甘肅省大白菜葉斑病菌分離鑒定及生物學(xué)特性測(cè)定

王一丹,魏立娟,楊成德

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院,甘肅省農(nóng)作物病蟲(chóng)害生物防治工程實(shí)驗(yàn)室,蘭州 730070)

大白菜(Brassicapekinensis)屬于十字花科蕓薹屬兩年生草本植物,又稱結(jié)球白菜和黃芽菜,味道鮮美可口,營(yíng)養(yǎng)豐富,含有豐富的粗纖維,食用方法多種多樣,并且具有益胃生津,清熱除煩的功能。大白菜原產(chǎn)于中國(guó)北方地區(qū),是農(nóng)民秋季收入的重要來(lái)源,其種植面積和消費(fèi)量在國(guó)內(nèi)居各類蔬菜之首,19世紀(jì)傳入日本、東南亞和歐洲各國(guó)[1]。近年來(lái),由于人們對(duì)大白菜需求的不斷增長(zhǎng),常連作種植,導(dǎo)致多種病害加重發(fā)生。目前報(bào)道的大白菜病害有立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)引起的大白菜褐腐病(莖基腐病)[2],鏈格孢屬真菌(Alternariaspp)引起的大白菜黑斑病,野油菜黃單胞菌(Xanthomonasecampestris)引起的大白菜黑腐病,大麗輪枝菌(Verticilliumdahliae)引起的大白菜黃萎病[3],丁香假單孢菌(Pseudomonassyringae)引起的大白菜細(xì)菌性角斑病等[4]。這些病害的發(fā)生嚴(yán)重影響了大白菜的產(chǎn)量和品質(zhì),阻礙了大白菜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

油菜黑脛病菌是一種真菌性病害,被分為高毒力強(qiáng)侵染型的Leptosphaeriamaculans和低毒力弱侵染型的Leptosphaeriabiglobosa[5]。研究表明,這兩個(gè)復(fù)合體是獨(dú)立的Leptosphaeria種[6-7],其中L.maculans致病力強(qiáng),主要分布于西歐,北美洲,南美洲和澳大利亞,在亞洲和俄羅斯還未發(fā)現(xiàn)[5,8]。因此,為了防止由L.maculans引起的油菜莖基潰瘍病傳入中國(guó),將其列為檢疫性病害[9]。相對(duì)于L.maculans而言,L.biglobosa的致病力較弱,最先于歐洲,北美等地發(fā)現(xiàn),危害范圍非常廣泛,在世界各地均有分布,在一定條件下會(huì)造成產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)損失[5, 10-11],其主要侵染十字花科蕓薹屬,豆科菜豆屬、?？迫劜輰俸妄埬懣柒啦说萚12]。Cai等[13]的研究表明,在中國(guó)L.biglobosa只侵染十字花科植物,如蘿卜、紅菜薹、甘藍(lán)和油菜等,其中油菜是被侵染最嚴(yán)重的植物[14]。由L.biglobosa引起的油菜黑脛病在中國(guó)的油菜產(chǎn)區(qū)分布非常廣泛,造成其產(chǎn)量下降[15-16],如榮松柏等[17]報(bào)道L.biglobosa導(dǎo)致油菜籽產(chǎn)量下降10%～50%。但目前還沒(méi)有關(guān)于L.biglobosa引起大白菜病害的報(bào)道。因此,對(duì)采自甘肅省隴南市武都區(qū)的葉斑病標(biāo)本進(jìn)行病原菌的分離、致病性測(cè)定和鑒定,并測(cè)定生物學(xué)特性,以期明確武都區(qū)大白菜葉斑病的病原種類及生物學(xué)特性,為該病害的診斷和綜合防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試樣本 于2018年10月在甘肅省隴南市武都區(qū)采集的具有明顯葉斑癥狀的大白菜葉片。

1.1.2 供試培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基、PSA培養(yǎng)基、Czapek培養(yǎng)基、NA培養(yǎng)基、SA培養(yǎng)基、SDA培養(yǎng)基和RBA培養(yǎng)基,參考文獻(xiàn)[18]配置。

自行設(shè)計(jì)的培養(yǎng)基包括:PDA和白菜葉汁液混合培養(yǎng)基(葡萄糖15 g,土豆200 g,瓊脂15 g,白菜葉汁液,加水至1 000 mL)及PSA和大白菜葉汁液混合培養(yǎng)基(蔗糖15 g,土豆200 g,瓊脂15 g,大白菜葉汁液,加水至1 000 mL)。

1.2 病原菌的分離

采用組織分離法[18]。將具有典型葉斑病癥狀的大白菜葉片于病健交界處切成1 cm×1 cm的小方塊,在75%乙醇中消毒1 min后,用無(wú)菌蒸餾水沖洗3次,再用無(wú)菌濾紙吸干水分后,置于PDA培養(yǎng)基上,25 ℃培養(yǎng)36～72 h,挑取病組織周圍的菌絲進(jìn)行純化,獲得純培養(yǎng)的分離物,將其命名并轉(zhuǎn)接于PDA斜面上置于4 ℃冰箱中保存,備用。

1.3 致病性測(cè)定

將所得分離物接種于PDA培養(yǎng)基,25 ℃培養(yǎng)7 d后用無(wú)菌蒸餾水配制孢子懸浮液,孢子濃度達(dá)5×106mL-1。用無(wú)菌水清洗大白菜葉片并用無(wú)菌針頭在大白菜葉片表面造成微傷口,將孢子懸浮液噴灑于傷口處,以無(wú)菌水為對(duì)照[19], 3次重復(fù),置于25 ℃、濕度大于80%的人工氣候室中培養(yǎng)48 h后,置于室內(nèi)觀察發(fā)病情況。待大白菜出現(xiàn)明顯葉斑癥狀時(shí),重新分離病原菌。

1.4 病原菌的鑒定

1.4.1 形態(tài)學(xué)鑒定 將所獲得的致病菌株轉(zhuǎn)接于PDA培養(yǎng)基上,25 ℃黑暗培養(yǎng)7 d后,觀察菌落顏色和形態(tài),在光學(xué)顯微鏡(Axio Lab.A1, Carl Zeiss, Germany)下觀察菌絲、分生孢子和分生孢子器的形態(tài)特征并測(cè)量分生孢子和分生孢子器大小(n=50)。

1.4.2 特異性基因序列鑒定 基因組DNA的提取:將致病菌株轉(zhuǎn)接于PDA培養(yǎng)基,25 ℃黑暗培養(yǎng),當(dāng)菌落生長(zhǎng)到接近培養(yǎng)皿邊緣時(shí),從菌落表面刮取菌絲體,并在加有液氮的無(wú)菌研缽中快速冷凍和研磨,后按照OMEGA BIO-TEX DNA試劑盒的說(shuō)明提取基因組DNA, -20 ℃保存,備用。

PCR擴(kuò)增:使用通用引物ITS(序列為:ITS15′-TCC GTA GGT GAA CCT GCG-3′,ITS45′-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3′)[20],特異性引物Actin(序列為:ActinF5′-GAG CAG GAG ATC CAG ACT GC-3′,ActinR5′-TTC GAG ATC CAC ATC TGC TG-3′)和β-tubulin(序列為:β-tubulinF5′-GTC GAG AAC TCC GAC GAG AC-3′,β-tubulinR5′-ATC TGG TCC TCG ACC TCC TT-3′)[21]進(jìn)行PCR擴(kuò)增(引物合成由西安擎科生物有限公司 完成)。

PCR反應(yīng)體系如下:ITS的反應(yīng)體系為:Mix(2×)10 μL,ITS1和ITS4(10 μmol/L)各 0.5 μL,模板DNA 1 μL,ddH2O 8 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?預(yù)變性95 ℃ 5 min;變性95 ℃ 30 s,退火54 ℃ 30 s,延伸72 ℃ 1 min,30個(gè)循環(huán);再延伸72 ℃ 7 min,4 ℃保存。特異性引物Actin的反應(yīng)體系為:Mix(2×)10 μL,ActinF和ActinR(10 μmol/L)各0.5 μL,模板DNA 1 μL,ddH2O 8 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?預(yù)變性94 ℃ 5 min;變性94 ℃ 30 s,退火55 ℃ 30 s,延伸 72 ℃ 1 min,35個(gè)循環(huán);再延伸72 ℃ 10 min, 4 ℃保存。β-tubulin的反應(yīng)體系為:Mix(2×) 10 μL,β-tubulinF和β-tubulinR(10 μmol/L)各 0.5 μL,模板DNA 1 μL,ddH2O 8 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?預(yù)變性 94 ℃ 5 min;變性94 ℃ 30 s,退火 55 ℃ 30 s,延伸72 ℃ 1 min,35個(gè)循環(huán);再延伸72 ℃ 10 min,4 ℃保存。

擴(kuò)增后取6 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),將產(chǎn)生特異性條帶的PCR產(chǎn)物送往西安擎科生物有限公司進(jìn)行測(cè)序。將所得序列提交至NCBI的GenBank中進(jìn)行Blast比較,篩選出與病原菌高度相似的基因序列,用Mega(7.0)軟件中的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),確定病原菌的分類地位。

1.5 生物學(xué)特性的測(cè)定

1.5.1 培養(yǎng)基對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響 選用PDA+大白菜葉汁液、PSA+大白菜葉汁液、PDA、PSA、Czapek、NA、SA、SDA和RBA培養(yǎng)基,將致病菌株接種于培養(yǎng)基中央,每種培養(yǎng)基重復(fù)3次,在25 ℃恒溫培養(yǎng)箱黑暗培養(yǎng) 7 d,采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。

1.5.2 溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)的影響 將病原菌接種于PDA培養(yǎng)基中央,在不同溫度 (5 ℃、10 ℃、15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、 40 ℃)下培養(yǎng),每個(gè)溫度重復(fù)3次。25 ℃黑暗培養(yǎng) 7 d后,采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑,使用懸滴法計(jì)算孢子萌發(fā)率,每2 h記錄1次,直到孢子萌發(fā)率達(dá)到90%[18]。

1.5.3 pH對(duì)菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)的影響 將致病菌株接種于不同pH(4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0和10.0)的PDA平板上,重復(fù)3次,并在25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱黑暗培養(yǎng)7 d。其余方法同“1.5.2”。

1.5.4 碳源對(duì)菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)的影響 將Czapek培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,分別用蔗糖、D-果糖、葡萄糖、乳糖、麥芽糖、可溶性淀粉、L-鼠李糖、木糖、L-阿拉伯糖、甘露醇和棉子糖替換基礎(chǔ)碳源,重復(fù)3次,并在25 ℃下培養(yǎng)7 d。其余方法同“1.5.2”。

1.5.5 氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)的影響 Czapek培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,分別將硝酸鉀、硝酸鈉、蛋白胨、酵母膏、甘氨酸、脯氨酸、氯化銨、磷酸氫二銨、組氨酸、尿素、硝酸銨、酵母浸粉和亞硝酸鈉作為替換氮源,重復(fù)3次,并在25 ℃下培養(yǎng)7 d。其余方法同“1.5.2”。

1.5.6 數(shù)據(jù)分析 IBM SPSS Statistics 25,采用最小顯著性差異(LSD)法檢驗(yàn)差異的顯著性 (P<0.05);Microsoft Office Excel 2019用于數(shù)據(jù)的圖形表示;MEGA 7.0用于建立系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 大白菜葉斑病的癥狀

大白菜葉斑病主要危害白菜的葉片,在葉片表面形成圓形和不規(guī)則的病斑,邊緣明顯。病斑為灰色或灰白色,且密布黑色小點(diǎn)(分生孢子器)(圖1)。

圖1 大白菜葉斑病的田間癥狀Fig.1 Field symptoms of leaf spot on Brassica pekinensis

2.2 病原菌的分離和致病性測(cè)定

采用組織分離法得到8株分離物,分別編號(hào)為BCA、BCB、BCC、BCD、BCE、BCF、BCG和BCH。經(jīng)致病性測(cè)定,只有編號(hào)為BCG的分離物可以引起與田間病害相似的癥狀,接種7 d后開(kāi)始發(fā)病,葉片上出現(xiàn)褐色小斑點(diǎn),14 d后褐色小點(diǎn)逐漸擴(kuò)展為不規(guī)則病斑,邊緣明顯呈黑褐色,中央為灰白色,30 d后,病斑擴(kuò)大至整個(gè)葉面,邊緣明顯且病斑中央有黑色小點(diǎn),與田間發(fā)病癥狀基本一致,且再次分離得到與分離物BCG形態(tài)特征一致的分離物,但對(duì)照未發(fā)病,說(shuō)明分離物BCG為大白菜葉斑病的病原菌(圖2)。

a.接種7 d的發(fā)病癥狀;b.接種14 d的發(fā)病癥狀;c.接種30 d的發(fā)病癥狀;d.CK(無(wú)菌水處理)

2.3 病原菌的鑒定

2.3.1 形態(tài)特征觀察 病原菌BCG菌落呈圓形,中央扁平,呈褐色,邊緣白色絨毛狀,氣生菌絲發(fā)達(dá);菌落底部產(chǎn)生黃褐色色素并從中心向四周擴(kuò)散(圖3-a)。當(dāng)培養(yǎng)一段時(shí)間后,氣生菌絲上會(huì)產(chǎn)生大小不一致的黃色或紅棕色液珠(圖3-c)。在PDA培養(yǎng)基上大量產(chǎn)生分生孢子,單細(xì)胞,壁光滑,透明,梭形或圓柱形,具油球且分生孢子兩端逐漸變細(xì)(圖3-d),大小為(1.56～ 2.77)μm×(3.23～6.10)μm,分生孢子器扁平,深褐色(圖3-e),大小為204.20 μm×140.88 μm。其形態(tài)特征均與L.biglobosa[20]相似。

a.BCG菌落背面;b.BCG菌落正面;c.BCG菌絲上的黃色和紅棕色的液珠;d.BCG分生孢子形態(tài);e.BCG分生孢子器形態(tài)

2.3.2 特異性基因序列分析 以菌株BCG的總DNA為模板,使用通用引物ITS、特異性引物Actin和β-tubulin基因序列進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序,分別得到大小為578 bp、446 bp和471 bp的基因片段(登錄號(hào):MW357737,MW524113和MW524114),將所得序列提交至GenBank中進(jìn)行比對(duì)并構(gòu)建多位點(diǎn)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(表1)。結(jié)果表明,菌株BCG與L.biglobosabrassicae(Lb1129)聚在一起,其bookstrap值為99(圖4),結(jié)合形態(tài)特征將菌株BCG鑒定為油菜黑脛病菌(L.biglobosa)。

表1 油菜黑脛病菌的多位點(diǎn)系統(tǒng)發(fā)育分析登錄號(hào)Table 1 L.biglobosa used in multilocus phylogenetic analysis and their GenBank accession numbers

圖4 基于ITS、Actin和β-tubulin的多位點(diǎn)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree based on ITS,Actin and β-tubulin multilocus phylogenetic analysis sequences

2.4 生物學(xué)特性測(cè)定

2.4.1 培養(yǎng)基對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響 病原菌BCG在9種供試培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng),且在PDA培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)最好,菌落直徑最大,達(dá)6.17 cm,顯著高于其他培養(yǎng)基(P<0.05);供試培養(yǎng)基為SDA時(shí),菌絲生長(zhǎng)稀疏、緩慢,菌落直徑最小,僅為3.30 cm,顯著低于其他培養(yǎng)基(P<0.05),說(shuō)明菌株BCG生長(zhǎng)最適培養(yǎng)基為PDA(圖5)。

標(biāo)不同小寫(xiě)字母者表示樣本間顯著差異(P<0.05),下同。1.馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基+大白菜葉汁液;2.馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基;3.馬鈴薯蔗糖瓊脂 培養(yǎng)基+大白菜葉汁液;4.馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基;5.察氏培養(yǎng)基;6.牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基; 7.淀粉瓊脂培養(yǎng)基;8.薩布培養(yǎng)基;9.虎紅瓊脂培養(yǎng)基

2.4.2 溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)的影響 在10～35 ℃的溫度范圍內(nèi)均能生長(zhǎng),5 ℃和40 ℃時(shí)不生長(zhǎng),在25 ℃時(shí)菌落直徑最大,為4.53 cm,顯著高于其他處理(P<0.05)(圖6-A),表明菌絲生長(zhǎng)的最適溫度為25 ℃。在20 ℃時(shí)孢子的萌發(fā)率達(dá)98%(圖6-B),顯著高于其他溫度(P< 0.05),說(shuō)明孢子萌發(fā)的最佳溫度為20 ℃。

圖6 溫度對(duì)菌株BCG生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)的影響Fig.6 Effect of temperature colony size and spore germination rate of strain BCG

2.4.3 pH對(duì)菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)的影響 病原菌BCG在pH為5.0～10.0的條件下,其菌絲和孢子均能正常生長(zhǎng)和萌發(fā)。在pH為6.0時(shí),菌落直徑最大,達(dá)4.75 cm,在pH為10.0時(shí),菌落直徑最小,僅為3.30 cm,差異顯著(P< 0.05),當(dāng)pH為5.0～8.0時(shí)差異不顯著(P< 0.05)(圖7-A),但當(dāng)pH為6.0時(shí),孢子萌發(fā)率最高,達(dá)80%(圖7-B),說(shuō)明菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)最適宜的pH為6.0。

圖7 pH對(duì)菌株BCG生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)的影響Fig.7 Effect of pH on colony size and spore germination rate of strain BCG

2.4.4 碳源對(duì)菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)的影響 以L-阿拉伯糖、L-鼠李糖和木糖作為碳源時(shí),菌株BCG生長(zhǎng)最快,菌落直徑達(dá)4.7 cm,顯著高于其他碳源(P<0.05)(圖8-A)。以甘露醇為碳源時(shí)孢子萌發(fā)率達(dá)90%,顯著高于其他處理(P< 0.05)(圖8-B),表明菌株BCG生長(zhǎng)的最適碳源為L(zhǎng)-阿拉伯糖、L-鼠李糖和木糖,孢子萌發(fā)的最適碳源為甘露醇。

A:1.可溶性淀粉;2.蔗糖;3.葡糖糖;4.乳糖;5.麥芽糖;6.甘露醇;7.L-阿拉伯糖;8.L-鼠李糖;9.D-果糖;10.木糖

2.4.5 氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)率的影響 以酵母浸粉為氮源時(shí),菌株BCG生長(zhǎng)最快,菌落直徑達(dá)4.75 cm;以硝酸鉀為氮源時(shí),菌絲生長(zhǎng)最慢,菌落直徑僅為1.27 cm,顯著低于其他氮源(P<0.05)(圖9-A)。以尿素為氮源時(shí)萌發(fā)率最高,達(dá)73%(圖9-B),顯著高于其他處理(P< 0.05),表明菌株BCG菌絲生長(zhǎng)的最適氮源為酵母浸粉,孢子萌發(fā)的最適氮源為尿素。

A:1.硝酸鉀;2.酵母膏;3.甘氨酸;4.蛋白胨;5.組氨酸;6.脯氨酸;7.尿素;8.磷酸氫二銨;9.氯化銨;10.硝酸銨;11.酵母浸粉

3 討 論

油菜黑脛病(L.biglobosa)是危害十字花科的重要病害之一,主要侵染寄主植物的葉片和莖稈。在甘肅省隴南市發(fā)現(xiàn)的大白菜標(biāo)本上,其病斑癥狀與楊龍等[22]所報(bào)道的由L.biglobosa引起油菜葉片上的病斑癥狀相似,均產(chǎn)生了具有明顯邊界的枯死斑且病斑上有小黑點(diǎn),但是病斑顏色稍有區(qū)別,油菜葉片病斑呈黃褐色,而大白菜葉片病斑呈灰白色,這可能是由于寄主植物、發(fā)病程度和環(huán)境的不同所導(dǎo)致。本試驗(yàn)中,分離物BCG在致病性測(cè)試中其發(fā)病癥狀與田間采集癥狀基本一致,并再次分離得到接種物,其菌落特征與Deng等[23]所報(bào)道的基本一致,分生孢子器和分生孢子形態(tài)與宋培玲等[24]所報(bào)道一致, 因此將菌株BCG初步鑒定為L(zhǎng).biglobosa。一般研究者僅依靠形態(tài)學(xué)特征很難將病原菌準(zhǔn)確鑒定到種,隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,為了更準(zhǔn)確鑒定病原菌,通常將PCR技術(shù)和多基因鑒定方法用于復(fù)雜物種的鑒定,可以根據(jù)其親緣關(guān)系快速鑒定物種[25-27]。本試驗(yàn)采用通用引物ITS,特異性引物Actin和β-tubulin進(jìn)行測(cè)序,將所得序列進(jìn)行多基因比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),結(jié)合形態(tài)特征將菌株BCG鑒定為油菜黑脛病菌(L.biglobosa)。

生物學(xué)測(cè)定結(jié)果表明,菌株BCG于供試的9種培養(yǎng)基上均能正常生長(zhǎng),表明供試培養(yǎng)基類型不影響其生長(zhǎng)。此外,菌株BCG在10～35 ℃均可生長(zhǎng),其最適溫度為25 ℃,與郝麗芬等[28]的報(bào)道一致;菌株BCG在pH 5.0～10.0均可生長(zhǎng),且在pH為5.0～8.0時(shí)差異不顯著(P<0.05),說(shuō)明菌株BCG具有較強(qiáng)的pH適應(yīng)性,在弱酸至中性再至弱堿環(huán)境中均可正常生長(zhǎng)。另外,菌株BCG的最適pH、最適碳源和最適氮源與郝麗芬等[28]的報(bào)道有所差異,可能由于地理位置、寄主和自然環(huán)境的不同,導(dǎo)致菌株的適應(yīng)性不同,使得其生物學(xué)特性存在差異。

本試驗(yàn)通過(guò)分離與鑒定,確定了引起甘肅省大白菜葉斑病的病原菌為油菜黑脛病菌(L.biglobosa),為國(guó)內(nèi)首次證實(shí)由L.biglobosa引起大白菜葉斑病,并對(duì)該病原菌進(jìn)行了生物學(xué)特性測(cè)定,為該病害的診斷和綜合防治提供了依據(jù)。