血清長鏈非編碼RNA小核仁RNA宿主基因1、微RNA-329-3p表達(dá)水平與急性腦梗死發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系

滕玉環(huán)，徐晨輝，陳季南，李軍榮

作者單位：南京市江寧醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，江蘇 南京211100

急性腦梗死（acute cerebral infarction，ACI）是由于各種原因?qū)е麓竽X動脈狹窄或堵塞引起大腦供血不足的腦血管疾病，是臨床較為常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一，臨床癥狀主要表現(xiàn)為頭暈、語言及肢體功能障礙等，嚴(yán)重者可有意識障礙，常突然發(fā)病，病情可迅速進(jìn)展，嚴(yán)重威脅病人生命健康。研究表明，ACI的發(fā)病機(jī)制極為復(fù)雜，高齡、動脈硬化、血液高黏滯性等與ACI的發(fā)病有著密切的關(guān)系［1-3］。因此，研究與ACI有關(guān)的標(biāo)志物及其與疾病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系，對ACI的早期防治具有重要意義。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一類長度大于200個核苷酸的內(nèi)源性非編碼RNA，可通過調(diào)控其他基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯過程在細(xì)胞分化、凋亡等多種生理病理過程中發(fā)揮重要作用，近年來有研究表明，lncRNA異常表達(dá)與腦血管疾病的發(fā)生關(guān)系密切［4］。長鏈非編碼RNA小核仁RNA宿主基因1（small nucleolar RNA host gene 1，SNHG1）作為一種lncRNA，其表達(dá)參與調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和血管生成［5］。據(jù)報(bào)道，lncRNA SNHG1可通過抑制神經(jīng)炎細(xì)胞凋亡延緩ACI進(jìn)展，在ACI的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用［6］。微RNA（microRNAs，miRNAs）是一類非編碼小分子RNA，研究表明，其在腦血管疾病的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用［7］，通過在生物信息學(xué)StarBase網(wǎng)站（http：//starbase.sysu.edu.cn/）發(fā)現(xiàn)lncRNA SNHG1、miR-329-3p存在結(jié)合位點(diǎn)，因此本研究探討了lncRNA SNHG1、miR-329-3p二者與ACI的關(guān)系，miR-329-3p作為一種miRNAs，是14q32 miRNA基因簇的成員，研究表明，多種14q32 miRNA分子在血管重塑中發(fā)揮重要作用，可延緩心血管疾病的發(fā)生發(fā)展［8］。目前關(guān)于lncRNA SNHG1、miR-329-3p在腦血管疾病中的臨床相關(guān)研究甚少，因此本研究通過檢測ACI病人血清lncRNA SNHG1、miR-329-3p表達(dá)水平變化，探討其與疾病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2020年9月至2021年9月在南京市江寧醫(yī)院收治的162例ACI病人作為觀察組，其中男90例，女72例，年齡范圍為49～85歲，年齡（66.96±13.98）歲，卒中病因?qū)W分型：大動脈粥樣硬化61例、小血管閉塞47例、心源性栓塞35例、其他19例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《中國急性缺血性腦卒中診治指南2018》［9］中關(guān)于ACI的診斷標(biāo)準(zhǔn)；②經(jīng)頭顱MRI檢查確診證實(shí)；③住院時間＞7 d；④臨床資料完整；⑤病人或其近親屬知情同意并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并肝硬化、脂肪肝等肝膽系統(tǒng)疾?。虎诮肽陜?nèi)有創(chuàng)傷史和外科手術(shù)史；③患有自身免疫性疾病、腫瘤、精神疾病；④合并冠心病等心血管疾病；⑤近期服用抑制炎癥類藥物、免疫抑制劑等。另選取同時期在本院體檢的165例健康志愿者作為對照組，其中男88例，女77例，年齡范圍為48～86歲，年齡（66.52±14.04）歲。ACI病人嚴(yán)重程度根據(jù)美國國立衛(wèi)生研究院卒中量表（NIHSS）［10］分為輕度ACI組60例（NIHSS≤7分）、中度ACI組56例（8分≤NIHSS≤13分）和重度ACI組46例（NIHSS≥14分）。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.2 方法

1.2.1 一般資料收集 收集所有受試者以下臨床資料：性別、年齡、吸煙史、飲酒史、高血壓和糖尿病病史、身體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）、NIHSS評分、收縮壓（systolic pressure，SBP）、舒張壓（diastolic pressure，DBP）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein-cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein-cholesterol，LDLC）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triglyceride，TG）等。

1.2.2 樣品采集 所有ACI病人入院次日清晨及體檢者體檢當(dāng)時采集空腹靜脈血5 mL，將收集的血液標(biāo)本以3 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min后取上層血清，置于-80 ℃冰箱中待測。

1.2.3 實(shí)時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測血清lncRNA SNHG1、miR-329-3p的相對表達(dá)量 取所有血清樣本，加入1 mL Trizol試劑（美國Invitrogen公司）提取總RNA，測定RNA純度和濃度，將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用qRT-PCR對lncRNA SNHG1、miR-329-3p進(jìn)行擴(kuò)增，引物序列見表1。lncRNA SNHG1反應(yīng)條件為：95 ℃，5 min；96 ℃，10 s；60 ℃，35 s；以GAPDH作為內(nèi)參。miR-329-3p反應(yīng)條件為：95 ℃，3 min；95 ℃，30 s；75 ℃，50 s；以U6作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法分析lncRNA SNHG1、miR-329-3p的表達(dá)水平。lncRNA SNHG1、GAPDH、miR-329-3p、U6引物序列由上海基因化學(xué)有限公司構(gòu)建；qRT-PCR儀（型號Applied Biosystems 9700）購自美國Life Technologies公司。

表1 實(shí)時熒光定量PCR引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS 25.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料（呈正態(tài)分布，且方差齊）以表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，三組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩組間的比較采用SNK-q檢驗(yàn)；等級資料（NIHSS評分）比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；采用Spearman法分析lncRNA SNHG1、miR-329-3p與NIHSS評分的關(guān)系；采用Pearson法分析lncRNA SNHG1與miR-329-3p水平的關(guān)系；使用ROC曲線分析lncRNA SNHG1、miR-329-3p對ACI的診斷價值；多因素logistic回歸分析ACI發(fā)生的影響因素。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般臨床資料比較 兩組病人性別、年齡、吸煙史、飲酒史、BMI、SBP、DBP、HDL-C、LDL-C等比較均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），觀察組高血壓史比例、糖尿病病史比例、NIHSS評分、TC、TG顯著高于對照組（P＜0.05），見表2。

表2 急性腦梗死及健康志愿者一般臨床資料比較

2.2 兩組血清lncRNA SNHG1、miR-329-3p水平比較 與對照組比較，觀察組病人lncRNA SNHG1水平明顯降低，miR-329-3p水平明顯升高（P＜0.05），見表3。

表3 兩組血清lncRNA SNHG1、miR-329-3p水平比較/

表3 兩組血清lncRNA SNHG1、miR-329-3p水平比較/

注：lncRNA SNHG1為長鏈非編碼RNA小核仁RNA宿主基因1，miR-329-3p為微RNA-329-3p。

miR-329-3p/U6 1.01±0.03 2.15±0.70 20.90＜0.001組別對照組觀察組t值P值例數(shù)165 162 lncRNA SNHG1/GAPDH 1.03±0.04 0.34±0.08 98.91＜0.001

2.3 不同嚴(yán)重程度病人血清lncRNA SNHG1、miR-329-3p水平比較 與輕度ACI組比較，中度ACI組病人lncRNA SNHG1水平明顯降低，miR-329-3p水平明顯升高（P＜0.05），與中度ACI組比較，重度ACI組病人lncRNA SNHG1水平明顯降低，miR-329-3p水平明顯升高（P＜0.05），見表4。

表4 不同嚴(yán)重程度急性腦梗死病人血清lncRNA SNHG1、miR-329-3p水平比較/

表4 不同嚴(yán)重程度急性腦梗死病人血清lncRNA SNHG1、miR-329-3p水平比較/

注：lncRNA SNHG1為長鏈非編碼RNA小核仁RNA宿主基因1，miR-329-3p為微RNA-329-3p。①與輕度ACI組比較，P＜0.05。②與中度ACI組比較，P＜0.05。

miR-329-3p/U6 1.51±0.50 2.20±0.69①2.92±0.97①②49.63＜0.001組別輕度ACI組中度ACI組重度ACI組F值P值例數(shù)60 56 46 lncRNA SNHG1/GAPDH 0.43±0.09 0.35±0.08①0.21±0.07①②96.04＜0.001

2.4 ACI病人血清lncRNA SNHG1、miR-329-3p與NIHSS評分的相關(guān)性以及l(fā)ncRNA SNHG1、miR-329-3p之間的相關(guān)性分析 相關(guān)性分析結(jié)果顯示，血清lncRNA SNHG1與NIHSS評分呈負(fù)相關(guān)（r=-0.30，P＜0.001），miR-329-3p與NIHSS評分呈正相關(guān)（r=0.63，P＜0.001）；通過生物信息學(xué)StarBase網(wǎng)站（http：//starbase.sysu.edu.cn/）發(fā)現(xiàn)lncRNA SNHG1、miR-329-3p存在結(jié)合位點(diǎn)，ACI病人血清lncRNA SNHG1、miR-329-3p表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.61，P＜0.001）。

2.5 lncRNA SNHG1、miR-329-3p對ACI的診斷價值 ROC曲線結(jié)果顯示，血清lncRNA SNHG1診斷ACI發(fā)生的ROC曲線下面積（AUC）為0.78（0.73，0.83），靈敏度為78.2%，特異度為82.7%，截?cái)嘀禐?.74，血清miR-329-3p診斷ACI發(fā)生的AUC為0.72（0.66，0.76），靈敏度為73.3%，特異度為67.9%，截?cái)嘀禐?.34，二者聯(lián)合診斷ACI發(fā)生的AUC為0.83（0.78，0.87），靈敏度為73.3%，特異度為86.4%，與lncRNA SNHG1單獨(dú)診斷相比，二者聯(lián)合診斷ACI發(fā)生的AUC差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=1.33，P=0.920），與miR-329-3p單獨(dú)診斷相比，二者聯(lián)合診斷ACI發(fā)生的AUC更高（Z=2.93，P=0.003）。

2.6 多因素logistic回歸分析ACI發(fā)生的影響因素 將ACI是否發(fā)生作為因變量，以高血壓史、糖尿病病史、TC、TG、lncRNA SNHG1、miR-329-3p水平作為自變量進(jìn)行多因素logistic回歸分析，其中TC、TG、lncRNA SNHG1、miR-329-3p水平均以ACI病人的平均值為界轉(zhuǎn)換為二分類變量，具體賦值見表5。結(jié)果顯示，高血壓史、糖尿病病史、TC高水平、TG高水平、lncRNA SNHG1低水平、miR-329-3p高水平是影響ACI發(fā)生的危險(xiǎn)因素（P＜0.05），見表6。

表5 變量賦值說明

3 討論

ACI是臨床常見的腦血管疾病，在我國約占急性腦血管病的70%～80%，ACI具有高發(fā)病率、高復(fù)發(fā)率、高致殘率、高死亡率特征，并且發(fā)病率和復(fù)發(fā)率呈逐年上升趨勢，嚴(yán)重影響病人的生活質(zhì)量和生命健康。血清學(xué)檢測是一種非侵入性、便捷的早期篩查方法，因此，尋找與ACI有關(guān)的血清標(biāo)志物以及探討其與疾病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系，對ACI的早期防治具有重要意義［11-13］。

據(jù)報(bào)道，SNHG1是一個與癌癥有關(guān)的lncRNA，已有大量研究結(jié)果表明，lncRNA SNHG1參與心肌細(xì)胞肥大［14］、心肌缺血/再灌注損傷［15］等多種心血管疾病的發(fā)生發(fā)展過程，此外，最近的研究表明，lncRNA SNHG1異常表達(dá)還與腦血管疾病的發(fā)生有關(guān)，例如Zhang等［16］研究結(jié)果表明，lncRNA SNHG1可減小大腦中動脈閉塞小鼠模型的腦梗死面積，而抑制lncRNA SNHG1表達(dá)則會增大腦梗死面積，且lncRNA SNHG1可作為miR-18a的競爭性內(nèi)源性RNA發(fā)揮作用，從而調(diào)節(jié)其內(nèi)源性靶標(biāo)缺氧誘導(dǎo)因子-1α的去抑制，并通過缺氧誘導(dǎo)因子-1α/血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子信號傳導(dǎo)促進(jìn)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（BMEC）存活。Wang等［17］研究結(jié)果表明，lncRNA SNHG1的異常表達(dá)與缺血性中風(fēng)后的血管生成有關(guān)，lncRNA SNHG1對BMEC存活和血管生成中形態(tài)、功能的影響依賴于miR-199a，miR-199a參與調(diào)節(jié)缺氧誘導(dǎo)因子和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子的表達(dá)。本研究結(jié)果表明，與對照組相比，觀察組病人血清lncRNA SNHG1表達(dá)水平顯著降低，提示lncRNA SNHG1異常低表達(dá)可能與ACI的發(fā)生有關(guān)。進(jìn)一步研究表明，血清lncRNA SNHG1水平隨病情嚴(yán)重程度增加而降低，且ACI病人血清lncRNA SNHG1水平與NIHSS評分呈負(fù)相關(guān)，表明lncRNA SNHG1表達(dá)水平變化與病人病情嚴(yán)重程度有關(guān)，檢測其表達(dá)可能對評估病人病情嚴(yán)重程度有幫助。ROC曲線分析表明，lncRNA SNHG1診斷ACI發(fā)生的AUC為0.78，靈敏度為78.2%，特異度為82.7%，提示lncRNA SNHG1對ACI具有良好的診斷價值。此外，多因素logistic回歸分析顯示，lncRNA SNHG1低水平是影響ACI發(fā)生的危險(xiǎn)因素，提示lncRNA SNHG1可作為ACI風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測的標(biāo)志物。

miRNAs是一類長度約為22個核苷酸的非編碼小分子RNA，具有調(diào)控多種動植物基因轉(zhuǎn)錄翻譯的生物學(xué)功能，人們發(fā)現(xiàn)miRNAs異常表達(dá)與心腦血管疾病的發(fā)生關(guān)系密切［18］，miR-329-3p作為一種miRNAs，miR-329-3p異常表達(dá)不僅與多種癌癥的發(fā)生密切相關(guān)，且在心腦血管疾病的發(fā)生中發(fā)揮重要作用，Goossens等［19］研究結(jié)果表明，抑制miR-329-3p表達(dá)，可增加缺血后血管生成，從而減輕血管疾病的發(fā)生。Rafiei等［20］研究結(jié)果表明，冠心病病人外周血單核細(xì)胞miR-329呈高表達(dá)，miR-329異常高表達(dá)與動脈粥樣硬化斑塊的發(fā)生有關(guān)。Lin等［21］研究結(jié)果表明，在神經(jīng)元分化過程中，miR-329-3p的表達(dá)上調(diào)，而轉(zhuǎn)錄因子E2F1的表達(dá)下調(diào)，miR-329-3p可通過抑制E2F1在調(diào)節(jié)神經(jīng)干細(xì)胞增殖中發(fā)揮關(guān)鍵作用。以上結(jié)果表明miR-329表達(dá)與血管疾病有關(guān)。本研究結(jié)果表明，與對照組相比，觀察組病人血清miR-329-3p水平明顯升高，且其水平隨病人病情的加重而升高，與Rafiei等［20］研究類似，提示miR-329-3p異常高表達(dá)可能參與ACI的發(fā)生，且可作為評估病人病情嚴(yán)重程度的指標(biāo)之一。經(jīng)Spearman法分析發(fā)現(xiàn)，ACI病人血清miR-329-3p水平與NIHSS評分呈正相關(guān)，進(jìn)一步表明miR-329-3p表達(dá)水平與病人病情嚴(yán)重程度有關(guān)。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，血清miR-329-3p水平可作為診斷ACI的有效指標(biāo)，且高血壓史、糖尿病病史、TC高水平、TG高水平、miR-329-3p高水平是影響ACI發(fā)生的危險(xiǎn)因素，提示miR-329-3p對評估ACI的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)有積極作用。臨床上不僅要關(guān)注影響ACI發(fā)生的常見因素（高血壓、糖尿病及血脂指標(biāo)），還需密切注意lncRNA SNHG1、miR-329-3p在ACI發(fā)病中的作用。

NIHSS評分是評估ACI病人神經(jīng)功能缺損程度的指標(biāo)，但NIHSS評分主觀性強(qiáng)，在部分昏迷及反應(yīng)遲鈍的老年人中應(yīng)用不理想［22］。因此，本研究擬選用穩(wěn)定的血清指標(biāo)（lncRNA SNHG1、miR-329-3p）輔助診斷ACI，結(jié)果表明，lncRNA SNHG1、miR-329-3p對診斷ACI均有幫助，二者聯(lián)合診斷ACI發(fā)生的AUC更高，且可提高對ACI診斷的特異度。He等［23］研究報(bào)道，lncRNA SNHG1可能通過調(diào)節(jié)miR-329-3p的表達(dá)在小膠質(zhì)細(xì)胞活化中發(fā)揮重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，ACI病人血清中l(wèi)ncRNA SNHG1與miR-329-3p的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，提示lncRNA SNHG1、miR-329-3p可能共同參與ACI的發(fā)生，推測lncRNA SNHG1可能通過靶向調(diào)控miR-329-3p的表達(dá)參與ACI的發(fā)生，但具體調(diào)控機(jī)制還需后續(xù)研究。