新疆鹽堿土壤中克百威降解菌群結(jié)構(gòu)解析及降解菌株特性

阿孜古力·庫(kù)爾班,王 潔,馬無為,謝 滔,張 偉

(新疆特殊環(huán)境物種保護(hù)與調(diào)控生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室,新疆特殊環(huán)境物種多樣性應(yīng)用與調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,新疆師范大學(xué)校級(jí)重點(diǎn)學(xué)科生物學(xué)學(xué)科,新疆師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,烏魯木齊 830054)

氨基甲酸酯類農(nóng)藥是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用最為廣泛的高毒性殺蟲劑[1],屬于膽堿酯酶抑制劑,也是一種內(nèi)分泌干擾物[2]。目前氨基甲酸酯類農(nóng)藥種類多達(dá)1 000種以上。對(duì)該類農(nóng)藥的不合理使用,不但對(duì)生態(tài)環(huán)境造成破壞,藥物殘留還直接危害到人類的身體健康[3-4]。根據(jù)作用機(jī)制,氨基甲酸酯類農(nóng)藥與有機(jī)磷農(nóng)藥相似,會(huì)抑制動(dòng)物或人體內(nèi)乙酰膽堿酯酶活性使之不斷積蓄,從而產(chǎn)生毒性。若該農(nóng)藥在體內(nèi)長(zhǎng)期累積還會(huì)致畸、致癌、致突變,甚至死亡[5-7]。克百威(Carbofuran)是最常用的氨基甲酸酯類農(nóng)藥之一,在中性和偏酸性的環(huán)境中比較穩(wěn)定,半衰期可長(zhǎng)達(dá)10 a以上。目前該農(nóng)藥已被禁用[8],但以克百威為代表的氨基甲酸酯類農(nóng)藥長(zhǎng)期大量的使用對(duì)土壤、地下水等造成的污染仍將長(zhǎng)期存在。

新疆地區(qū)位于亞洲腹地,氣候干旱少雨,土壤pH達(dá)8.01以上,是中國(guó)受土壤鹽漬化危害最嚴(yán)重的地區(qū),因此被稱為世界鹽漬化土壤的博物館[9]。同時(shí),土地開發(fā)加大、土地利用方式的改變,使新疆鹽漬化土壤的類型、數(shù)量、分布等發(fā)生了新的變化,并引發(fā)了許多生態(tài)環(huán)境問題[10],導(dǎo)致土壤鹽漬化問題日益突出。阿克蘇地區(qū)是新疆土壤鹽漬化較為嚴(yán)重的地區(qū)之一,也是中國(guó)重要的優(yōu)質(zhì)商品棉生產(chǎn)基地。由于該地區(qū)獨(dú)特的氣候條件、地形特征、土壤類型等因素極易引起大面積鹽漬化發(fā)生[11-14],由此帶來土壤微生物多樣性的快速下降,土傳病蟲害明顯加重、土壤持續(xù)供給養(yǎng)分能力不足及產(chǎn)量明顯下降等嚴(yán)重后果。與此同時(shí),農(nóng)作物種類單一、棉花長(zhǎng)期連作現(xiàn)象較為嚴(yán)重等因素帶來病蟲害持續(xù)加重[15]、土壤中農(nóng)藥污染長(zhǎng)期積累等生態(tài)問題[16-17]。因此,為控制土壤鹽漬化及連作導(dǎo)致的病蟲害大規(guī)模爆發(fā),克百威等農(nóng)藥被廣泛、大量、常年使用,各類農(nóng)藥在土壤中積累的同時(shí),勢(shì)必使該地區(qū)土壤中也富集了具有降解各類農(nóng)藥的菌株[18]。由于微生物降解農(nóng)藥具有低成本、效率高、無二次污染、生態(tài)恢復(fù)較好等特點(diǎn),利用微生物處理農(nóng)藥污染已成為解決環(huán)境中農(nóng)藥殘留的重要途徑[19-20]。至今,國(guó)內(nèi)外學(xué)者從各種環(huán)境中分離到多種能夠降解克百威的微生物,分類學(xué)上隸屬于無色桿菌屬、產(chǎn)黃菌屬、假單胞菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、新鞘脂菌屬、金黃桿菌屬、地桿菌屬、屈撓桿菌屬、葡萄球菌屬、副球菌屬等[21]。同時(shí)對(duì)這些微生物降解克百威的條件及降解效率等也做了研究。例如,Pseudomonassp. AEBL3能夠在120 h內(nèi)對(duì)100 mg·L-1克百威的降解率達(dá)到96.2%,最適降解pH為6.0[22];Sphingomonassp.CDS-1能夠在14 h內(nèi)完全降解100 mg·L-1的克百威農(nóng)藥,最適降解條件為pH6.0～7.0[23];Novosphingobiumsp.FND-3最佳降解條件為pH6.0[24];Paracoccussp. YM3能夠在6 d內(nèi)完全降解50 mg·L-1的克百威,最佳降解條件為pH為7.0[25];Pseudomonassp. KBW-1能夠在108 h內(nèi)完全降解200 mg·L-1的克百威,最適降解pH為7.0[26];Novosphingobiumsp. KN65.2在24 h內(nèi)對(duì)200 mg·L-1克百威的降解率為40%,最適降解pH為7.0[27]等。其中降解pH條件大多數(shù)適應(yīng)于酸性和中性。但是由于新疆地區(qū)土壤鹽漬化較嚴(yán)重、大陸干旱半干旱等環(huán)境特點(diǎn),類似的研究成果并不適合用來解決當(dāng)?shù)貕A性土壤中克百威的殘留問題,而從這樣環(huán)境中分離出的具有克百威降解功能的微生物的分類和代謝途徑都可能與已經(jīng)報(bào)道的有所不同。

本研究從新疆長(zhǎng)期連作棉田土壤中富集培養(yǎng)得到在pH8.0條件下可穩(wěn)定傳代并降解克百威的菌群,進(jìn)而從菌群中分離出71株降解菌株,并從中篩選出2株能夠具有較高降解克百威能力的菌株KJ71、KJ74,進(jìn)而對(duì)這2株菌的降解特性進(jìn)行研究,并確定這2株菌最適降解條件。本研究從新疆鹽堿土壤中分離克百威降解菌株,為解決當(dāng)?shù)赝寥腊被姿狨ヮ愞r(nóng)藥污染提供微生物資源的同時(shí),開展克百威降解菌株的降解特性研究,為后期研究堿性條件下的克百威的生物降解途徑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 土壤樣品 采集自新疆阿克蘇棉區(qū) (79°45′81″～79°46′55″E,39°31′47″～39°45′50″N)連作10 a以上的土壤。采用五點(diǎn)采樣法,采樣后將土壤樣本帶回實(shí)驗(yàn)室-20 ℃保存。

1.1.2 主要試劑 克百威原藥購(gòu)自廣西廣酞農(nóng)業(yè)化工有限公司,純度≥98%。在甲醇中配置成10 g·L-1的儲(chǔ)備液,使用時(shí)將適量?jī)?chǔ)備液加入到培養(yǎng)基中稀釋成需要的濃度即可。細(xì)菌基因組提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司;PCR引物由上海生工合成。

1.1.3 培養(yǎng)基 基礎(chǔ)無機(jī)鹽培養(yǎng)基:NH4NO31.0 g,MgSO4·7H2O 0.2 g,KH2PO40.5 g,K2HPO41.5 g,NaCl 0.5 g,(NH4)2SO40.5 g,用蒸餾水溶解,pH=8.0,定容至1 000 mL,加入克百威儲(chǔ)備液至100 mg·L-1。

R2A培養(yǎng)基:酵母膏0.5 g,蛋白胨0.5 g,酪氨酸0.5 g,葡萄糖0.5 g,可溶性淀粉0.5 g,K2HPO40.3 g,MgSO4·7H2O 0.05 g,丙酮酸鈉0.3 g,用蒸餾水溶解,pH=8.0,定容至1 000 mL,克百威100 mg·L-1。

LB培養(yǎng)基:蛋白胨10 g,酵母膏5 g,NaCl 10 g,用蒸餾水溶解,pH=8.0,定容至1 000 mL,克百威100 mg·L-1。

固體培養(yǎng)基:以上培養(yǎng)基中添加18 g·L-1瓊脂粉調(diào)為固體,在1×105Pa滅菌30 min后使用。

1.2 方 法

1.2.1 克百威降解菌群的富集 稱取5.0 g土壤樣品,加入裝有100 mL含100 mg·L-1克百威的基礎(chǔ)無機(jī)鹽培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中,于37 ℃(編號(hào)為KBW 37)、120 r·min-1培養(yǎng)7 d。隨后以3%接種量傳代于新的含有上述培養(yǎng)基的三角瓶中,繼續(xù)在相同條件下培養(yǎng)。這樣連續(xù)傳代6次以上,部分菌液保存,部分菌液用于提取菌群總DNA,部分菌液用于分離純化克百威降解菌株。按同樣的方法富集28 ℃生長(zhǎng)的克百威菌群(編號(hào)為KBW 28用作和KBW 37降解菌群做對(duì)比)。

1.2.2 菌群的高通量測(cè)序及數(shù)據(jù)分析 富集的KBW 28和KBW 37菌群和土壤樣品(編號(hào)為TR)按照QIAGEN○RDNeasyRULtraClean○RMicrobial Kit步驟要求提取總DNA,電泳檢測(cè)合格后送至諾禾致源生物科技有限公司對(duì)樣品進(jìn)行高通量測(cè)序。

運(yùn)用FLASHv1.2.7軟件[28]對(duì)每個(gè)測(cè)序樣本的序列(Reads)進(jìn)行拼接,獲得原始拼接序列Tags數(shù)據(jù),對(duì)其進(jìn)行嚴(yán)格的過濾處理獲得高質(zhì)量的Tags數(shù)據(jù)[29]。通過Uparsev 7.0.1001軟件對(duì)所有樣本進(jìn)行聚類,用Mothur方法與SILVA 132的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行物種注釋分析,獲得在各個(gè)分類水平分類學(xué)信息。通過Qiime v1.9.1軟件計(jì)算各樣品的Chao1、Shannon、Simpson指數(shù),使用R v2.15.3軟件進(jìn)行各樣品的Alpha多樣性指數(shù)組間差異分析。此外,對(duì)高通量數(shù)據(jù)獲得的克百威菌群OTU數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理,在MENA網(wǎng)站(http://ieg4.rccc.ou.edu/mena)進(jìn)行上傳數(shù)據(jù)后,構(gòu)建Pearson相關(guān)性矩陣。基于RMT(隨機(jī)矩陣?yán)碚?RandomMatrixTheory)設(shè)置合適的閾值,構(gòu)建克百威降解菌群微生物分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò),研究不同溫度條件下富集的微生物群落之間的相互作用,獲得網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)文件,根據(jù)Deng等[30]的研究對(duì)微生物網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建進(jìn)行詳細(xì)的分析。

1.2.3 克百威降解菌株的分離與純化 將富集得到的37 ℃降解菌群,分別使用基礎(chǔ)無機(jī)鹽培養(yǎng)基、R2A培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基采用稀釋涂布法從中分離微生物。將系列稀釋液分別涂布于含有克百威的上述培養(yǎng)基中,37 ℃、55%恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～7 d,挑取生長(zhǎng)較快、菌落形態(tài)有明顯差異的單菌落,連續(xù)劃線純化培養(yǎng)獲取不同形態(tài)菌落的純培養(yǎng)物。

1.2.4 菌株的16S rRNA鑒定 依照TIANamp Bacteria DNA Kit基因組提取試劑盒操作流程提取各菌株的DNA并作為模板,使用通用引物27F和1492R進(jìn)行16S rRNA基因PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增在Applied biosystems 2720擴(kuò)增儀上進(jìn)行,擴(kuò)增體系為25 μL。PCR反應(yīng)條件為:94 ℃ 5 min(預(yù)變性);94 ℃ 30 s(變性),55 ℃ 30 s(退火),72 ℃ 1 min(延伸),循環(huán)30次;72 ℃ 10 min(延伸)。PCR產(chǎn)物送至上海生工公司完成測(cè)序。測(cè)序數(shù)據(jù)在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行同源性比較,并提交至NCBI獲得菌株序列GenBank登錄號(hào)(MV866517-MV866520、MW301219-MW301257、MW819911-MW819933、 OL960556-OL960560)。用MEGA 7.0[31]軟件構(gòu)建Neighbor-Joining系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.5 克百威含量的檢測(cè) 克百威標(biāo)準(zhǔn)曲線制作:稱取一定量的克百威原藥,用色譜甲醇作為溶劑配置成質(zhì)量濃度為10 g·L-1儲(chǔ)備液,逐級(jí)稀釋配制質(zhì)量濃度為0、10、20、40、60、80、100 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)液,進(jìn)行液相色譜分析,測(cè)定峰面積,根據(jù)峰面積與濃度的對(duì)應(yīng)關(guān)系制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

待測(cè)樣檢測(cè):從待測(cè)樣品中取500 μL培養(yǎng)液,加入等體積的色譜甲醇萃取克百威,劇烈震蕩后在12 000 r·min-1條件下離心8 min,移取上層有機(jī)相,過孔徑0.45 μm的有機(jī)相針頭過濾器過濾后,用液相色譜測(cè)定樣液中克百威的含量。液相色譜條件為:C18 DiamosilTM反相柱;色譜柱 (250 mm×4.6 mm,粒徑5 μm);流動(dòng)相:甲醇/水(體積比70∶30),流速1 mL·min-1;紫外檢測(cè)器:波長(zhǎng)280 nm;進(jìn)樣量:10 μL;柱溫: 25 ℃;保留時(shí)間:6 min。參考文獻(xiàn)[32]計(jì)算克百威降解率,克百威降解率=[1-(實(shí)測(cè)含量/添加量)]×100%。

1.2.6 降解菌株的篩選 將從克百威降解菌群中分離到的各菌株先于富含高濃度克百威的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng),檢測(cè)降解菌株能否耐受并高效降解不同濃度的克百威農(nóng)藥,從而確定其生物修復(fù)應(yīng)用能力,其次以1%的接種量接入裝有100 mL基礎(chǔ)無機(jī)鹽培養(yǎng)基(克百威濃度20 mg·L-1)的250 mL三角瓶中(每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)),于37 ℃、120 r·min-1震蕩培養(yǎng),24 h后采用液相色譜法測(cè)定克百威殘留濃度,從中選出對(duì)克百威降解能力較強(qiáng)的菌株。

1.2.7 細(xì)菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 將對(duì)克百威降解能力較強(qiáng)的菌株KJ71和KJ74劃線接種到LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)18 h,作為種子液。將種子液以5%的接種量接入到250 mL LB培養(yǎng)基中, 37 ℃、120 r·min-1培養(yǎng),每隔2 h測(cè)定菌株OD600,以O(shè)D600值為縱坐標(biāo),時(shí)間為橫坐標(biāo)繪制菌株的生長(zhǎng)曲線。

1.2.8 克百威濃度、溫度、pH對(duì)降解克百威效率的影響 在1%接種量,120 r·min-1搖床中避光培養(yǎng)72 h為基本條件進(jìn)行單因素試驗(yàn)。在 “1.2.6”中得到的KJ71和KJ74菌株種子液,將在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期后,取出10 mL, 4 ℃、8 000 r·min-1離心5 min收集菌體,(菌體用1 mL無菌水重懸)以1%的接種量分別測(cè)定在 37 ℃條件下克百威質(zhì)量濃度分別為20、50、100 mg·L-1環(huán)境中菌株對(duì)克百威的降解;將上述方法收集的菌體懸液,以1%的接種量分別測(cè)定在 37 ℃條件下pH為6.0、7.0、8.0和 9.0環(huán)境中菌株對(duì)50 mg·L-1克百威的降解;在pH為7.0和9.0,以1%的接種量條件下分別測(cè)定溫度為25、30和35 ℃環(huán)境中菌株對(duì)50 mg·L-1克百威的降解。以上試驗(yàn)驗(yàn)均在250 mL三角瓶中加入100 mL含有克百威的基礎(chǔ)無機(jī)鹽培養(yǎng)基中接入菌體懸液避光培養(yǎng),以不接菌只含有克百威的基礎(chǔ)無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基為對(duì)照,每次試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù),用液相色譜法測(cè)定菌株對(duì)克百威的降解率。

1.2.9 添加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)降解率的影響 對(duì)單菌及菌群降解特性的比較,在250 mL三角瓶中加入100 mL基礎(chǔ)無機(jī)鹽培養(yǎng)基(含有克百威濃度為50 mg·L-1)分別添加葡萄糖、酵母膏、牛肉膏、蛋白胨,使它們的終濃度達(dá)到1 g·L-1。將菌體懸液及菌群以1%的接種量接入上述培養(yǎng)基中,于37 ℃,120 r·min-1搖床中震蕩培養(yǎng)72 h(菌群培養(yǎng)36 h),同時(shí)設(shè)置不添加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的作為對(duì)照,樣品經(jīng)處理后,檢測(cè)克百威降解效率。

2 結(jié)果與分析

2.1 高通量測(cè)序結(jié)果及微生物群落多樣性分析

克百威降解菌群測(cè)序結(jié)果顯示:總序列數(shù) 9 554.6條,總堿基數(shù)為11 338 836.4 bp,其中有效序列為7 778條,占總序列的80.73%,無效序列為1 776.6條。序列平均長(zhǎng)度為1 456.4 bp。采用Shannon和Simpson指數(shù)等對(duì)KBW 28、KBW 37和TR中微生物的多樣性進(jìn)行評(píng)價(jià),采用Observed species和Chao1對(duì)該微生物菌群的豐度進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果表明,原土壤樣品中細(xì)菌的多樣性指數(shù)及豐度明顯高于不同溫度富集的克百威菌群,表明原土壤中微生物群落種群差異性較大;28 ℃條件下富集的克百威降解菌群中所含物種數(shù)較37 ℃富集的菌群高,二者微生物菌群豐度差異明顯;原土壤樣品的覆蓋率都大于28 ℃和37 ℃富集的克百威降解菌群,說明樣品文庫(kù)的覆蓋率很大,樣品中序列沒有被測(cè)出的概率極低(表1)。

表1 樣品多樣性指數(shù)Table 1 Sample diversity index

2.2 克百威降解菌群結(jié)構(gòu)組成分析

在門分類水平上相對(duì)豐度前10物種比較結(jié)果顯示:KBW 28菌群和KBW 37菌群中最豐富的菌門為變形菌門(Proteobacteria),相對(duì)豐度分別為 98.87%、88.24%;擬桿菌門(Bacteroidetes),相對(duì)豐度分別為1.13%、11.47%;而TR菌群中占優(yōu)勢(shì)的細(xì)菌門有變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、綠彎菌門(Chloroflexi)、放線菌門(Actinobacteria),相對(duì)豐度分別為26.17%、23.51%、13.71%、7.49%、 5.16%;在屬水平上,KBW 28菌群中的優(yōu)勢(shì)菌屬依次為Aquamicrobium(27.52%)、Methyloversatilis(19.36%)、Hyphomicrobium(6.93%)、Achromobacter(5.48%),在KBW 37菌群中占優(yōu)勢(shì)的菌屬依次為Pseudoxanthomonas(54.30%),Hyphomicrobium(13.98%)、Hydrogenophaga(3.32%)、Aquamicrobium(3.13%),TR菌群中優(yōu)勢(shì)菌屬為Hyphomicrobium(0.1%),其余99.8%的菌屬?zèng)]有檢測(cè)出來。

由此可見,通過使用克百威農(nóng)藥脅迫培養(yǎng),從該棉區(qū)土壤中富集出了新的微生物群落結(jié)構(gòu)組成。同時(shí)溫度對(duì)克百威菌群結(jié)構(gòu)的影響也較大,當(dāng)溫度與土壤真實(shí)值接近時(shí),在門和屬水平上檢測(cè)出的優(yōu)勢(shì)菌門屬雖然相對(duì)豐度較低,但較為多樣。當(dāng)溫度為37 ℃時(shí),細(xì)菌生長(zhǎng)代謝較快,但菌群結(jié)構(gòu)趨于簡(jiǎn)單或者導(dǎo)致部分菌屬的豐度下降(圖1)。

圖1 門分類水平top 10相對(duì)豐度(A)和屬分類水平top 10(B)Fig.1 TOP10 at phylum level(A) and TOP10 at genus level(B)

2.3 克百威降解菌群的共發(fā)生模式

2.3.1 網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu) 分別基于28 ℃和37 ℃富集的克百威降解菌群的測(cè)序結(jié)果構(gòu)建分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)(圖2)。結(jié)果顯示,KBW 37微生物群落共發(fā)生的物種、物種所屬于的屬、物種之間的正相關(guān)關(guān)系較KBW 28多。其中KBW 28群落網(wǎng)絡(luò)由16個(gè)節(jié)點(diǎn)和30條邊線組成,隸屬于16個(gè)菌屬,連通度較大的微生物類群為變形菌門(Proteobacteria);KBW 37微生物分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)的節(jié)點(diǎn)數(shù)總計(jì)為19,隸屬于19個(gè)菌屬,細(xì)菌物種間連接數(shù)較多,在菌群中變形菌門(Proteobacteria)的連通度較高,也存在部分芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、放線菌門(Actinobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)。在KBW 28中度較大的節(jié)點(diǎn)主要來有Methyloversatilis、Aquamicrobium、Diaphorobacter、Achromobacter、Hyphomicrobium、Pseudoxanthomonas、Brevundimonas。而在KBW 37中度較大的節(jié)點(diǎn)主要有Noviherbaspirillum。此外,KBW 28菌群中正相關(guān)比負(fù)相關(guān)占多數(shù),表明該菌群中物種間更多的是合作或共生關(guān)系。但是KBW 37菌群來說,網(wǎng)絡(luò)圖中正相關(guān)及負(fù)相關(guān)數(shù)占比一樣多,說明該菌群中物種間的相互作用較為復(fù)雜,種間也存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系。

圖2 不同處理克百威菌群共線性網(wǎng)絡(luò)圖譜Fig.2 Network co-occurrence analysis of carbofuran flora under different treatments

2.3.2 拓?fù)涮匦?對(duì)比不同溫度富集的克百威降解菌群網(wǎng)絡(luò)拓?fù)涮匦灾锌梢钥闯?表2), KBW 37中的網(wǎng)絡(luò)總節(jié)點(diǎn)數(shù)、總連接數(shù)和平均連通度較KBW 28更高,表明37 ℃富集的克百威降解菌群的微生物網(wǎng)絡(luò)規(guī)模更大,相互作用的關(guān)系更為復(fù)雜;微生物網(wǎng)絡(luò)路徑距離代表物種間傳遞物質(zhì)、能量及信息的效率[33],相比較于KBW 28,KBW 37的網(wǎng)絡(luò)平均路徑距離較短,說明KBW 37中微生物間響應(yīng)速度更快,當(dāng)外界溫度發(fā)生變化時(shí)該菌群中群落結(jié)構(gòu)更易波動(dòng)。

表2 不同處理微生物作網(wǎng)絡(luò)拓?fù)湫再|(zhì)Table 2 Topological properties of microbial interaction network relative to treatment

2.4 克百威降解菌的分離與初步鑒定

從克百威菌群中共分離篩選出71株菌株,它們分別隸屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)48株、埃希氏桿菌屬(Escherichia)11株、志賀氏菌屬(Shigella)5株、短芽胞桿菌屬(Brevibacillus)2株、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)2株、腸桿菌屬(Enterobacter)1株、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)1株、紅球菌屬(Rhodococcus)1株等8個(gè)屬。分別選擇與71株菌株的16S rRNA序列GenBank相似性最高的Enterobacterhormaecheisubsp.Xiangfangensis10-17、Bacillustequilensis10b、RhodococcuspyridinivoransPDB9、PaenibacilluslautusNBRC15380、AcinetobacterlwoffiiJCM6840等菌株序列進(jìn)行比對(duì)并構(gòu)建進(jìn)化樹(圖3)。

圖3 71株菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of 71 strains

2.5 菌株降解能力篩選

從71株菌株中分別獲得3株能夠在富含高濃度克百威的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的菌株,并利用高效液相色譜法測(cè)定該3株菌株對(duì)克百威的降解能力。根據(jù)回歸方程y=0.069 5x+ 0.045 2 (R2=0.996 3),計(jì)算該3株菌對(duì)克百威的降解能力并進(jìn)行比較。結(jié)果表明,菌株KJK44、KJ71、KJ74菌降解率分別為37.58%、41.40%、 39.23%,其中KJ71和KJ74具有較好的降解率。鑒于此,本研究選擇KJ71(隸屬于紅球菌屬,登錄號(hào)為MW819928)和KJ74菌株(隸屬于類芽孢桿菌屬,登錄號(hào)為MV866520)為研究對(duì)象,進(jìn)行下一步的研究(圖4)。

圖4 不同菌株克百威的降解率Fig.4 Degradation rate of different strains in degradating carbofuranin

2.6 菌株KJ71和KJ74的生長(zhǎng)特性

圖5為KJ71和KJ74兩株菌在5%接種量,37 ℃、120 r·min-1培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)曲線,0～2 h時(shí),菌株生長(zhǎng)較為緩慢,處于生長(zhǎng)緩慢期,2 h后,OD600數(shù)值迅速增加,該兩株菌進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,代謝活動(dòng)較為活躍,其中KJ71菌株生長(zhǎng)20 h后,KJ74菌株30 h后生長(zhǎng)速度下降,增長(zhǎng)較為緩慢,菌株的生長(zhǎng)曲線為后期微生物菌劑的制備提供了條件。

圖5 2株菌生長(zhǎng)曲線Fig.5 Growth curve of 2 strains of bacteria

2.7 菌株KJ71和KJ74的降解特性

2.7.1 克百威質(zhì)量濃度對(duì)菌株降解能力的影響 隨著克百威濃度的增高,菌株KJ71和KJ74對(duì)克百威降解率隨之增高,當(dāng)克百威質(zhì)量濃度為50 mg·L-1時(shí),降解率達(dá)到最高,分別為67.90%、71.00%。克百威質(zhì)量濃度超過50 mg·L-1時(shí),降解率隨之降低,這說明克百威質(zhì)量濃度過高會(huì)抑制KJ71和KJ74菌株對(duì)克百威的降解(圖6)。

圖6 不同克百威初始質(zhì)量濃度下2株菌降解克百威的降解率Fig.6 Degradation rate of two strains of bacteria in degradating carbofuran in differnet initial concentations

2.7.2 pH對(duì)菌株降解能力的影響 在初始pH分別為6.0、7.0、8.0、9.0,克百威質(zhì)量濃度為50 mg·L-1的富集培養(yǎng)基中,KJ71在pH為6.0～9.0時(shí),克百威的降解率變化不大,其中72 h, pH=9.0時(shí)該菌株降解克百威的降解率達(dá)到最大,為63.88%;對(duì)KJ74菌株來說,pH在6.0～9.0,該菌株對(duì)克百威的降解率先升高后降低,培養(yǎng)72 h,pH=7.0時(shí)對(duì)克百威的降解效率達(dá)到最大,為70.22%(圖7)。

圖7 不同初始pH下2株菌降解克百威的降解率Fig.7 Degradation rate of 2 strains of bacteria in degradating carbofuran in differnet initial pH

2.7.3 溫度對(duì)菌株降解能力的影響 在25、30、35 ℃條件下,菌株KJ71對(duì)克百威的降解率分別為28.65%、27.20%、27.70%,降解效率變化不大;對(duì)菌株KJ74來說,在不同的溫度下,對(duì)克百威的降解效率先升高后降低,當(dāng)溫度為30 ℃時(shí)降解效率達(dá)到最大為36.30%(圖8)。

圖8 不同溫度下2株菌降解克百威的降解率Fig.8 Degradation rate of 2 strains of bacteria in degrading carbofuran in different temperatures

2.7.4 添加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)降解效率的影響 添加少量有機(jī)氮源,如蛋白胨、牛肉膏可提高菌株KJ71和KJ74對(duì)克百威的降解率,添加少量有機(jī)碳源葡萄糖時(shí)菌株對(duì)克百威的降解率受到抑制,添加酵母膏時(shí)降解率不變。原因在于當(dāng)培養(yǎng)基中添加外加氮源能夠促進(jìn)菌株的生長(zhǎng),使其生物種群增大,從而促進(jìn)該2株菌株對(duì)克百威的降解,但是外加碳源卻抑制菌株的生長(zhǎng),導(dǎo)致降解率較只加氮源有明顯降低。但是對(duì)于克百威菌群來說,添加不同的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)均有助于提高菌群對(duì)克百威的降解能力,這說明菌群在利用有機(jī)碳源及氮源快速增長(zhǎng)的同時(shí)加大了對(duì)克百威的分解利用。特別是在蛋白胨體系中(圖9)。

圖9 添加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)單菌和菌群降解克百威的降解率Fig.9 Degradation rate of single bacteria and microflora in degrading carbofuran in nutrient addition

3 討論與結(jié)論

土壤是最復(fù)雜的微生態(tài)系統(tǒng)之一,氣候條件、土壤理化性質(zhì)、栽培作物的種類,甚至其栽培管理措施等都是影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)組成的重要因素。新疆特殊的氣候和土壤性質(zhì)使該地區(qū)擁有獨(dú)特的微生物資源,而棉區(qū)作物種類單一等因素又促使土壤演替出新的微生物群落結(jié)構(gòu)組成[34]。通過研究發(fā)現(xiàn),在僅有克百威農(nóng)藥作為碳源的脅迫下,富集到的菌群結(jié)構(gòu)組成與長(zhǎng)期連作棉田土壤微生物群落結(jié)構(gòu)相比發(fā)生了巨大改變。首先,在門水平上,占優(yōu)勢(shì)的門及其相對(duì)豐度就發(fā)生了很大變化。如Proteobacteria所占比例由 26.17%增加到88.24%,而原來相對(duì)豐度10%左右的Acidobacteria、Planctomycetes、Chloroflexi在克百威降解菌群中幾乎未檢測(cè)到。在屬分類水平上,克百威降解菌群中占優(yōu)勢(shì)的Pseudoxanthomonas、Hyphomicrobium、Hydrogenophaga等屬在土壤微生物群落結(jié)構(gòu)中的相對(duì)豐度依次僅為0.08%、0.10%、0.01%。其次,在不同的溫度條件下農(nóng)藥克百威脅迫形成的菌群之間相比,盡管菌群來源及使用農(nóng)藥一樣,但富集后的菌群結(jié)構(gòu)依然在門和屬水平及其相對(duì)豐度上仍然存在差異。從兩個(gè)不同溫度培養(yǎng)菌群整個(gè)網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu)來看,KBW 37微生物群落成員共發(fā)生的物種數(shù)和其所屬的菌屬均較KBW 28多。由此可見,溫度條件對(duì)降解菌群結(jié)構(gòu)組成造成很大的影響,同一種農(nóng)藥脅迫下不同培養(yǎng)溫度能富集到結(jié)構(gòu)不同的降解菌群。說明,新疆地區(qū)鹽漬化嚴(yán)重、干旱等特殊的氣候條件使該地區(qū)形成了特殊的微生物類群,也進(jìn)一步解釋了在其他地區(qū)使用的克百威降解菌株卻在該土壤中不適用的原因。因此,本研究在高通量水平上為后期更好地研究適合新疆當(dāng)?shù)赝寥拉h(huán)境克百威降解菌株的挖掘提供了理論依據(jù)。

1986年Karns等[35]首次從受克百威污染的活性污泥中分離到一株克百威降解菌VW1(Achromobacter),從此拉開了克百威降解菌篩選工作的序幕。至今,國(guó)內(nèi)外研究者已經(jīng)從不同環(huán)境中分離到多株能夠降解克百威的微生物,它們?cè)诜诸悓W(xué)上隸屬于不同的種屬,其中以Pseudomonas居多。本研究從降解菌群中分離篩選出71株菌株,分別隸屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)、埃希氏桿菌屬(Escherichia)、志賀氏菌屬(Shigella)、短芽胞桿菌屬(Brevibacillus)、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)、腸桿菌屬(Enterobacter)、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)、紅球菌屬(Rhodococcus)。這與高通量測(cè)序結(jié)果完全不一致,與目前已報(bào)道的能夠降解克百威的菌株進(jìn)行屬水平的比較也存在一定的差異。原因可能在于:第一,分離培養(yǎng)使用的培養(yǎng)基或者pH、溫度等培養(yǎng)條件仍然無法滿足部分菌株的生長(zhǎng)需求,而未能培養(yǎng)出來;第二,很有可能是土壤樣本采集地環(huán)境所孕育的物種差異導(dǎo)致的。那么來自不同環(huán)境下的不同菌屬在降解克百威的降解效率以及代謝通路上是否也存在差異,值得進(jìn)一步研究。

研究表明,微生物農(nóng)藥降解受很多因素的影響,如微生物自身特征、農(nóng)藥初始濃度、溫度、pH以及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等[10]。目前國(guó)內(nèi)外研究者,從各種污染環(huán)境中篩選出多株克百威降解菌株,它們對(duì)克百威的降解效率有高有低,降解條件pH大多數(shù)偏向于中性和酸性環(huán)境。然而,新疆地區(qū)由于土壤鹽漬化嚴(yán)重、干旱等獨(dú)特的環(huán)境特點(diǎn),適合內(nèi)地環(huán)境條件的克百威降解菌株在新疆并不一定適用。因此本研究以當(dāng)?shù)赝寥拉h(huán)境為研究對(duì)象,在堿性條件下進(jìn)行菌群富集培養(yǎng)并從中篩選出能適應(yīng)堿性條件的克百威降解菌株,利用高效液相色譜法研究克百威分離菌株與克百威菌群在不同培養(yǎng)階段的降解效率,探究不同條件對(duì)菌株降解克百威的影響。研究過程中發(fā)現(xiàn),隸屬于紅球菌屬(Rhodococcus)及類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)的菌株KJ71和KJ74是從本地土壤中分離獲得的具有降解克百威能力的菌株。而已有的研究表明,目前已發(fā)表的參與克百威降解的細(xì)菌中,尚未有Rhodococcus、Paenibacillus的菌株被報(bào)道,同時(shí)隸屬于Rhodococcus、Paenibacillus的菌株KJ71和KJ74是首次獲得的能在堿性條件下參與克百威降解能力的細(xì)菌。因此通過高效液相色譜法對(duì)該2株菌株進(jìn)行了降解特性的研究,發(fā)現(xiàn)在25 ℃～35 ℃,溫度對(duì)KJ71降解克百威沒有顯著影響,對(duì)KJ74菌株來說,當(dāng)溫度為 30 ℃時(shí)降解效果最好,這個(gè)特性與當(dāng)?shù)刈魑锓N植季節(jié)土壤溫度相符;在pH為6.0～9.0,當(dāng)pH分別為 9.0、7.0時(shí)KJ71和KJ74對(duì)克百威的降解效率達(dá)到最好,分別為63.88%和 70.22%,較寬的pH適應(yīng)范圍非常有利于開發(fā)利用。在培養(yǎng)基中添加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)菌株及菌群降解克百威效率的影響中發(fā)現(xiàn),當(dāng)添加少量有機(jī)氮源時(shí)可促進(jìn)菌株對(duì)克百威的降解效率,添加少量有機(jī)碳源葡萄糖時(shí)菌株對(duì)克百威的降解率受到抑制;對(duì)菌群來說添加有機(jī)碳源及有機(jī)氮源均有助于提高菌群對(duì)克百威的降解效率。由此可見,KJ71和KJ74菌株在降解克百威的過程中,具有良好的環(huán)境適應(yīng)性,該研究結(jié)果可為開發(fā)該地區(qū)環(huán)境條件下的克百威降解基因及降解途徑、新疆地區(qū)土壤環(huán)境修復(fù)打下基礎(chǔ)。

由于克百威本身對(duì)于生物安全具有危害性,且已經(jīng)被大量應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中,所以研究以克百威為代表的氨基甲酸酯類農(nóng)藥的生物降解仍具有重要的意義。篩選出能夠高效降解克百威的菌株是生物降解的基礎(chǔ),探究降解菌的降解特性對(duì)日后將降解菌推向新疆鹽堿土壤中氨基甲酸酯類農(nóng)藥污染的修復(fù)等方面具有應(yīng)用價(jià)值。當(dāng)然,探究這些菌株在堿性條件下的生物降解途徑相關(guān)問題還尚待深入。