重癥急性胰腺炎病人外周血微RNA-143-3p、環(huán)氧合酶-2表達(dá)水平與輔助性T細(xì)胞17/調(diào)節(jié)性T細(xì)胞平衡的關(guān)系

鄧雍，馬濤，張寧

作者單位：1榆林市第一醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，陜西 榆林719000；2榆林市第二醫(yī)院消化內(nèi)科，陜西 榆林719000

急性胰腺炎（acute pancreatitis， AP）是一種急腹癥，其有輕癥AP（mild acute pancreatitis， MAP）與重癥AP（severe acute pancreatitis，SAP）兩種類型，其中SAP病情進(jìn)展迅速、病死率高［1-2］。因此，尋找與SAP病理發(fā)展的相關(guān)因素，對及時(shí)制定干預(yù)措施，改善SAP病人生存狀況有積極意義。研究認(rèn)為，SAP與微RNA（microRNA，miRNA）表達(dá)失調(diào)、膽道感染、免疫紊亂、飲酒過量、炎癥反應(yīng)等有關(guān)［3-4］。研究發(fā)現(xiàn)，微RNA-143-3p（microRNA-143-3p，miR-143-3p）在支原體肺炎中呈低表達(dá)，其可能通過調(diào)節(jié)肺部炎癥反應(yīng)進(jìn)而影響肺炎病理進(jìn)展［5］；環(huán)氧合酶-2（cyclooxygenase-2， COX-2）在AP中表達(dá)水平升高，COX-2抑制劑可通過降低炎癥反應(yīng)進(jìn)而抑制SAP發(fā)展［6］；且Li等［7］研究發(fā)現(xiàn)，miR-143-3p可靶向調(diào)節(jié)COX-2表達(dá)水平；此外，輔助性T細(xì)胞17（T helper cell 17，Th17）/調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cells， Treg）在SAP中水平較高，Th17/Treg可能參與SAP病變過程［8］?；谏鲜鲅芯?，本研究通過測定SAP病人外周血中miR-143-3p、COX-2 mRNA表達(dá)水平，旨在分析其與Th17/Treg平衡的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年12月至2020年9月榆林市第一醫(yī)院收治的AP病人103例為研究對象，男68例，女35例，年齡范圍為24～68歲，年齡（48.52±15.17）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）病人符合《中國急性胰腺炎診治指南（2013年，上海）》［9］中AP診斷標(biāo)準(zhǔn)；（2）病人發(fā)病6 h內(nèi)入院；（3）病人首次發(fā)生AP。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并HIV感染、惡性腫瘤者；（2）合并妊娠、乙肝、糖尿病者；（3）有慢性胰腺炎病史者；（4）合并自身免疫性疾病者。對所有AP病人進(jìn)行急性生理與慢性健康評分Ⅱ（acute physiology and chronic health evaluation Ⅱ， APACHE Ⅱ）評估，按APACHEⅡ評分將其分為SAP組（APACHEⅡ評分≥8分，45例）和MAP組（APACHEⅡ評分＜8分，58例）。SAP組：男29例，女16例，年齡范圍為24～68歲，年齡（48.94±15.53）歲。MAP組：男39例，女19例，年齡范圍為24～68歲，年齡（48.19±15.10）歲。并納入同期體檢健康者55例為健康組，男36例，女19例，年齡范圍為24～68歲，年齡（48.13±15.05）歲。三組性別比例、年齡比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.09，P=0.930；F=0.04；P=0.958）。受試者對本研究知情同意。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.2 研究方法 收集AP病人入院時(shí)和體檢健康者體檢當(dāng)日5～6 mL空腹外周血，分成兩份，1份靜置30 min后以4 200 r/min離心7 min，留取上清液（血清），置于-70 ℃環(huán)境中保存；另1份置于含肝素的抗凝管中，待檢。

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）法檢測血清miR-143-3p、維甲酸相關(guān)孤核受體（retinoic acid-related orphan receptorγt，RORγt） mRNA、COX-2 mRNA、叉頭/翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子3（forkhead or winged helix transcription，F(xiàn)oxp3） mRNA表達(dá)水平，具體操作如下：解凍血清，以TRIzol LS Reagent（上海信裕生物科技有限公司，XY1901B）提取總RNA；采用HiScript 1st Strand cD-NA Synthesis Ki（t南京諾唯贊生物科技股份有限公司，R111-01/02）制備cDNA；最后，以SYBR Green Realtime PCR Master Mix（美國ToYoBo公司，QPK-212）、qRT-PCR儀（美國Bio-Rad公司，CFX96）獲取各指標(biāo)循環(huán)閾值（CT值）。qRT-PCR儀參數(shù)：96.4 ℃5 min；94.5 ℃ 15 s，59.5 ℃ 40 s，62.5 ℃ 20 s，40個(gè)循環(huán)。RORγt、COX-2、Foxp3以GAPDH為內(nèi)參，miR-142-5p以U6為內(nèi)參，引物序列見表1。

表1 miR-143-3p、U6、RORγt、COX-2、Foxp3、GAPDH的引物序列

miR-143-3p、RORγt、COX-2、Foxp3 mRNA相對表達(dá)量以2-ΔΔCt法計(jì)算。

Th17、Treg細(xì)胞水平檢測：取抗凝管內(nèi)的外周血，利用人Ficoll淋巴細(xì)胞分離液（上海瓦蘭生物科技有限公司，wlb1083）按密度梯度離心法獲得外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs），以RPMI 1640培養(yǎng)液（廈門慧嘉生物科技有限公司，GMS12052.4.1）稀釋PBMCs，其密度為1.5×109個(gè)/升，使用流式細(xì)胞儀（美國BD公司，F(xiàn)ACSCanto Ⅱ）測定Th17、Treg細(xì)胞百分比，計(jì)算Th17/Treg。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 SPSS 22.0軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料均符合正態(tài)分布，以表示，行單因素方差分析。采用SNK-q檢驗(yàn)；Pearson相關(guān)法分析SAP病人血清miR-143-3p、COX-2 mRNA表達(dá)水平與外周血Th17、Treg、Th17/Treg、RORγt mRNA、Foxp3 mRNA的相關(guān)性； SAP發(fā)生的影響因素采用logistic回歸分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組血清miR-143-3p、COX-2 mRNA、Th17、Treg、Th17/Treg水平比較 與健康組相比，MAP組、SAP組病人血清miR-143-3p表達(dá)水平及Treg細(xì)胞百分比降低（P＜0.05），COX-2 mRNA表達(dá)水平及Th17細(xì)胞百分比、Th17/Treg升高（P＜0.05）；與MAP組相比，SAP組病人血清miR-143-3p表達(dá)水平及Treg細(xì)胞百分比降低（P＜0.05），COX-2 mRNA表達(dá)水平及Th17細(xì)胞百分比、Th17/Treg升高（P＜0.05）。見表2。

表2 各組血清miR-143-3p、COX-2 mRNA、Th17、Treg、Th17/Treg水平比較/

表2 各組血清miR-143-3p、COX-2 mRNA、Th17、Treg、Th17/Treg水平比較/

注：miR-143-3p為微RNA-143-3p，COX-2為環(huán)氧合酶-2，Th17為輔助性T細(xì)胞17，Treg為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。SAP為重癥急性胰腺炎，MAP為輕癥急性胰腺炎。①與健康組相比，P＜0.05。②與MAP組相比，P＜0.05。

Th17/Treg 0.23±0.08 0.63±0.21①2.46±0.82①②325.93＜0.001組別健康組MAP組SAP組F值P值例數(shù)55 58 45 miR-143-3p 1.04±0.35 0.70±0.23①0.42±0.14①②71.25＜0.001 COX-2 mRNA 1.01±0.34 1.68±0.48①2.37±0.54①②110.46＜0.001 Th17/%1.99±0.66 3.87±1.29①6.71±2.34①②119.40＜0.001 Treg/%8.74±2.91 6.13±2.04①2.73±0.90①②94.93＜0.001

2.2 各組血清RORγt mRNA、Foxp3 mRNA水平比較 與健康組、MAP組相比，SAP組病人血清RORγt mRNA表達(dá)水平升高（P＜0.05），F(xiàn)oxp3 mRNA表達(dá)水平降低（P＜0.05）；與健康組相比，MAP組病人血清RORγt mRNA表達(dá)水平升高（P＜0.05），F(xiàn)oxp3 mRNA表達(dá)水平降低（P＜0.05）。見表3。

表3 各組血清RORγt mRNA、Foxp3 mRNA水平比較/

表3 各組血清RORγt mRNA、Foxp3 mRNA水平比較/

注：RORγt為維甲酸相關(guān)孤核受體，F(xiàn)oxp3為叉頭/翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子3，SAP為重癥急性胰腺炎，MAP為輕癥急性胰腺炎。①與健康組相比，P＜0.05。②與MAP組相比，P＜0.05。

例數(shù)55 58 45 RORγt mRNA 1.05±0.35 1.72±0.57①2.44±0.81①②68.73＜0.001組別健康組MAP組SAP組F值P值Foxp3 mRNA 1.03±0.34 0.56±0.19①0.31±0.11①②119.44＜0.001

2.3 SAP病人血清miR-143-3p、COX-2 mRNA表達(dá)水平與外周血Th17、Treg、Th17/Treg相關(guān)性Pearson相關(guān)法分析顯示，SAP病人血清miR-143-3p表達(dá)水平與Th17、RORγt mRNA、Th17/Treg及血清COX-2 mRNA表達(dá)水平與Treg、Foxp3 mRNA呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）；血清miR-143-3p表達(dá)水平與Treg、Foxp3 mRNA及血清COX-2 mRNA表達(dá)水平與Th17、RORγt mRNA、Th17/Treg呈正相關(guān)（P＜0.05）。SAP病人血清miR-143-3p表達(dá)水平與COX-2 mRNA呈負(fù)相關(guān)（r=-0.40，P=0.070）。見表4。

表4 SAP病人血清miR-143-3p、COX-2 mRNA表達(dá)水平與外周血Th17、Treg、Th17/Treg、RORγt mRNA、Foxp3 mRNA的相關(guān)性

2.4 影響SAP發(fā)生的logistic回歸分析 以SAP是否發(fā)生為因變量（未發(fā)生=0，發(fā)生=1），以Th17、RORγt mRNA、Treg、Foxp3 mRNA、Th17/Treg、miR-143-3p、COX-2 mRNA為自變量，納入logistic回歸分析，結(jié)果顯示，miR-143-3p是影響SAP發(fā)生的保護(hù)因素（P＜0.05），COX-2 mRNA、Th17/Treg是影響SAP發(fā)生的危險(xiǎn)因素（P＜0.05）。見表5。

表5 logistic回歸分析SAP發(fā)生的影響因素

3 討論

SAP是一種全身炎癥反應(yīng)綜合征，其可引發(fā)胰腺組織出血、水腫、壞死，引起多器官功能障礙，甚至導(dǎo)致死亡［10-11］。因此，尋找與SAP病理變化有關(guān)的標(biāo)志物，對診治SAP、改善SAP病人生存質(zhì)量甚是重要。

miRNA是一類非編碼RNA，其可調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，參與免疫調(diào)節(jié)，影響信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，與胰腺癌、膽囊炎、AP等密切相關(guān)［12-14］。研究［15］發(fā)現(xiàn)，miR-143-3p在支氣管哮喘中表達(dá)水平降低，其可能通過影響炎癥反應(yīng)及支氣管細(xì)胞凋亡，從而在支氣管哮喘中發(fā)揮作用；另外，miR-143-3p在胰腺導(dǎo)管腺癌中表達(dá)下調(diào)，其可能靶向結(jié)合有關(guān)基因進(jìn)而抑制胰腺導(dǎo)管腺癌病理發(fā)展，miR-143-3p可能是治療胰腺導(dǎo)管腺癌的潛在靶標(biāo)［16］。本研究中SAP組病人血清miR-143-3p表達(dá)水平低于MAP組、健康組，提示miR-143-3p表達(dá)失調(diào)可能與SAP病理過程相關(guān)，且測定血清miR-143-3p水平，有助于臨床評估AP病人病情，推測miR-143-3p作為miRNA的一員，其可能通過影響炎癥反應(yīng)，進(jìn)而影響SAP發(fā)病過程。COX-2是一種誘導(dǎo)酶，定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核膜，其可被炎性介質(zhì)等多種因子誘導(dǎo)，促進(jìn)炎癥反應(yīng)，加劇組織損傷，與胰腺癌、胰腺炎等關(guān)系密切［17-18］。研究［19］發(fā)現(xiàn)，COX-2在黏液性胰腺囊腫中過表達(dá)，其可能促進(jìn)黏液性胰腺囊腫病理發(fā)展；另外，COX-2在SAP中呈高表達(dá)，COX-2可能參與SAP發(fā)生發(fā)展［20］。本文中SAP組病人血清COX-2 mRNA表達(dá)水平高于MAP組、健康組，與文玲等［20］研究趨勢相符，提示COX-2 mRNA可能與SAP發(fā)展進(jìn)程有關(guān)，其具有評估AP疾病嚴(yán)重程度的價(jià)值，推測COX-2可能促進(jìn)炎癥反應(yīng)進(jìn)而加速SAP發(fā)生發(fā)展。

Th17/Treg平衡是維持機(jī)體免疫平衡的重要環(huán)節(jié)，其在SAP中水平較高，Th17/Treg可能影響SAP發(fā)病進(jìn)程［21］。本文中SAP、MAP組病人Th17細(xì)胞百分比、Th17/Treg高于健康組，Treg細(xì)胞百分比低于健康組，且AP病人病情越嚴(yán)重，Th17細(xì)胞百分比、Th17/Treg越高，Treg細(xì)胞百分比越低，與趙瑞臣等［8］研究結(jié)果相符，提示Th17/Treg失衡可能影響SAP病理進(jìn)展。且RORγt是Th17細(xì)胞的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，其可調(diào)節(jié)IL-17分泌，參與Th17細(xì)胞分化，調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)；另外，F(xiàn)oxp3作為Treg的重要轉(zhuǎn)錄因子，可與染色體結(jié)合，影響Treg細(xì)胞發(fā)育，調(diào)節(jié)有關(guān)基因表達(dá)［22-23］。近期研究發(fā)現(xiàn)，SAP病人RORγt mRNA表達(dá)水平較高，F(xiàn)oxp3 mRNA表達(dá)水平較低，40例SAP病人入院后給予清胰利膽顆粒與床旁CRRT療法聯(lián)合治療后，RORγt mRNA表達(dá)水平降低（t=24.59，P＜0.001），F(xiàn)oxp3 mRNA表達(dá)水平水平升高（t=44.17，P＜0.001），RORγt mRNA、Foxp3 mRNA可能參與SAP疾病進(jìn)展［24］。本研究顯示，SAP、MAP病人血清RORγt mRNA表達(dá)水平高于健康者，血清Foxp3 mRNA表達(dá)水平低于健康者，且SAP病人血清RORγt mRNA表達(dá)水平高于MAP病人，血清Foxp3 mRNA表達(dá)水平低于MAP病人，與李芳等［24］研究相似，提示RORγt mRNA、Foxp3 mRNA 可能與SAP病理發(fā)展有關(guān)，推測RORγt mRNA、Foxp3 mRNA可能通過影響機(jī)體免疫功能，進(jìn)而影響SAP病理過程。

本研究分析了SAP病人血清miR-143-3p、COX-2 mRNA表達(dá)水平與Th17/Treg平衡的關(guān)系，結(jié)果顯示，血清miR-143-3p、COX-2 mRNA表達(dá)水平與Th17、Treg、RORγt mRNA、Foxp3 mRNA、Th17/Treg均顯著相關(guān)，提示miR-143-3p、COX-2 mRNA可能與Th17、Treg、RORγt mRNA、Foxp3 mRNA、Th17/Treg共同影響SAP病理變化。此外，SAP病人血清miR-143-3p表達(dá)水平與COX-2 mRNA呈負(fù)相關(guān)，提示miR-143-3p可能與COX-2 mRNA協(xié)同影響SAP發(fā)生發(fā)展，但其具體機(jī)制有待深入研究。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，血清miR-143-3p水平降低，COX-2 mRNA水平、Th17/Treg升高均可能會升高SAP發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，及時(shí)確定miR-143-3p、COX-2 mRNA、Th17/Treg水平有助于臨床診治SAP。

綜上，SAP病人血清miR-143-3p表達(dá)水平較低，COX-2 mRNA表達(dá)水平較高，miR-143-3p、COX-2 mRNA均與Th17/Treg平衡有關(guān)，miR-143-3p可能是治療SAP的潛在靶標(biāo)。但本研究對miR-143-3p在SAP中的作用機(jī)制研究仍不夠深入，后續(xù)將擴(kuò)大樣本從多角度進(jìn)行研究。