去整合素-金屬蛋白酶17、Notch1及α-平滑肌動(dòng)蛋白在子宮內(nèi)膜異位癥組織中的表達(dá)及意義

湯孟冬，張浩然，崔文杰，潘姿璇，張旭艷，2

作者單位：1濰坊醫(yī)學(xué)院婦產(chǎn)科教研室，山東 濰坊261000；2青島大學(xué)附屬青島市海慈醫(yī)院（青島市中醫(yī)醫(yī)院）婦二科，山東 青島266000

子宮內(nèi)膜異位癥（endometriosis，EMs）是婦科一種良性疾病，其最主要的特征是子宮腔外存在子宮內(nèi)膜的腺體及間質(zhì)［1-2］。這種疾病嚴(yán)重影響病人的生活質(zhì)量，特別是育齡期女性，也是一個(gè)重大的公共衛(wèi)生問題［3-4］。盡管這種疾病的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，但目前研究發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜異位癥是一種復(fù)雜的慢性炎癥狀態(tài)［5］，與前列腺素、金屬蛋白酶、細(xì)胞因子和趨化因子的過度產(chǎn)生有關(guān)，這些炎性因子產(chǎn)生一個(gè)自我支持的循環(huán)，維持并增加疾病的發(fā)展［6］。研究表明炎性因子的過度激活在不同形式子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病和進(jìn)展中起著關(guān)鍵作用，如卵巢子宮內(nèi)膜異位癥和深層浸潤(rùn)性子宮內(nèi)膜異位癥［7］。Notch蛋白是一種跨膜受體，調(diào)節(jié)許多疾病的發(fā)生過程。ADAM家族成員對(duì)多種具有免疫相關(guān)性的靶蛋白（例如Notch1）具有蛋白水解活性［8］。本研究的目的是將ADAM17與Notch介導(dǎo)的纖維化聯(lián)系起來，進(jìn)行EMs的發(fā)病機(jī)制與臨床病理學(xué)的相關(guān)性研究。本課題分析ADAM17、Notch1、α-SMA在EMs異位內(nèi)膜、在位內(nèi)膜與正常內(nèi)膜中的表達(dá)差異，評(píng)估這三種因子在EMs中的作用，并評(píng)估不同分期的EMs中ADAM17的表達(dá)程度與纖維化嚴(yán)重程度的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019年10月至2020年10月在濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院婦科行腹腔鏡手術(shù)治療的卵巢型子宮內(nèi)膜異位癥病人40例為異位內(nèi)膜組，手術(shù)過程中留取卵巢型子宮內(nèi)膜異位癥囊腫的囊壁組織；同期選取因子宮切除或行刮宮術(shù)獲得子宮內(nèi)膜的在位內(nèi)膜組25例；因子宮肌瘤而行全子宮切除術(shù)獲得正常子宮內(nèi)膜的正常內(nèi)膜組25例。三組年齡范圍為25～50歲，年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05） 。按 1996年美國(guó)生殖醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)修改的子宮內(nèi)膜異位癥r-AFS分期，分為Ⅰ～Ⅱ期20例，Ⅲ～ Ⅳ期20例。所有例數(shù)在手術(shù)治療之前的6個(gè)月均未接受激素及其他抗子宮內(nèi)膜異位癥藥物治療，未手術(shù)治療且生化指標(biāo)及血常規(guī)指標(biāo)均正常。知情同意書均術(shù)前簽署。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.2 方法 三組組織分別以10%甲醛液固定，石蠟包埋，3 μm連續(xù)切片，HE染色后顯微鏡下能觀察到典型子宮內(nèi)膜組織者為入選標(biāo)本。免疫組化Envision二步法處理標(biāo)，將組織切片置0.01 mol/L檸檬酸緩沖液（pH 6.0）中高火煮沸，轉(zhuǎn)至低火煮15 min。除去PBS，將內(nèi)源性過氧化物酶阻斷加入在切片組織區(qū)域，室溫孵育30 min，蒸餾水沖洗，0.01 mol/L PBS 液洗滌。除去PBS，加非特異染色阻斷劑，37 ℃孵育60 min。除去非特異性染色阻斷劑，加一抗，除去PBS，加生物素標(biāo)記的IgG聚合物，室溫孵育50 min，蒸餾水沖洗，用0.01 mol/L的PBS液洗滌4次，每次均5 min。除去PBS，加鏈霉菌抗生素蛋白-過氧化物酶，室溫孵育30 min，蒸餾水沖洗，0.01 mol/L PBS 液洗滌。除去PBS，加DAB顯色液顯色，室溫孵育，顯微鏡下觀察呈色效果，蒸餾水終止反應(yīng)，蘇木素復(fù)染，流水沖洗藍(lán)，中性樹膠封片，用顯微鏡觀察。

1.3 結(jié)果判斷 ADAM17、Notch1、α-SMA的染色結(jié)果根據(jù)Watanabe免疫組化半定量評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)： 高倍鏡（×400）下對(duì)每張切片任意選5個(gè)視野，計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞/視野，共計(jì)1 000個(gè)細(xì)胞，觀察陽性細(xì)胞的表達(dá)強(qiáng)度，視野中無表達(dá)為陰性（0分）、細(xì)胞呈淺黃色為可疑陽性（1分）、棕黃色為陽性（2分）、棕褐色為強(qiáng)陽性（3分）。計(jì)算陽性細(xì)胞的表達(dá)個(gè)數(shù)（取5個(gè)視野的平均數(shù)），無表達(dá)為陰性（0分）、1%～15%為可疑（1分）、16%～50%為弱陽性（2分）、51%～75%為陽性（3分）、76%～100%為強(qiáng)陽性（4分）。評(píng)分結(jié)果：1～2分為陰性（-）；3～4分為弱陽性（+） ； 5～7分為中等陽性（2+）；＞7分為強(qiáng)陽性（3+）。結(jié)果判斷均由兩名高年資病理醫(yī)生盲法判斷。

1.4 指標(biāo)觀察 比較三種不同內(nèi)膜組織中ADAM17、Notch1、α-SMA的表達(dá)；分析子宮內(nèi)膜異位癥中異位內(nèi)膜組織中ADAM17、Notch1、α-SMA的表達(dá)與病理特征的關(guān)系；采用Pearson相關(guān)分析法分析ADAM17、Notch1、α-SMA在三組中表達(dá)的相關(guān)性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)通過SPSS 25進(jìn)行分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)運(yùn)用表述，兩組比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較釆用單因素方差分析（one-way ANOVA），相關(guān)性分析用GraphPad PRISM 7進(jìn)行Pearson分析，并完成制圖，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ADAM17、Notch1、α-SMA在免疫組化中的表達(dá) ADAM17、Notch1、α-SMA主要表達(dá)于腺上皮細(xì)胞及部分間質(zhì)胞質(zhì)中，ADAM17、Notch1主要表達(dá)于細(xì)胞胞質(zhì)中，α-SMA主要表達(dá)于間質(zhì)中。可發(fā)現(xiàn)三者在正常內(nèi)膜、EMs在位內(nèi)膜及異位內(nèi)膜組織中的染色強(qiáng)度為淺黃色至棕褐色，與切片的背景對(duì)比發(fā)現(xiàn)，EMs異位內(nèi)膜及在位內(nèi)膜中的細(xì)胞表達(dá)數(shù)量及染色深度明顯高于正常內(nèi)膜，表達(dá)強(qiáng)度比較為EMs異位內(nèi)膜＞EMs在位內(nèi)膜＞正常內(nèi)膜。見圖1。

圖1 ADAM17、Notch1及α-SMA在三種子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)（免疫組化染色×200）

2.2 ADAM17、Notch1、α-SMA表達(dá)的相關(guān)性 異位內(nèi)膜組中ADAM17、Notch1、α-SMA的表達(dá)均呈高水平，高于在位內(nèi)膜組及正常內(nèi)膜組，在位內(nèi)膜組中表達(dá)均高于正常內(nèi)膜組，均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

表1 三組子宮內(nèi)膜中ADAM17、Notch1、α-SMA的表達(dá)/

表1 三組子宮內(nèi)膜中ADAM17、Notch1、α-SMA的表達(dá)/

組別異位內(nèi)膜組在位內(nèi)膜組正常內(nèi)膜組F值P值例數(shù)40 25 25 Watanabe 免疫組化半定量評(píng)分值A(chǔ)DAM17 4.77±1.35 3.24±1.09 2.36±1.22 30.98＜0.001 Notch1 4.40±1.24 3.44±0.96 2.24±1.01 29.49＜0.001 α-SMA 4.42±1.30 3.36±0.95 2.16±1.03 30.67＜0.001

異位內(nèi)膜組中ADAM17、Notch1、α-SMA三者之間均呈兩兩正相關(guān)（P＜0.001）。在位內(nèi)膜組中ADAM17、Notch1、α-SMA三者之間均呈兩兩正相關(guān)（P＜0.001）。正常內(nèi)膜組中ADAM17、Notch1、α-SMA三者之間均無明顯相關(guān)性（P＞0.05）。見表2。

表2 ADAM17、Notch1、α-SMA在三組子宮內(nèi)膜組織中表達(dá)的相關(guān)性

2.3 ADAM17、Notch1、α-SMA與臨床病理特征的相關(guān)性表達(dá) 異位內(nèi)膜組中ADAM17、Notch1、α-SMA在Ⅲ～Ⅳ期中的表達(dá)高于Ⅰ～Ⅱ期，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。在EMs病人中異位內(nèi)膜組中ADAM17、NOTCH1、α-SMA的表達(dá)與年齡和囊腫長(zhǎng)徑差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表3 ADAM17、NOTCH1、α-SMA在異位內(nèi)膜組織中的表達(dá)與病理特征的關(guān)系/

表3 ADAM17、NOTCH1、α-SMA在異位內(nèi)膜組織中的表達(dá)與病理特征的關(guān)系/

組別EMs分期例數(shù)ADAM17NOTCH1α-SMAⅠ～Ⅱ期Ⅲ～Ⅳ期t值P值囊腫長(zhǎng)徑≤5 cm＞5 cm t值P值年齡≤35歲＞35歲t值P值-5.37＜0.001-5.98＜0.001-5.75＜0.001 24 16 4.74±1.33 4.88±1.41-0.38 0.707 4.38±1.25 4.44±1.26-0.16 0.878 4.39±1.37 4.63±1.20-0.79 0.434 22 18 4.68±1.56 4.89±1.08-0.48 0.635 4.45±1.34 4.33±1.14 0.30 0.762 4.27±1.42 4.61±1.43-0.82 0.419 20 20 3.90±1.07 5.65±0.99 3.55±0.10 5.25±0.79 3.55±0.19 5.30±1.08

3 討論

EMs是子宮內(nèi)膜的腺體和間質(zhì)出現(xiàn)在子宮體以外的部位，可根據(jù)病理類型分為卵巢型、腹膜型和深部浸潤(rùn)型等，繼發(fā)性痛經(jīng)進(jìn)行性加重是其最主要的臨床表現(xiàn)［9-10］。1921年Sampson提出經(jīng)血逆流與種植理論，即經(jīng)血逆流后，具有活性的子宮內(nèi)膜細(xì)胞黏附在腹膜表面逐漸形成子宮內(nèi)膜異位組織。該學(xué)說不能解釋大多數(shù)女性都會(huì)出現(xiàn)經(jīng)血逆流，但只有一部分女性出現(xiàn)EMs這一現(xiàn)象［11］。2005年郎景和院士提出子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病的“在位內(nèi)膜決定論”，研究證明了EMs病人和非EMs病人的在位內(nèi)膜在血管形成、黏附肌侵襲性等能力均有差異，通過獼猴動(dòng)物的模型構(gòu)建，更說明了EMs的“在位內(nèi)膜決定論”［12］。目前研究發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜在盆腔內(nèi)的擴(kuò)散、附著、植入和纖維化，以及異位病變的形成和發(fā)展，受到多個(gè)因子的綜合影響［13-14］。

ADAM17作為一種具有膜黏附的金屬蛋白酶，在細(xì)胞分化和細(xì)胞增殖中起到一定的作用，通過脫落生長(zhǎng)因子和激活表皮生長(zhǎng)因子受體信號(hào)，對(duì)多種具有免疫相關(guān)性的靶蛋白（例如Notch1）具有蛋白水解功能［6］。子宮內(nèi)膜異位癥的遷移、黏附、血管生成、等類腫瘤行為，ADAM17作為一種膜黏附的蛋白酶，亦在子宮內(nèi)膜異位的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用［7］。氧化應(yīng)激能夠誘導(dǎo)去整合素、金屬蛋白酶家族的一些成員的合成，并在不同形式的EMs如卵巢EMs和深部浸潤(rùn)性EMs的發(fā)病和進(jìn)展中起著關(guān)鍵作用。Foruria等［16］發(fā)現(xiàn)ADAM17/Notch信號(hào)通路在EMs中的作用。ADAM17、Notch1、Jagged1和Hes1在小鼠的子宮異位癥中過度表達(dá)，會(huì)導(dǎo)致輔助T細(xì)胞（TH）17的增加和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Tregs）的減少，會(huì)導(dǎo)致小鼠EMs的增加。阻斷Notch信號(hào)可以減少骨髓源性抑制細(xì)胞（MDSCs）（未成熟髓系細(xì)胞的異質(zhì)性亞群），從而減少EMs的發(fā)生［16］。與沒有EMs的正常女性相比，由于ADAM17基因轉(zhuǎn)錄的激活，導(dǎo)致ADAM17蛋白在EMs異位組織中的過度表達(dá)。盡管以前曾報(bào)道過EMs病人異位部位腺上皮和腔上皮中ADAM17蛋白水平升高，但這種蛋白表達(dá)增強(qiáng)與ADAM17轉(zhuǎn)錄物水平的變化無關(guān)［17-18］。ADAM17表達(dá)水平的這些細(xì)胞變化與病變實(shí)體、月經(jīng)周期無關(guān)［19］。因此，細(xì)胞內(nèi)ADAM17調(diào)節(jié)過程的更強(qiáng)激活可能存在生物學(xué)選擇，支持異位病變的形成并促進(jìn)其存活，例如增強(qiáng)子宮內(nèi)膜細(xì)胞遷移、黏附和侵襲，炎癥反應(yīng)增加和免疫反應(yīng)受損，這些還需進(jìn)一步研究。本課題研究發(fā)現(xiàn)，ADAM17在EMs病變中的表達(dá)高于在位子宮內(nèi)膜，并且與對(duì)照組相比，患有EMs的女性在位子宮內(nèi)膜中的ADAM17表達(dá)也更高，再次證實(shí)了EMs的“在位內(nèi)膜決定論”，這與國(guó)內(nèi)外研究一致，ADAM17在EMs的發(fā)生及發(fā)展中起到促進(jìn)作用。EMs異位組織對(duì)照術(shù)中按r-AFS進(jìn)行分期，發(fā)現(xiàn)ADAM17在Ⅲ～Ⅳ期的表達(dá)明顯高于Ⅰ～Ⅱ期，表明該因子與內(nèi)異癥的嚴(yán)重程度及進(jìn)展有關(guān)。本課題也發(fā)現(xiàn)，ADAM17、Notch1及α-SMA在內(nèi)異癥的異位內(nèi)膜組織中呈正相關(guān)表達(dá)，表明ADAM17協(xié)同Notch1促進(jìn)EMs的纖維化。

Notch信號(hào)是一種高度保守的跨越種系的通路，廣泛見于多細(xì)胞生物的機(jī)體。它在細(xì)胞間通信中發(fā)揮作用，調(diào)節(jié)各種細(xì)胞在胚胎和人類中的發(fā)育進(jìn)程［20］。Notch信號(hào)是通過4個(gè)跨膜的受體（Notch 1-4）及5個(gè)跨膜的配基來表達(dá)的。Notch的活化主要依靠功能重組信號(hào)序列結(jié)合蛋白的啟動(dòng)，誘導(dǎo)鄰近的細(xì)胞產(chǎn)生與其受體及配基之間的交互反應(yīng)，從而引發(fā)一系列的受體破壞，從而使Notch胞內(nèi)區(qū)的形成得以實(shí)現(xiàn)。然后，將缺口胞內(nèi)域（notch intracellular domain ，NICD）切入細(xì)胞核，與Notch家族的轉(zhuǎn)錄因子重組信號(hào)鍵結(jié)合，進(jìn)而啟動(dòng) Notch靶標(biāo)基因的表達(dá)［21-22］。目前發(fā)現(xiàn)皮膚、肺、腎和心臟纖維化與Notch激活有關(guān)，細(xì)胞內(nèi)NICD異位到細(xì)胞核內(nèi)，可直接啟動(dòng)細(xì)胞核內(nèi)合成α-SMA和膠原纖維Ⅱ基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，誘導(dǎo)纖維組織增生引起的纖維變性［23］。本課題組研究發(fā)現(xiàn)，Notch1在EMs異位病變中的表達(dá)高于在位子宮內(nèi)膜，并且與對(duì)照組相比，患有EMs在位子宮內(nèi)膜中的Notch1也表達(dá)，均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這說明Notch在EMs的發(fā)生及發(fā)展中起到促進(jìn)作用。在于ADAM17的相關(guān)性分析中發(fā)現(xiàn)，ADAM17、Notch1在子宮內(nèi)膜的異位內(nèi)膜組織中呈正相關(guān)，由此可見，Notch通路在EMs中起到促進(jìn)作用，這一通路的研究發(fā)現(xiàn)為內(nèi)異病的診治提供了新途徑。

α-SMA是平滑肌細(xì)胞的標(biāo)志，是檢測(cè)細(xì)胞上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化的指標(biāo)，這一蛋白質(zhì)活化在纖維的生成過程中起關(guān)鍵作用，可作為檢測(cè)組織纖維化的指標(biāo)。EMs過度纖維化可通過臨床表現(xiàn)有所體現(xiàn)，卵巢型EMs主要因粘連和疤痕形成導(dǎo)致病人疼痛和不孕等臨床表現(xiàn)。在患有EMs病人的卵巢中可觀察到伴隨卵泡丟失的纖維化現(xiàn)象，表明該疾病導(dǎo)致卵巢功能改變［24-25］。纖維化是EMs病理生理學(xué)機(jī)制發(fā)展的重要過程［26］。抑制纖維組織的形成可能是治療EMs的一個(gè)方向。本課題研究發(fā)現(xiàn)，EMs病人的異位內(nèi)膜組與ADAM17、Notch1及α-SMA的表達(dá)水平之間存在顯著正相關(guān)，與對(duì)照組相比，EMs在位內(nèi)膜組織表達(dá)水平也顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示ADAM17與Notch1促進(jìn)EMs的纖維化，參與EMs的發(fā)病機(jī)制。ADAM17可能通過Notch通路引起EMs纖維化。更重要的是，我們的研究發(fā)現(xiàn)EMs中Ⅲ～Ⅳ期病人的異位組織中，三者的表達(dá)均高于Ⅰ～Ⅱ期，這就表明ADAM17可能通過Notch通路調(diào)控內(nèi)異癥的纖維化嚴(yán)重程度，可以為治療內(nèi)異病的臨床研究開辟新途徑。從而為臨床上對(duì)內(nèi)異癥的治療提供了新的思路。

本課題的研究生發(fā)現(xiàn)ADAM17、Notch1及α-SMA在EMs異位內(nèi)膜的中的表達(dá)與病人的年齡及囊腫大小無關(guān)，但與分期呈正相關(guān)，即卵巢型子宮異位癥的纖維化程度與ADAM17及Notch1的表達(dá)呈正相關(guān)，說明干擾這兩者的表達(dá)，可能會(huì)減輕EMs的纖維化，但仍需進(jìn)行相關(guān)抑制劑研究來證實(shí)。

4 結(jié)論

ADAM17、Notch1及α-SMA在異位內(nèi)膜中較在位內(nèi)膜及正常內(nèi)膜中表達(dá)均偏高，在位內(nèi)膜中ADAM17、Notch1和α- SMA的表達(dá)比正常的內(nèi)膜高，符合“在位內(nèi)膜決定論”，提示這三種蛋白在EMs的發(fā)生、發(fā)展中起到重要的作用。三者在異位內(nèi)膜及在位內(nèi)膜中均兩兩呈正相關(guān)，提示ADAM17可能通過Notch通路參與EMs的纖維化發(fā)生。三者在內(nèi)異癥Ⅲ～Ⅳ期病人的異位內(nèi)膜的表達(dá)均高于Ⅰ～Ⅱ期，提示ADAM17可能通過Notch通路調(diào)控EMs的纖維化嚴(yán)重程度。

關(guān)于ADAM17在健康和疾病中的結(jié)構(gòu)和功能已經(jīng)有大量研究，ADAM17參與免疫系統(tǒng)、纖維化和癌癥進(jìn)展的關(guān)鍵途徑，抑制ADAM17已被證明是一種有前途的治療策略［26-28］。盡管如此，仍需進(jìn)行進(jìn)一步研究，以開發(fā)新的特異性ADAM17抑制劑，并測(cè)試其EMs進(jìn)展中的益處。盡管本課題為EMs的病因和尋找有效的治療目標(biāo)，仍有待深入地研究。

我們通過免疫組化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ADAM17、Notch1及α-SMA在異位內(nèi)膜、在位內(nèi)膜及正常內(nèi)膜中有不同程度的表達(dá)，定位表達(dá)亦能明顯觀察到，但定量不明確，內(nèi)容較簡(jiǎn)單，樣本數(shù)較局限，可考慮聯(lián)合其他醫(yī)院樣本進(jìn)行研究。希望之后的實(shí)驗(yàn)可結(jié)合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)進(jìn)行更系統(tǒng)的研究，并結(jié)合相關(guān)抑制劑進(jìn)行研究。