Anle138b對oAβ1-42誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元突觸毒性作用影響

孫琳,王炳超,朱天立

(青島大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室,山東 青島 266071)

阿爾茨海默病(AD)是一種以記憶喪失、認(rèn)知障礙以及癡呆的行為和心理癥狀為特征的神經(jīng)退行性疾病[1-2]。β淀粉樣蛋白寡聚體(oAβ)在細(xì)胞內(nèi)蓄積和神經(jīng)元過度興奮是 AD早期的兩個(gè)重要事件[3]。oAβ的主要形式為oAβ1-40和oAβ1-42,并且后者的毒性最強(qiáng)。對AD神經(jīng)元功能障礙和毒性的最早解釋之一是由ARISPE等[4]提出的通道假說,該假說假設(shè)不受調(diào)控的β淀粉樣蛋白(Aβ)離子通道會導(dǎo)致離子穩(wěn)態(tài)的喪失(主要是通過升高細(xì)胞內(nèi)鈣離子),最終觸發(fā)神經(jīng)元功能障礙和細(xì)胞死亡[5]。二苯基吡唑化合物Anle138b是一種低聚物調(diào)節(jié)劑,其毒性低,口服生物利用度高,血-腦脊液屏障通透性好[6]。Anle138b能夠阻斷Aβ通道并挽救淀粉樣變性小鼠模型的疾病表型,是治療AD非常有希望的新型藥物,但是該藥在原代海馬神經(jīng)元的細(xì)胞模型上研究較少。本研究應(yīng)用單細(xì)胞膜片鉗技術(shù)檢測自發(fā)性興奮性突觸后電流(sEPSCs),分析Anle138b對慢性oAβ1-42誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元細(xì)胞突觸毒性作用影響,為AD新型藥物的開發(fā)提供可行的思路?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物 選擇出生24 h之內(nèi)的SD乳鼠40只,由青島大任富城畜牧有限公司提供。

1.1.2主要實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 葡萄糖酸鉀、二甲基亞砜(DMSO)、KCl、NaCl、MgCl2、4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)緩沖液、乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸(EGTA)、Mg2ATP、NaGTP以及KOH均購自美國Sigma公司;DMEM/F12培養(yǎng)基、胰蛋白酶購自美國Hyclone公司;青霉素-鏈霉素購自中國北京索萊寶科技有限公司;B27無血清添加劑購自美國Gibco公司;Anle138b、人源Aβ1-42粉末、六氟異丙醇(HFIP)、荷包牡丹堿(Bicuculline)均購自中國MCE公司;CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱;玻璃微電極拉制儀;防震臺;三維微操縱器;膜片鉗放大器;倒置熒光顯微鏡。

1.1.3主要溶液配制 ①海馬神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)液:在無菌操作臺中,將10 mL神經(jīng)元專用添加物B27、5 mL青霉素-鏈霉素溶液加入500 mL的DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)液中,混勻后分裝于50 mL離心管中,置4 ℃冰箱中保存。②oAβ1-42:將Aβ1-42粉末和HFIP置于冰上,取1 mg的Aβ1-42和222 μL的HFIP裝入離心管中,渦旋混勻,室溫孵育1 h直到液體澄清。將Aβ1-42-HFIP分裝到4個(gè)無菌的EP管中,放到通風(fēng)櫥揮發(fā)過夜,至EP管底部產(chǎn)生透明的Aβ1-42-HFIP膜, -80 ℃冰箱保存。使用前加入11 μL DMSO渦旋混勻,再加入539 μL PBS渦旋混勻,置于4 ℃冰箱中直立孵育24 h后,4 ℃、1 400 r/min離心10 min,取上清即為oAβ1-42,分裝保存于-20 ℃冰箱中。③電極內(nèi)液:將130 mmol/L葡萄糖酸鉀、10 mmol/L HEPES、2 mmol/L濃度MgCl2、1 mmol/L EGTA、2 mmol/L Mg2ATP、10 mmol/L KCl、500 μmol/L NaGTP溶液混勻,用1 mol/L KOH 調(diào)節(jié)pH值為7.3,分裝后-20 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)分組及處理 參考本實(shí)驗(yàn)室方法培養(yǎng)原代海馬神經(jīng)元細(xì)胞[7],細(xì)胞發(fā)育成熟后分為對照組(A組,不進(jìn)行任何處理)、Anle138b組(B組,50 nmol/L Anle138b處理2 d)、oAβ1-42組(C組,100 nmol/L oAβ1-42處理7 d)、oAβ1-42+Anle138b組(D組,100 nmol/L oAβ1-42+50 nmol/L Anle138b共處理7 d)、oAβ1-42+Anle138b 2 d組(E組,100 nmol/L oAβ1-42處理7 d,在oAβ1-42處理最后2 d加用50 nmol/L Anle138b),各組處理結(jié)束后進(jìn)行單細(xì)胞膜片鉗記錄。

1.2.2單細(xì)胞膜片鉗記錄海馬神經(jīng)元細(xì)胞sEPSCs幅值、頻率和半衰減時(shí)間 細(xì)胞外液37 ℃水浴鍋中溫浴后,將各組細(xì)胞培養(yǎng)液更換為細(xì)胞外液。在顯微鏡下找到胞體飽滿、邊界清晰、表面無凹陷的細(xì)胞做好標(biāo)記,點(diǎn)擊“offset”,進(jìn)行單細(xì)胞膜片鉗記錄。將拋光好的玻璃電極(電阻為5～10 MΩ)注入合適體積的電極內(nèi)液,使用三維微操縱器控制電極慢慢接近細(xì)胞,直到接觸到細(xì)胞表面,方波越來越低,電阻有所增加。此時(shí)可以觀察到電極尖端和細(xì)胞都清晰可見并且細(xì)胞表面被電極壓出“酒窩”。釋放正壓,給電極負(fù)壓輕輕吸吮細(xì)胞,使電阻迅速增加至1 GΩ,待封接電阻穩(wěn)定于1 GΩ、1 min后,給予少量負(fù)壓破膜。破膜完成后進(jìn)行串聯(lián)電阻及膜電容補(bǔ)償,在電壓鉗模式下觀察sEPSCs的變化,記錄采用gap free模式,鉗制電壓為-70 mV,記錄前加入Bicuculline(20 μmol/L),在Igor pro軟件上選擇程序進(jìn)行實(shí)驗(yàn)記錄。用Igor pro軟件采樣,clampfit軟件分析數(shù)據(jù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

各組海馬神經(jīng)元細(xì)胞sEPSCs幅值、半衰減時(shí)間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2.215、1.043,P>0.05)。各組sEPSCs頻率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=15.490,P<0.001),兩兩比較顯示,oAβ1-42組細(xì)胞sEPSCs頻率較對照組明顯增加(q=6.507,P<0.001),oAβ1-42+Anle138b組和oAβ1-42+Anle138b 2 d組細(xì)胞sEPSCs頻率較oAβ1-42組明顯降低(q=9.517、9.471,P<0.001),其他組間比較差異無顯著性(P>0.05)。見表1。

表1 各組細(xì)胞sEPSCs幅值、頻率、半衰減時(shí)間比較

3 討 論

隨著社會經(jīng)濟(jì)的發(fā)展及人類壽命的不斷增加,AD的患病率不斷升高,預(yù)計(jì)到2050年AD的患病人數(shù)將達(dá)到1.0億～1.3億人[8-9]。雖然目前有多種假說,但是AD的分子病因?qū)W仍然不清楚。有研究表明,oAβ是AD主要的毒性物質(zhì)[10]。oAβ可以通過突觸驅(qū)動機(jī)制導(dǎo)致超興奮性的產(chǎn)生和傳播[11],對大鼠和小鼠模型的初級神經(jīng)元產(chǎn)生毒性作用,抑制海馬突觸長時(shí)程增強(qiáng),并導(dǎo)致記憶障礙[12-14]。oAβ是由淀粉樣蛋白前體蛋白(APP)經(jīng)過β-分泌酶和γ-分泌酶異常加工和Aβ積累產(chǎn)生的[15-16]。oAβ主要包括oAβ1-40和oAβ1-42兩種形式,其中以oAβ1-42毒性最強(qiáng)[17]。有研究表明,oAβ能夠破壞細(xì)胞膜,導(dǎo)致離子通道的形成[10]。oAβ形成離子通道以后導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)鈣離子代謝異常,改變了細(xì)胞內(nèi)鈣離子的動態(tài)平衡,最終導(dǎo)致神經(jīng)毒性[18-19]。因此,尋找一種Aβ離子通道小分子阻斷劑將會為AD的治療提供一種新的思路[20]。而Anle138b能夠在不改變膜嵌合抗體齊聚物結(jié)構(gòu)的情況下阻斷Aβ離子通道的活性,并且Anle138b是首個(gè)被報(bào)道能夠在oAβ形成離子通道后將其阻斷并改善Aβ病理的化合物[5,21]。但是該藥物在海馬神經(jīng)元細(xì)胞突觸上的研究非常少,能否在Aβ通道形成前后均降低慢性oAβ1-42誘導(dǎo)的突觸毒性作用以保護(hù)海馬神經(jīng)元細(xì)胞仍不清楚。

本文研究應(yīng)用單細(xì)胞膜片鉗技術(shù)檢測海馬神經(jīng)元細(xì)胞sEPSCs幅值、頻率、半衰減時(shí)間3個(gè)指標(biāo),結(jié)果顯示,Anle138b對海馬神經(jīng)元細(xì)胞突觸功能不產(chǎn)生影響,oAβ1-42處理7 d會誘導(dǎo)原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元細(xì)胞突觸的sEPSCs頻率增加從而產(chǎn)生神經(jīng)毒性作用,而Anle138b能降低oAβ1-42通道形成前后所導(dǎo)致的頻率升高,但是各組的幅值和半衰減時(shí)間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明Anle138b不僅可以預(yù)防oAβ1-42誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元細(xì)胞突觸毒性,還可以消除慢性oAβ1-42誘導(dǎo)的已經(jīng)形成的海馬神經(jīng)元細(xì)胞突觸毒性。提示oAβ1-42誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元細(xì)胞突觸毒性的機(jī)制可能為:海馬神經(jīng)元細(xì)胞突觸前膜離子通道形成后導(dǎo)致鈣離子穩(wěn)態(tài)失調(diào),突觸前膜遞質(zhì)釋放增多,對突觸產(chǎn)生毒性[22]。已有研究證明海馬神經(jīng)元細(xì)胞突觸前膜釋放的神經(jīng)遞質(zhì)是谷氨酸[23],而這個(gè)過程可以被Anle138b所阻斷。動物模型研究結(jié)果顯示,Anle138b對帕金森病(PD)、多系統(tǒng)萎縮病、阮病毒和AD等蛋白聚集相關(guān)疾病治療有效[24-27]。關(guān)于Anle138b抑制PD的發(fā)病進(jìn)展機(jī)制已在健康志愿者中測試成功,目前正在PD病人中進(jìn)行Ⅰb期測試(NCT04685265)[28]。

綜上所述,Anle138b可以降低oAβ1-42誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元細(xì)胞突觸毒性作用,其可能的機(jī)制是減少突觸前膜神經(jīng)遞質(zhì)釋放,并且Anle138b不僅可以預(yù)防慢性oAβ1-42誘導(dǎo)的突觸毒性作用,還可以消除慢性oAβ1-42誘導(dǎo)的突觸毒性作用。因此,Anle138b類小分子阻斷劑可能在AD的治療中有非常大的潛力,值得進(jìn)一步研究。