淫羊藿苷對(duì)激素抵抗型腎病綜合征大鼠足細(xì)胞PODXL/Ezrin蛋白及Caspase-3、Bax、Bcl-2表達(dá)的影響

王曉輝，戴恩來，段淑文，劉燦，丁照然

甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000

激素抵抗型腎病綜合征（steroid resistant nephrotic syndrome，SRNS）是一種臨床表現(xiàn)為對(duì)標(biāo)準(zhǔn)類固醇治療缺乏反應(yīng)的疾病[1]，其特點(diǎn)是類固醇抵抗性、臨床變異性和遺傳異質(zhì)性[2]。目前未見經(jīng)過驗(yàn)證的生物標(biāo)志物能預(yù)測(cè)SRNS或定義調(diào)節(jié)SRNS的途徑[3]。SRNS治療困難，易發(fā)展為終末期腎病，生存率低，迫切需要逆轉(zhuǎn)類固醇耐藥性及減少長(zhǎng)期使用高劑量類固醇藥物的措施[4]。SRNS發(fā)病機(jī)制伴隨腎小球上皮細(xì)胞（足細(xì)胞）凋亡[5-6]，因此，抑制足細(xì)胞凋亡是SRNS一種潛在的治療策略。淫羊藿苷（icariin，ICA）在神經(jīng)退行性疾病、心血管疾病、抗骨質(zhì)疏松、抗炎、抗氧化應(yīng)激、抗抑郁和抗腫瘤等方面有多種藥理作用[7-9]，對(duì)腎臟疾病具有保護(hù)作用，在提高糖皮質(zhì)激素療效方面有一定優(yōu)勢(shì)[10]，但其機(jī)制有待進(jìn)一步探索。在前期研究基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步觀察ICA對(duì)足細(xì)胞相關(guān)蛋白及凋亡的影響，探討其減輕足細(xì)胞損傷的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物

雄性SPF級(jí)SD大鼠60只，體質(zhì)量（180±20）g，購(gòu)自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（京）2019-0010。飼養(yǎng)于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，溫度22 ℃，濕度30%～50%，輻照滅菌SPF級(jí)大鼠飼料及飲用水喂養(yǎng)。本研究經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理（倫理）委員會(huì)審批（2021-181）。

1.2 藥物

ICA，陜西博林生物技術(shù)有限公司，批號(hào)BL20211102001。潑尼松片，山東魯抗醫(yī)藥集團(tuán)賽特有限責(zé)任公司，批號(hào)211007。鹽酸阿霉素（ADR），北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)HY-15142。

1.3 主要試劑與儀器

Caspase-3抗體（批號(hào)GTX110543）、Bax抗體（批號(hào)GTX635715）、Bcl-2抗體（批號(hào)GTX100064）、Ezrin抗體（批號(hào)GTX111709），美國(guó)Gene Tex公司；PODXL抗體（批號(hào)bs-1345R），北京博奧森生物技術(shù)有限公司；β-actin（批號(hào)GB12001）、HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗（批號(hào)GB23303），武漢賽維爾生物科技有限公司；TUNEL試劑盒（批號(hào)G1501），武漢賽維爾公司；CCB法尿蛋白檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)C035-2-1），南京建成生物工程研究所。7600-1101SE型全自動(dòng)血液生化分析儀（日立診斷產(chǎn)品有限公司），ECLIPSE C1、E100正置熒光顯微鏡（日本尼康），DS-U3成像系統(tǒng)（日本尼康），BT-2電泳儀（武漢賽維爾公司），TSY-B搖床（武漢賽維爾公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 造模、分組及給藥

60只SD大鼠隨機(jī)分為空白組12只，其余48只分別于實(shí)驗(yàn)第1、8日注射ADR 4、3.5 mg/kg建立SRNS大鼠模型[11]。造模14 d后將大鼠隨機(jī)分為模型組、激素組、ICA組和聯(lián)合組，每組12只。激素組予0.63 mg/mL潑尼松溶液（生理鹽水配制）6.3 mg/kg灌胃，ICA組予5 mg/mL ICA溶液（生理鹽水配制）50 mg/kg灌胃，聯(lián)合組同時(shí)予潑尼松和ICA溶液灌胃，空白組及模型組予生理鹽水，灌胃體積1 mL/100 g，連續(xù)6周。實(shí)驗(yàn)期間每周稱量大鼠體質(zhì)量。

2.2 標(biāo)本采集

第2次注射ADR后開始檢測(cè)尿蛋白，提前1 d用代謝籠收集大鼠24 h尿液，每周1次。干預(yù)結(jié)束后，以2%戊巴比妥50 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，心尖取血，室溫靜置1 h，4 ℃、3 000 r/min離心10 min，取上清液分裝，用于檢測(cè)生化指標(biāo)。切除大鼠左側(cè)腎臟，生理鹽水清洗，剝離腎包膜，用于腎組織病理檢測(cè)，右側(cè)腎組織用于蛋白檢測(cè)。

2.3 腎功能指標(biāo)測(cè)量

CCB法試劑盒測(cè)定24 h尿蛋白（24 h-UTP）含量；采用全自動(dòng)血液生化分析儀檢測(cè)血清白蛋白（ALB）、血尿素氮（BUN）、血肌酐（SCr）含量。

2.4 腎組織病理學(xué)檢測(cè)

將腎臟切成厚度0.5 cm組織，裝入EP管中，加入4%組織細(xì)胞固定液，常溫固定48 h，經(jīng)洗滌固定、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片后，行Masson染色，光學(xué)顯微鏡下觀察腎組織病理形態(tài)。

2.5 Western blot檢測(cè)

稱取適量腎組織剪碎，加入組織蛋白裂解液，勻漿，4 ℃、10 080×g離心10 min，收集上清液，紫外分光光度計(jì)測(cè)定蛋白濃度。樣品上樣，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜至聚偏二氟乙烯膜，脫脂奶粉封閉2 h，加入Caspase-3、Bax、Bcl-2、PODXL、β-actin一抗（1∶1 000）和Ezrin一抗（1∶5 000），4 ℃孵育過夜，PBST洗膜，室溫孵育二抗2～3 h。DAB顯色，電化學(xué)發(fā)光顯色液曝光，用Image J軟件對(duì)圖像進(jìn)行灰度分析。

2.6 TUNEL染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡

石蠟切片脫蠟至水，蛋白酶K修復(fù)，破膜，緩沖液常溫孵育10 min，加入TUNEL反應(yīng)液，37 ℃加濕室中孵育2 h，PBS緩沖液清洗，滴加DAPI染液，室溫避光孵育10 min，脫水、封片后，熒光顯微鏡下觀察腎組織凋亡情況，計(jì)算TUNEL陽(yáng)性表達(dá)熒光強(qiáng)度。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

4 結(jié)果

4.1 淫羊藿苷對(duì)模型大鼠體質(zhì)量的影響

模型組死亡2只，最終各組按10只進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。與空白組比較，模型組大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)緩慢，造模14 d及給藥6周后體質(zhì)量明顯下降（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，激素組大鼠體質(zhì)量無明顯差異（P＞0.05），ICA組和聯(lián)合組大鼠體質(zhì)量明顯增加（P＜0.05，P＜0.01）。見表1。

表1 各組大鼠不同時(shí)點(diǎn)體質(zhì)量比較（，g）

表1 各組大鼠不同時(shí)點(diǎn)體質(zhì)量比較（，g）

注：與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

給藥6周組別只數(shù)造模14 d 360.20±6.49 254.60±8.20**256.80±3.16 260.20±2.30#308.70±6.88##空白組模型組激素組ICA組聯(lián)合組10 10 10 10 10 253.20±6.39 204.00±5.46*204.00±6.90 201.80±4.08 199.90±4.86

4.2 淫羊藿苷對(duì)模型大鼠24 h尿蛋白含量的影響

與空白組比較，模型組大鼠造模14 d及給藥6周后24 h-UTP含量明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；給藥6周后，與模型組比較，ICA組和聯(lián)合組大鼠24 h-UTP含量明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。見表2。

表2 各組大鼠不同時(shí)點(diǎn)24 h-UTP含量比較（，mg）

表2 各組大鼠不同時(shí)點(diǎn)24 h-UTP含量比較（，mg）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

7.33±0.62 195.30±7.59**193.67±5.09 190.16±3.53#92.52±5.22##空白組模型組激素組ICA組聯(lián)合組10 10 10 10 10 4.86±0.50 112.68±3.68**118.74±5.88 119.99±5.65 117.97±6.29

4.3 淫羊藿苷對(duì)模型大鼠生化指標(biāo)的影響

與空白組比較，模型組大鼠血清ALB含量減少，SCr、BUN含量增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，聯(lián)合組大鼠血清ALB含量增加，SCr、BUN含量減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表3。

表3 各組大鼠血清ALB、SCr、BUN含量比較（）

表3 各組大鼠血清ALB、SCr、BUN含量比較（）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01

組別空白組模型組激素組ICA組聯(lián)合組BUN/（mmol/L）7.55±0.95 14.20±2.10**13.76±1.80 13.66±1.49 6.04±0.86##只數(shù)10 10 10 10 10 ALB/（g/L）33.75±2.39 25.94±1.43**27.11±2.34 26.57±1.69 29.34±1.11##SCr/（mmol/L）37.60±3.31 26.30±1.83**28.70±2.16#27.40±2.37 36.78±2.17##

4.4 淫羊藿苷對(duì)模型大鼠足細(xì)胞形態(tài)的影響

空白組大鼠腎小球基底膜完整，系膜基質(zhì)分布均勻；模型組大鼠腎小球基底膜明顯增厚，沉積物增多，足細(xì)胞腫脹、變性、增生，散在分布于腎小囊內(nèi)；與模型組比較，各治療組大鼠腎小球基底膜及足細(xì)胞病理結(jié)構(gòu)均有不同程度改善，腎小球基底膜沉積物減少，足細(xì)胞增生及變性減輕，聯(lián)合組改善更佳。見圖1。

圖1 各組大鼠腎組織形態(tài)（Masson染色，×400）

4.5 淫羊藿苷對(duì)模型大鼠腎組織蛋白表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組大鼠腎組織PODXL、Ezrin、Bcl-2蛋白表達(dá)明顯降低，Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，ICA組大鼠腎組織PODXL、Ezrin、Bcl-2蛋白表達(dá)明顯升高，聯(lián)合組大鼠腎組織PODXL、Ezrin、Bcl-2蛋白表達(dá)明顯升高，Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。見圖2、表4。

圖2 各組大鼠腎組織PODXL、Ezrin、Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白免疫印跡

表4 各組大鼠腎組織PODXL、Ezrin、Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)比較（）

表4 各組大鼠腎組織PODXL、Ezrin、Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)比較（）

注：與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

組別空白組模型組激素組ICA組聯(lián)合組Bcl-2 0.84±0.22 0.44±0.08*0.74±0.12 0.86±0.09##1.42±0.18##只數(shù)3 3 3 3 3 PODXL 0.94±0.05 0.66±0.06*1.92±0.07##1.02±0.11##1.26±0.15##Ezrin 0.82±0.12 0.44±0.08**0.68±0.03 0.86±0.14##1.10±0.12##Caspase-3 0.62±0.16 1.15±0.14**1.04±0.08 0.94±0.09 0.73±0.12#Bax 0.64±0.11 1.20±0.04**0.88±0.06##1.02±0.10 0.69±0.09##

4.6 淫羊藿苷對(duì)模型大鼠腎組織細(xì)胞凋亡的影響

與空白組比較，模型組大鼠腎組織細(xì)胞凋亡增加（P＜0.01）；與模型組比較，ICA組和聯(lián)合組大鼠腎組織細(xì)胞凋亡減少（P＜0.05，P＜0.01）。見表5、圖3。

圖3 各組大鼠腎組織細(xì)胞凋亡陽(yáng)性表達(dá)（TUNEL染色，×400）

表5 各組大鼠腎組織細(xì)胞凋亡比較（）

表5 各組大鼠腎組織細(xì)胞凋亡比較（）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

只數(shù)組別空白組模型組激素組ICA組聯(lián)合組3 3 3 3 3熒光強(qiáng)度13.95± 7.65 45.35± 9.73**41.96±12.31 29.94±11.52#19.76± 3.06##

5 討論

SRNS是嚴(yán)重的進(jìn)行性腎臟疾病病因之一[12]，絕大多數(shù)SRNS患者會(huì)發(fā)展為慢性腎病和終末期腎病[13]。SRNS病因仍不清楚，也無標(biāo)準(zhǔn)化治療方法，診斷和治療SRNS成為巨大的挑戰(zhàn)[14-15]。腎小球?yàn)V過屏障由內(nèi)皮細(xì)胞、腎小球基底膜和足細(xì)胞組成，其功能障礙在腎病中普遍發(fā)生。有多種調(diào)節(jié)腎小球?yàn)V過屏障功能的蛋白與SRNS相關(guān)，包括足細(xì)胞狹縫隔膜蛋白、足細(xì)胞肌動(dòng)蛋白、線粒體蛋白、黏附和腎小球基底膜蛋白、轉(zhuǎn)錄因子等[16]。

PODXL是CD34家族表面糖基化的唾液酸激酶，表達(dá)于足細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞表面[17]。成熟的足細(xì)胞需要PODXL維持足突結(jié)構(gòu)，其能將足突和狹縫膈膜蛋白定位到正確的膜結(jié)構(gòu)域并維持超濾所需結(jié)構(gòu)的完整性[18]。PODXL可用于識(shí)別各種腎小球疾病中的足細(xì)胞損傷[19]，是足細(xì)胞損傷的特定標(biāo)志物之一，其表達(dá)異常將導(dǎo)致足細(xì)胞完整性喪失、腎小球組織破壞[20]和腎臟疾病的發(fā)展[21]。Ezrin屬ERM家族成員，為細(xì)胞膜和肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架之間的連接蛋白，主要通過調(diào)節(jié)黏附分子和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)參與細(xì)胞間、細(xì)胞與基質(zhì)間相互作用。Ezrin特異性表達(dá)于成熟及發(fā)育中的腎小球上皮細(xì)胞（GEC），是GEC標(biāo)志物[22]。Ezrin可與肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架連接，還可通過Na+/H+-交換調(diào)節(jié)因子2（NHERF2）與PODXL連接[23]，形成Ezrin-NHERF2-PODXL復(fù)合物，該復(fù)合物位于足細(xì)胞足突頂端，可與肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架相互作用，這種相互作用在嘌呤霉素氨基核苷、硫酸魚精蛋白或唾液酸酶處理的大鼠GEC中被破壞，表現(xiàn)出顯著的足突消失與腎病綜合征[23]，表明其在維持上皮結(jié)構(gòu)中的重要性[24]。本研究結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組大鼠腎組織PODXL、Ezrin蛋白表達(dá)降低，提示足細(xì)胞損傷。經(jīng)ICA聯(lián)合激素治療后，模型大鼠腎組織PODXL、Ezrin蛋白表達(dá)升高，提示ICA可通過抑制PODXL、Ezrin表達(dá)改善腎損傷。

足細(xì)胞是腎小球?yàn)V過膜的重要組成部分，參與多種腎病的發(fā)生發(fā)展[25]。足細(xì)胞損傷導(dǎo)致蛋白尿和腎病綜合征，進(jìn)一步誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡[26]。因此，減輕足細(xì)胞凋亡對(duì)治療蛋白尿和進(jìn)行性腎小球疾病至關(guān)重要[27]。Caspase家族是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵酶，Caspase-3激活后可直接降解細(xì)胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)蛋白和功能蛋白，引起細(xì)胞凋亡[28]。Bcl-2和Bax通過形成同源或異源二聚體調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。當(dāng)受到凋亡信號(hào)刺激時(shí)，Bax被激活并在線粒體上形成同源二聚體，使線粒體膜通透性增加，引起凋亡因子釋放，最終誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。凋亡發(fā)生伴有細(xì)胞色素C從線粒體釋放，繼而伴有Caspase激活和凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)，Bcl-2通過與Bax形成異源二聚體阻止細(xì)胞色素C釋放到細(xì)胞質(zhì)，從而抑制細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抗凋亡作用[29]。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠腎組織Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)升高，Bcl-2蛋白表達(dá)降低，表明腎損傷時(shí)凋亡途徑被激活。經(jīng)ICA聯(lián)合激素治療后，模型大鼠Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)降低，Bcl-2蛋白表達(dá)升高。說明ICA能通過抑制足細(xì)胞損傷及凋亡改善腎損傷。

綜上所述，ICA可通過上調(diào)PODXL、Ezrin、Bcl-2蛋白表達(dá)，下調(diào)Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)，抑制足細(xì)胞凋亡、恢復(fù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)及完整性，從而減輕SRNS大鼠足細(xì)胞損傷。本研究結(jié)果初步闡明ICA保護(hù)SRNS腎功能，減輕腎損傷的機(jī)制。