h，辣根酶標記的鏈霉卵白素工作液37 ℃ 0.5 h，PBS沖洗，DAB染色后，沖水10 min，蘇木精復(fù)染1 min，脫水，透明后，滴加中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。

1.2.2 TLR7表達量確定 片狀棕黃色染色為陽性表達，通過計算機Image pro Plus 6.0（IPP）軟件分析圖片，選擇圖片著色最密集最深的區(qū)域為基礎(chǔ)，計算陽性細胞的積分光密度值（integrated option density，IOD），OID越高，TLR7蛋白表達越高。

1.2.3 AK病人預(yù)后情況判斷劑分組 對觀察組病例病人均隨訪3年，將發(fā)展為cSCC者歸為癌變組，未發(fā)展為cSCC者歸為非癌變組。

1.2.4 可能癌變組因素分析 比較分析可能導(dǎo)致AK病人癌變組的因素，包括年齡、性別、皮膚病史、病程、病理類型（肥厚型、萎縮型、原位癌樣型）、Fitzpatrick皮膚分型以及皮膚組織TLR7蛋白表達量等，分析影響因素。

1.3 觀察指標 （1）比較觀察組和對照組一般資料及皮膚組織中TLR7蛋白的表達水平。（2）比較非癌變組與癌變組皮膚組織TLR7蛋白的表達水平。（3）癌變組因素logistic分析：比值比（OR）、95%可信區(qū)間（95%CI）。（4）皮膚組織TLR7蛋白表達量對AK發(fā)展為cSCC的預(yù)測效能：記錄截斷值、靈敏度、特異度、受試者操作特征（ROC）曲線下面積和95%CI。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件處理數(shù)據(jù)，計量資料采用表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；計數(shù)資料以例（%）表示，采用χ2檢驗；對AK病人癌變的可能影響因素開展logistic回歸分析，同時采用Hosmer-Lemeshow法對模型進行檢驗并對影響因素進行共線性診斷。采用ROC曲線分析皮膚組織中TLR7蛋白表達水平對AK發(fā)展為cSCC的預(yù)測效能。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 觀察組和對照組一般資料比較 觀察組病程（26.08±5.11）月，其中肥厚型79例（58.96%），萎縮性22例（16.42%），原位癌樣型33例（24.63%），單發(fā)皮損111例（82.84%），多發(fā)皮損23例（17.16%）。觀察組和對照組性別、年齡、部位比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 光化性角化病和對照組一般資料比較

2.2 觀察組與對照組皮膚組織TLR7蛋白表達水平比較 觀察組的皮膚組織中TLR7蛋白表達量（23.76±3.90）高于對照組表達量（4.95±0.64），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=54.08，P＜0.05）。

2.3 癌變組與非癌變組的皮膚組織TLR7蛋白表達水平比較 134例AK病人隨訪3年發(fā)生癌變21例，未發(fā)生癌變113例，癌變率為15.67%。癌變組的皮膚組織中TLR7蛋白表達量（27.37±3.19）高于非癌變組（23.08±3.66），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=5.02，P＜0.05）。

2.4 AK病人癌變的影響因素分析 癌變組與非癌變組皮膚病史、病理類型、病程、皮損數(shù)量對比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；癌變組病人的年齡大于非癌變組（P＜0.05），男性、Fitzpatrick皮膚分型為Ⅰ/Ⅱ型的病人占比及TLR7蛋白表達量均高于非癌變組（P＜0.05），見表2。

表2 光化性角化病癌變的單因素分析結(jié)果

經(jīng)Hosmer-Lemeshow檢驗，logistic模型的觀測值和期望值差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=4.75，P=0.596），說明該模型的擬合度良好。logistic回歸分析結(jié)果顯示，高齡、男性、Fitzpatrick皮膚分型為Ⅰ/Ⅱ型、皮膚組織中TLR7蛋白高表達均是AK病人癌變組的危險因素（P＜0.05），對篩選出的4個有統(tǒng)計學(xué)差異的變量進行共線性診斷，結(jié)果顯示4個變量的方差膨脹因子（VIF）均＜10，說明自變量之間無共線性存在，具體數(shù)值見表3。

表3 共線性診斷和logistic回歸分析結(jié)果

2.5 皮膚組織TLR7蛋白表達量對AK癌變組的預(yù)測效能 皮膚組織TLR7蛋白表達量預(yù)測AK病人預(yù)后情況的ROC曲線見圖1，截斷值為25.34，靈敏度為80.95%，特異度為81.42%，ROC曲線下面積為0.81，95%CI：（0.74，0.88）。

3 討論

AK是臨床常見的一種損害性癌前皮膚病，在我國的發(fā)病率約為0.7%，其中約有0.025%～16.000%的AK病人會在后期發(fā)展為cSCC［6］。cSCC具有浸潤性、轉(zhuǎn)移性、發(fā)展快、惡性程度高等特點，病人預(yù)后較差，嚴重威脅病人的健康［7］。目前，AK發(fā)展為cSCC的發(fā)病機制尚不明確，影響因素繁多，但鮮有對其影響因素的分析報道，故全面分析篩選AK發(fā)展為CSCC的影響因素對AK病人的早期干預(yù)和預(yù)后改善十分必要。

本研究顯示，觀察組病人皮膚組織中TLR7蛋白表達量高于對照組，說明TLR7蛋白在AK病人的皮膚組織中呈現(xiàn)異常高表達。TLR7作為TLR家族成員之一，具有與其他TLR相似的結(jié)構(gòu)特征與功能作用，可通過識別細菌、病毒等外源配體的基因組DNA，促使免疫細胞分泌釋放干擾素-α等炎性因子而發(fā)生免疫反應(yīng)。AK病人的皮膚角質(zhì)細胞已發(fā)生明顯損傷，受損皮膚易被細菌、病毒感染而誘發(fā)上皮細胞中TLR7蛋白表達［8-9］，同時釋放出大量干擾素-α，進一步促使B細胞內(nèi)TLR7表達上調(diào)［10］，INF-α與TLR7表達之間的正反饋調(diào)節(jié)機制［11］致使AK病人的皮膚組織中TLR7表達水平顯著升高。此外，本研究顯示，癌變組皮膚組織TLR7蛋白表達水平高于非癌變組，且經(jīng)logistic回歸分析證實TLR7是AK病人癌變組的獨立危險因素。既往研究［12-13］發(fā)現(xiàn)，在宮頸鱗癌、惡性上皮腫瘤病人中，TLR7蛋白發(fā)揮促腫瘤的作用。TLR的信號通路會顯著影響腫瘤的發(fā)生與進展，腫瘤細胞表面活化的TLR7會促使核因子-kB水平上調(diào)，促使抗凋亡蛋白表達，進而誘發(fā)腫瘤［14］；此外，TLR7可調(diào)控腫瘤細胞對細胞因子和趨化因子分泌釋放，誘導(dǎo)免疫細胞分泌炎性因子，從而削弱抗原提呈細胞和效應(yīng)T細胞的抗腫瘤，引發(fā)“免疫逃逸”，導(dǎo)致腫瘤的惡性程度隨TLR7表達水平的升高而升高［15］，因而AK病人皮膚組織TLR7蛋白表達水平越高，病人后期進展為cSCC的概率越大。于麗麗等［16］發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜癌病人癌組織中TLR7表達水平明顯高于不典型增生組織，且表達水平越高，預(yù)后越差；Liotti等［17］報道，非小細胞肺癌病人TLR7的表達水平升高；本研究與上述研究結(jié)果一致，均表明TLR7高表達與腫瘤發(fā)生相關(guān)。

此外，logistic回歸分析結(jié)果顯示高齡、男性、Fitzpatrick皮膚分型為Ⅰ/Ⅱ型均是AK病人癌變組的獨立危險因素。究其原因：可能是高齡病人機體免疫功能減退，對腫瘤的發(fā)生與發(fā)展的抵抗能力下降；男性病人暴露于紫外線下的時間更長，皮膚病變程度更嚴重；Fitzpatrick皮膚分型為Ⅰ/Ⅱ型病人皮膚黑色素水平較低，對紫外線敏感程度高，更易引發(fā)皮膚病變。此外，本研究顯示皮膚組織TLR7蛋白表達量預(yù)測AK病人預(yù)后情況的ROC曲線的靈敏度為80.95%，特異度為81.42%，ROC曲線下面積為0.81，表明其對AK病人的預(yù)后具有良好的預(yù)測效能。臨床上可通過早期檢測AK病人皮膚組織中TLR7蛋白的表達水平，及時篩選可能發(fā)生癌變組的AK病人，及早地實施干預(yù)治療，對cSCC的預(yù)防具有重要的臨床意義。

皮膚組織TLR7蛋白表達量對AK病人的預(yù)后具有良好的預(yù)測效能，是臨床預(yù)判AK病人預(yù)后的有效方法，具有重要臨床應(yīng)用價值。但本研究仍存在一定的局限性，首先AK樣本量選取較少，其次對于預(yù)后進展的隨訪時間僅有3年，缺乏更遠期預(yù)后情況分析，仍需大樣本的前瞻性研究進行長期隨訪驗證結(jié)果。