湯孟冬,張浩然,崔文杰,潘姿璇,張旭艷,2
作者單位:1濰坊醫(yī)學(xué)院婦產(chǎn)科教研室,山東 濰坊261000;2青島大學(xué)附屬青島市海慈醫(yī)院(青島市中醫(yī)醫(yī)院)婦二科,山東 青島266000
子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis,EMs)是婦科一種良性疾病,其最主要的特征是子宮腔外存在子宮內(nèi)膜的腺體及間質(zhì)[1-2]。這種疾病嚴(yán)重影響病人的生活質(zhì)量,特別是育齡期女性,也是一個(gè)重大的公共衛(wèi)生問(wèn)題[3-4]。盡管這種疾病的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚,但目前研究發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜異位癥是一種復(fù)雜的慢性炎癥狀態(tài)[5],與前列腺素、金屬蛋白酶、細(xì)胞因子和趨化因子的過(guò)度產(chǎn)生有關(guān),這些炎性因子產(chǎn)生一個(gè)自我支持的循環(huán),維持并增加疾病的發(fā)展[6]。研究表明炎性因子的過(guò)度激活在不同形式子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病和進(jìn)展中起著關(guān)鍵作用,如卵巢子宮內(nèi)膜異位癥和深層浸潤(rùn)性子宮內(nèi)膜異位癥[7]。Notch蛋白是一種跨膜受體,調(diào)節(jié)許多疾病的發(fā)生過(guò)程。ADAM家族成員對(duì)多種具有免疫相關(guān)性的靶蛋白(例如Notch1)具有蛋白水解活性[8]。本研究的目的是將ADAM17與Notch介導(dǎo)的纖維化聯(lián)系起來(lái),進(jìn)行EMs的發(fā)病機(jī)制與臨床病理學(xué)的相關(guān)性研究。本課題分析ADAM17、Notch1、α-SMA在EMs異位內(nèi)膜、在位內(nèi)膜與正常內(nèi)膜中的表達(dá)差異,評(píng)估這三種因子在EMs中的作用,并評(píng)估不同分期的EMs中ADAM17的表達(dá)程度與纖維化嚴(yán)重程度的關(guān)系。
1.1 一般資料 選取2019年10月至2020年10月在濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院婦科行腹腔鏡手術(shù)治療的卵巢型子宮內(nèi)膜異位癥病人40例為異位內(nèi)膜組,手術(shù)過(guò)程中留取卵巢型子宮內(nèi)膜異位癥囊腫的囊壁組織;同期選取因子宮切除或行刮宮術(shù)獲得子宮內(nèi)膜的在位內(nèi)膜組25例;因子宮肌瘤而行全子宮切除術(shù)獲得正常子宮內(nèi)膜的正常內(nèi)膜組25例。三組年齡范圍為25~50歲,年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05) 。按 1996年美國(guó)生殖醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)修改的子宮內(nèi)膜異位癥r-AFS分期,分為Ⅰ~Ⅱ期20例,Ⅲ~ Ⅳ期20例。所有例數(shù)在手術(shù)治療之前的6個(gè)月均未接受激素及其他抗子宮內(nèi)膜異位癥藥物治療,未手術(shù)治療且生化指標(biāo)及血常規(guī)指標(biāo)均正常。知情同意書均術(shù)前簽署。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。
1.2 方法 三組組織分別以10%甲醛液固定,石蠟包埋,3 μm連續(xù)切片,HE染色后顯微鏡下能觀察到典型子宮內(nèi)膜組織者為入選標(biāo)本。免疫組化Envision二步法處理標(biāo),將組織切片置0.01 mol/L檸檬酸緩沖液(pH 6.0)中高火煮沸,轉(zhuǎn)至低火煮15 min。除去PBS,將內(nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷加入在切片組織區(qū)域,室溫孵育30 min,蒸餾水沖洗,0.01 mol/L PBS 液洗滌。除去PBS,加非特異染色阻斷劑,37 ℃孵育60 min。除去非特異性染色阻斷劑,加一抗,除去PBS,加生物素標(biāo)記的IgG聚合物,室溫孵育50 min,蒸餾水沖洗,用0.01 mol/L的PBS液洗滌4次,每次均5 min。除去PBS,加鏈霉菌抗生素蛋白-過(guò)氧化物酶,室溫孵育30 min,蒸餾水沖洗,0.01 mol/L PBS 液洗滌。除去PBS,加DAB顯色液顯色,室溫孵育,顯微鏡下觀察呈色效果,蒸餾水終止反應(yīng),蘇木素復(fù)染,流水沖洗藍(lán),中性樹膠封片,用顯微鏡觀察。
1.3 結(jié)果判斷 ADAM17、Notch1、α-SMA的染色結(jié)果根據(jù)Watanabe免疫組化半定量評(píng)分標(biāo)準(zhǔn): 高倍鏡(×400)下對(duì)每張切片任意選5個(gè)視野,計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞/視野,共計(jì)1 000個(gè)細(xì)胞,觀察陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)強(qiáng)度,視野中無(wú)表達(dá)為陰性(0分)、細(xì)胞呈淺黃色為可疑陽(yáng)性(1分)、棕黃色為陽(yáng)性(2分)、棕褐色為強(qiáng)陽(yáng)性(3分)。計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)個(gè)數(shù)(取5個(gè)視野的平均數(shù)),無(wú)表達(dá)為陰性(0分)、1%~15%為可疑(1分)、16%~50%為弱陽(yáng)性(2分)、51%~75%為陽(yáng)性(3分)、76%~100%為強(qiáng)陽(yáng)性(4分)。評(píng)分結(jié)果:1~2分為陰性(-);3~4分為弱陽(yáng)性(+) ; 5~7分為中等陽(yáng)性(2+);>7分為強(qiáng)陽(yáng)性(3+)。結(jié)果判斷均由兩名高年資病理醫(yī)生盲法判斷。
1.4 指標(biāo)觀察 比較三種不同內(nèi)膜組織中ADAM17、Notch1、α-SMA的表達(dá);分析子宮內(nèi)膜異位癥中異位內(nèi)膜組織中ADAM17、Notch1、α-SMA的表達(dá)與病理特征的關(guān)系;采用Pearson相關(guān)分析法分析ADAM17、Notch1、α-SMA在三組中表達(dá)的相關(guān)性。
1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)通過(guò)SPSS 25進(jìn)行分析,計(jì)量資料數(shù)據(jù)運(yùn)用表述,兩組比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),多組間比較釆用單因素方差分析(one-way ANOVA),相關(guān)性分析用GraphPad PRISM 7進(jìn)行Pearson分析,并完成制圖,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 ADAM17、Notch1、α-SMA在免疫組化中的表達(dá) ADAM17、Notch1、α-SMA主要表達(dá)于腺上皮細(xì)胞及部分間質(zhì)胞質(zhì)中,ADAM17、Notch1主要表達(dá)于細(xì)胞胞質(zhì)中,α-SMA主要表達(dá)于間質(zhì)中。可發(fā)現(xiàn)三者在正常內(nèi)膜、EMs在位內(nèi)膜及異位內(nèi)膜組織中的染色強(qiáng)度為淺黃色至棕褐色,與切片的背景對(duì)比發(fā)現(xiàn),EMs異位內(nèi)膜及在位內(nèi)膜中的細(xì)胞表達(dá)數(shù)量及染色深度明顯高于正常內(nèi)膜,表達(dá)強(qiáng)度比較為EMs異位內(nèi)膜>EMs在位內(nèi)膜>正常內(nèi)膜。見(jiàn)圖1。
圖1 ADAM17、Notch1及α-SMA在三種子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)(免疫組化染色×200)
2.2 ADAM17、Notch1、α-SMA表達(dá)的相關(guān)性 異位內(nèi)膜組中ADAM17、Notch1、α-SMA的表達(dá)均呈高水平,高于在位內(nèi)膜組及正常內(nèi)膜組,在位內(nèi)膜組中表達(dá)均高于正常內(nèi)膜組,均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1。
表1 三組子宮內(nèi)膜中ADAM17、Notch1、α-SMA的表達(dá)/
表1 三組子宮內(nèi)膜中ADAM17、Notch1、α-SMA的表達(dá)/
組別異位內(nèi)膜組在位內(nèi)膜組正常內(nèi)膜組F值P值例數(shù)40 25 25 Watanabe 免疫組化半定量評(píng)分值A(chǔ)DAM17 4.77±1.35 3.24±1.09 2.36±1.22 30.98<0.001 Notch1 4.40±1.24 3.44±0.96 2.24±1.01 29.49<0.001 α-SMA 4.42±1.30 3.36±0.95 2.16±1.03 30.67<0.001
異位內(nèi)膜組中ADAM17、Notch1、α-SMA三者之間均呈兩兩正相關(guān)(P<0.001)。在位內(nèi)膜組中ADAM17、Notch1、α-SMA三者之間均呈兩兩正相關(guān)(P<0.001)。正常內(nèi)膜組中ADAM17、Notch1、α-SMA三者之間均無(wú)明顯相關(guān)性(P>0.05)。見(jiàn)表2。
表2 ADAM17、Notch1、α-SMA在三組子宮內(nèi)膜組織中表達(dá)的相關(guān)性
2.3 ADAM17、Notch1、α-SMA與臨床病理特征的相關(guān)性表達(dá) 異位內(nèi)膜組中ADAM17、Notch1、α-SMA在Ⅲ~Ⅳ期中的表達(dá)高于Ⅰ~Ⅱ期,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。在EMs病人中異位內(nèi)膜組中ADAM17、NOTCH1、α-SMA的表達(dá)與年齡和囊腫長(zhǎng)徑差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3。
表3 ADAM17、NOTCH1、α-SMA在異位內(nèi)膜組織中的表達(dá)與病理特征的關(guān)系/
表3 ADAM17、NOTCH1、α-SMA在異位內(nèi)膜組織中的表達(dá)與病理特征的關(guān)系/
組別EMs分期例數(shù)ADAM17NOTCH1α-SMAⅠ~Ⅱ期Ⅲ~Ⅳ期t值P值囊腫長(zhǎng)徑≤5 cm>5 cm t值P值年齡≤35歲>35歲t值P值-5.37<0.001-5.98<0.001-5.75<0.001 24 16 4.74±1.33 4.88±1.41-0.38 0.707 4.38±1.25 4.44±1.26-0.16 0.878 4.39±1.37 4.63±1.20-0.79 0.434 22 18 4.68±1.56 4.89±1.08-0.48 0.635 4.45±1.34 4.33±1.14 0.30 0.762 4.27±1.42 4.61±1.43-0.82 0.419 20 20 3.90±1.07 5.65±0.99 3.55±0.10 5.25±0.79 3.55±0.19 5.30±1.08
EMs是子宮內(nèi)膜的腺體和間質(zhì)出現(xiàn)在子宮體以外的部位,可根據(jù)病理類型分為卵巢型、腹膜型和深部浸潤(rùn)型等,繼發(fā)性痛經(jīng)進(jìn)行性加重是其最主要的臨床表現(xiàn)[9-10]。1921年Sampson提出經(jīng)血逆流與種植理論,即經(jīng)血逆流后,具有活性的子宮內(nèi)膜細(xì)胞黏附在腹膜表面逐漸形成子宮內(nèi)膜異位組織。該學(xué)說(shuō)不能解釋大多數(shù)女性都會(huì)出現(xiàn)經(jīng)血逆流,但只有一部分女性出現(xiàn)EMs這一現(xiàn)象[11]。2005年郎景和院士提出子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病的“在位內(nèi)膜決定論”,研究證明了EMs病人和非EMs病人的在位內(nèi)膜在血管形成、黏附肌侵襲性等能力均有差異,通過(guò)獼猴動(dòng)物的模型構(gòu)建,更說(shuō)明了EMs的“在位內(nèi)膜決定論”[12]。目前研究發(fā)現(xiàn),子宮內(nèi)膜在盆腔內(nèi)的擴(kuò)散、附著、植入和纖維化,以及異位病變的形成和發(fā)展,受到多個(gè)因子的綜合影響[13-14]。
ADAM17作為一種具有膜黏附的金屬蛋白酶,在細(xì)胞分化和細(xì)胞增殖中起到一定的作用,通過(guò)脫落生長(zhǎng)因子和激活表皮生長(zhǎng)因子受體信號(hào),對(duì)多種具有免疫相關(guān)性的靶蛋白(例如Notch1)具有蛋白水解功能[6]。子宮內(nèi)膜異位癥的遷移、黏附、血管生成、等類腫瘤行為,ADAM17作為一種膜黏附的蛋白酶,亦在子宮內(nèi)膜異位的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用[7]。氧化應(yīng)激能夠誘導(dǎo)去整合素、金屬蛋白酶家族的一些成員的合成,并在不同形式的EMs如卵巢EMs和深部浸潤(rùn)性EMs的發(fā)病和進(jìn)展中起著關(guān)鍵作用。Foruria等[16]發(fā)現(xiàn)ADAM17/Notch信號(hào)通路在EMs中的作用。ADAM17、Notch1、Jagged1和Hes1在小鼠的子宮異位癥中過(guò)度表達(dá),會(huì)導(dǎo)致輔助T細(xì)胞(TH)17的增加和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)的減少,會(huì)導(dǎo)致小鼠EMs的增加。阻斷Notch信號(hào)可以減少骨髓源性抑制細(xì)胞(MDSCs)(未成熟髓系細(xì)胞的異質(zhì)性亞群),從而減少EMs的發(fā)生[16]。與沒(méi)有EMs的正常女性相比,由于ADAM17基因轉(zhuǎn)錄的激活,導(dǎo)致ADAM17蛋白在EMs異位組織中的過(guò)度表達(dá)。盡管以前曾報(bào)道過(guò)EMs病人異位部位腺上皮和腔上皮中ADAM17蛋白水平升高,但這種蛋白表達(dá)增強(qiáng)與ADAM17轉(zhuǎn)錄物水平的變化無(wú)關(guān)[17-18]。ADAM17表達(dá)水平的這些細(xì)胞變化與病變實(shí)體、月經(jīng)周期無(wú)關(guān)[19]。因此,細(xì)胞內(nèi)ADAM17調(diào)節(jié)過(guò)程的更強(qiáng)激活可能存在生物學(xué)選擇,支持異位病變的形成并促進(jìn)其存活,例如增強(qiáng)子宮內(nèi)膜細(xì)胞遷移、黏附和侵襲,炎癥反應(yīng)增加和免疫反應(yīng)受損,這些還需進(jìn)一步研究。本課題研究發(fā)現(xiàn),ADAM17在EMs病變中的表達(dá)高于在位子宮內(nèi)膜,并且與對(duì)照組相比,患有EMs的女性在位子宮內(nèi)膜中的ADAM17表達(dá)也更高,再次證實(shí)了EMs的“在位內(nèi)膜決定論”,這與國(guó)內(nèi)外研究一致,ADAM17在EMs的發(fā)生及發(fā)展中起到促進(jìn)作用。EMs異位組織對(duì)照術(shù)中按r-AFS進(jìn)行分期,發(fā)現(xiàn)ADAM17在Ⅲ~Ⅳ期的表達(dá)明顯高于Ⅰ~Ⅱ期,表明該因子與內(nèi)異癥的嚴(yán)重程度及進(jìn)展有關(guān)。本課題也發(fā)現(xiàn),ADAM17、Notch1及α-SMA在內(nèi)異癥的異位內(nèi)膜組織中呈正相關(guān)表達(dá),表明ADAM17協(xié)同Notch1促進(jìn)EMs的纖維化。
Notch信號(hào)是一種高度保守的跨越種系的通路,廣泛見(jiàn)于多細(xì)胞生物的機(jī)體。它在細(xì)胞間通信中發(fā)揮作用,調(diào)節(jié)各種細(xì)胞在胚胎和人類中的發(fā)育進(jìn)程[20]。Notch信號(hào)是通過(guò)4個(gè)跨膜的受體(Notch 1-4)及5個(gè)跨膜的配基來(lái)表達(dá)的。Notch的活化主要依靠功能重組信號(hào)序列結(jié)合蛋白的啟動(dòng),誘導(dǎo)鄰近的細(xì)胞產(chǎn)生與其受體及配基之間的交互反應(yīng),從而引發(fā)一系列的受體破壞,從而使Notch胞內(nèi)區(qū)的形成得以實(shí)現(xiàn)。然后,將缺口胞內(nèi)域(notch intracellular domain ,NICD)切入細(xì)胞核,與Notch家族的轉(zhuǎn)錄因子重組信號(hào)鍵結(jié)合,進(jìn)而啟動(dòng) Notch靶標(biāo)基因的表達(dá)[21-22]。目前發(fā)現(xiàn)皮膚、肺、腎和心臟纖維化與Notch激活有關(guān),細(xì)胞內(nèi)NICD異位到細(xì)胞核內(nèi),可直接啟動(dòng)細(xì)胞核內(nèi)合成α-SMA和膠原纖維Ⅱ基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯,誘導(dǎo)纖維組織增生引起的纖維變性[23]。本課題組研究發(fā)現(xiàn),Notch1在EMs異位病變中的表達(dá)高于在位子宮內(nèi)膜,并且與對(duì)照組相比,患有EMs在位子宮內(nèi)膜中的Notch1也表達(dá),均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這說(shuō)明Notch在EMs的發(fā)生及發(fā)展中起到促進(jìn)作用。在于ADAM17的相關(guān)性分析中發(fā)現(xiàn),ADAM17、Notch1在子宮內(nèi)膜的異位內(nèi)膜組織中呈正相關(guān),由此可見(jiàn),Notch通路在EMs中起到促進(jìn)作用,這一通路的研究發(fā)現(xiàn)為內(nèi)異病的診治提供了新途徑。
α-SMA是平滑肌細(xì)胞的標(biāo)志,是檢測(cè)細(xì)胞上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化的指標(biāo),這一蛋白質(zhì)活化在纖維的生成過(guò)程中起關(guān)鍵作用,可作為檢測(cè)組織纖維化的指標(biāo)。EMs過(guò)度纖維化可通過(guò)臨床表現(xiàn)有所體現(xiàn),卵巢型EMs主要因粘連和疤痕形成導(dǎo)致病人疼痛和不孕等臨床表現(xiàn)。在患有EMs病人的卵巢中可觀察到伴隨卵泡丟失的纖維化現(xiàn)象,表明該疾病導(dǎo)致卵巢功能改變[24-25]。纖維化是EMs病理生理學(xué)機(jī)制發(fā)展的重要過(guò)程[26]。抑制纖維組織的形成可能是治療EMs的一個(gè)方向。本課題研究發(fā)現(xiàn),EMs病人的異位內(nèi)膜組與ADAM17、Notch1及α-SMA的表達(dá)水平之間存在顯著正相關(guān),與對(duì)照組相比,EMs在位內(nèi)膜組織表達(dá)水平也顯著升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,提示ADAM17與Notch1促進(jìn)EMs的纖維化,參與EMs的發(fā)病機(jī)制。ADAM17可能通過(guò)Notch通路引起EMs纖維化。更重要的是,我們的研究發(fā)現(xiàn)EMs中Ⅲ~Ⅳ期病人的異位組織中,三者的表達(dá)均高于Ⅰ~Ⅱ期,這就表明ADAM17可能通過(guò)Notch通路調(diào)控內(nèi)異癥的纖維化嚴(yán)重程度,可以為治療內(nèi)異病的臨床研究開(kāi)辟新途徑。從而為臨床上對(duì)內(nèi)異癥的治療提供了新的思路。
本課題的研究生發(fā)現(xiàn)ADAM17、Notch1及α-SMA在EMs異位內(nèi)膜的中的表達(dá)與病人的年齡及囊腫大小無(wú)關(guān),但與分期呈正相關(guān),即卵巢型子宮異位癥的纖維化程度與ADAM17及Notch1的表達(dá)呈正相關(guān),說(shuō)明干擾這兩者的表達(dá),可能會(huì)減輕EMs的纖維化,但仍需進(jìn)行相關(guān)抑制劑研究來(lái)證實(shí)。
ADAM17、Notch1及α-SMA在異位內(nèi)膜中較在位內(nèi)膜及正常內(nèi)膜中表達(dá)均偏高,在位內(nèi)膜中ADAM17、Notch1和α- SMA的表達(dá)比正常的內(nèi)膜高,符合“在位內(nèi)膜決定論”,提示這三種蛋白在EMs的發(fā)生、發(fā)展中起到重要的作用。三者在異位內(nèi)膜及在位內(nèi)膜中均兩兩呈正相關(guān),提示ADAM17可能通過(guò)Notch通路參與EMs的纖維化發(fā)生。三者在內(nèi)異癥Ⅲ~Ⅳ期病人的異位內(nèi)膜的表達(dá)均高于Ⅰ~Ⅱ期,提示ADAM17可能通過(guò)Notch通路調(diào)控EMs的纖維化嚴(yán)重程度。
關(guān)于ADAM17在健康和疾病中的結(jié)構(gòu)和功能已經(jīng)有大量研究,ADAM17參與免疫系統(tǒng)、纖維化和癌癥進(jìn)展的關(guān)鍵途徑,抑制ADAM17已被證明是一種有前途的治療策略[26-28]。盡管如此,仍需進(jìn)行進(jìn)一步研究,以開(kāi)發(fā)新的特異性ADAM17抑制劑,并測(cè)試其EMs進(jìn)展中的益處。盡管本課題為EMs的病因和尋找有效的治療目標(biāo),仍有待深入地研究。
我們通過(guò)免疫組化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ADAM17、Notch1及α-SMA在異位內(nèi)膜、在位內(nèi)膜及正常內(nèi)膜中有不同程度的表達(dá),定位表達(dá)亦能明顯觀察到,但定量不明確,內(nèi)容較簡(jiǎn)單,樣本數(shù)較局限,可考慮聯(lián)合其他醫(yī)院樣本進(jìn)行研究。希望之后的實(shí)驗(yàn)可結(jié)合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)進(jìn)行更系統(tǒng)的研究,并結(jié)合相關(guān)抑制劑進(jìn)行研究。