清熱化濕方通過上調miRNA-155抑制Wnt/β-catenin信號通路治療胃癌的作用機制研究Δ

尹碩鑫，敖先偉，李 博，張 濤，陳遠能#（1.南陽市中心醫(yī)院，河南 南陽 7000；.荊州市第二人民醫(yī)院消化內科，湖北 荊州 000；.南陽市中心醫(yī)院呼吸內科，河南 南陽 7000；.廣西中醫(yī)藥大學附屬瑞康醫(yī)院消化內科，南寧 50011）

胃癌是全球第五大常見癌癥[1]，全球每年約有100萬人診斷為胃癌，其中約40%的新發(fā)病例和死亡病例發(fā)生在中國[2]。目前，胃癌的主要治療方法包括手術和放化療，但術后復發(fā)率高，并且晚期胃癌患者化療后5年生存率低于5%[3]。中醫(yī)藥作為我國醫(yī)療事業(yè)中不可或缺的一部分，不僅能提高化療藥的療效、減少副作用、提高患者生活質量，還能減慢腫瘤生長速度、緩解臨床癥狀，在腫瘤患者治療中的應用也日益廣泛。

清熱化濕方為經典方“藿樸夏苓湯”加黃連、梔子化裁而成。藿樸夏苓湯出自清代的《醫(yī)原》，能宣通氣機、燥濕利水[4]。本課題組前期研究證實，清熱化濕方能夠防治幽門螺桿菌感染相關的胃癌[5—6]。近年來miRNA與胃癌的關系被廣泛報道。本課題組前期通過基因芯片分析發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中的miRNA-155 會被明顯下調[7]，且穩(wěn)定沉默miRNA-155 可促進胃癌的進展[8]。此外，有研究顯示，miRNA能夠通過調節(jié)Wnt/β-catenin信號通路參與調控胃癌細胞的生物學行為[9]?；诖?，本研究通過構建胃癌荷瘤裸鼠模型探討清熱化濕方是否能夠通過干預miRNA-155 抑制Wnt/β-catenin 信號通路中Wnt7、β-catenin、T 細胞因子4（T-cell factor-4，TCF-4）表達進而治療胃癌，以期為清熱化濕方的臨床應用提供依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

IX71 型熒光倒置顯微鏡購自日本Olympus 公司；RM2135 型切片機購自德國Leica 公司；3K15 型低溫冷凍離心機購自德國Sigma 公司；Mini Protean 3 Cell 型電泳儀購自美國BioRad公司；MK3型酶標儀、ChemiScope 5300 Pro 型一體式化學發(fā)光成像儀均購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 藥品與試劑

清熱化濕方（包括藿香6 g、白豆蔻1.8 g、淡豆豉9 g、川厚樸3 g、姜半夏4.5 g、杏仁9 g、赤茯苓9 g、豬苓4.5 g、澤瀉4.5 g、生薏苡仁12 g、黃連12 g、梔子12 g）購自廣西中醫(yī)藥大學附屬瑞康醫(yī)院。過表達miRNA-155 慢病毒由漢恒生物科技（上海）有限公司構建；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清（批號分別為SH30022.01、SH30406.05）均購自美國HyClone 公司；青鏈雙抗（批號E607011）購自生工生物工程（上海）股份有限公司；嘌呤霉素、Trizol RNA 提取試劑、SYBRGreen PCR 試劑盒、逆轉錄試劑盒（批號分別為A1113803、15596026、F-415XL、K1622）均購自美國Thermo Fisher Scientific 公司；0.25%胰蛋白酶（批號C0201）購自上海碧云天生物技術有限公司；BCA蛋白定量試劑盒（批號BL521A）購自廣州碩譜生物科技有限公司；磷酸鹽緩沖液（PBS，批號422300）購自北京索萊寶科技有限公司；ECL發(fā)光液購自美國Millipore公司；兔源Wnt 單克隆抗體（批號10605-1-AP）購自美國Proteintech 公司；兔源β-catenin 單克隆抗體（批號ab32572）購自英國Abcam公司；山羊抗小鼠免疫球蛋白G二抗（批號223120412）購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3 實驗動物

本研究所用動物為SPF 級裸鼠，雄性，4 周齡，實驗動物生產許可證號為SCXK（蘇）2021-0010，動物合格證號為202235128。本研究經廣西中醫(yī)藥大學動物倫理委員會審核批準，批準號為DW20220621-122。

1.4 細胞株

人胃腺癌AGS 細胞購自賽百慷（上海）生物技術股份有限公司。

2 方法

2.1 清熱化濕方藥液的制備

按處方量稱取清熱化濕方藥材，搗碎，先以8倍量水煮沸30 min，用8層紗布過濾；藥渣再以6倍量水煮沸30 min 后同法過濾；合并兩次濾液，濃縮成質量濃度為1 g/mL的藥液（以生藥量計），于4 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 miRNA-155過表達AGS細胞株的構建

將AGS細胞鋪板于培養(yǎng)皿中，密度為5×104個/皿；待細胞匯合度為80%時，以最佳感染復數(shù)（200）進行病毒感染；繼續(xù)培養(yǎng)24 h后更換為DMEM高糖培養(yǎng)基；感染72 h 后，加入含5 μg/mL 嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基進行篩選，以后每天用熒光顯微鏡觀察細胞熒光及細胞狀態(tài)，當熒光效率在90%以上時表明miRNA-155 過表達AGS細胞株構建成功。

2.3 胃癌荷瘤模型裸鼠的構建及分組給藥

將裸鼠適應性喂養(yǎng)1 周后按體重隨機分為模型組、對照組、過表達組和清熱化濕方低、中、高劑量組，每組5只。將裸鼠置于超凈臺內，以75%乙醇消毒裸鼠右側腋部皮膚后，除過表達組裸鼠接種過表達miRNA-155 AGS細胞外，其余各組裸鼠接種AGS細胞懸液（密度為1×107個/mL）。清熱化濕方低、中、高劑量組裸鼠從造模第2 天起分別按2.71、5.43、10.86 g/kg 灌胃相應藥液（劑量參考文獻[10]設置），對照組腹腔注射順鉑（0.004 g/kg）+氟尿嘧啶（0.02 g/kg）（劑量根據(jù)臨床等效劑量換算），每天1次，連續(xù)3周；模型組和過表達組灌胃等體積生理鹽水。末次給藥后禁食不禁水，于24 h后采用頸椎脫臼法處死，并取腫瘤組織進行檢測分析。

2.4 裸鼠腫瘤抑制率的測定

以生理鹽水沖洗各組裸鼠腫瘤組織，然后測量其質量，并計算腫瘤抑制率。腫瘤抑制率＝（模型組腫瘤組織質量—干預組腫瘤組織質量）/模型組腫瘤組織質量×100%。

2.5 裸鼠腫瘤組織的病理學形態(tài)觀察

取各組裸鼠部分腫瘤組織，以10%甲醛固定液固定，切開病灶，流水沖洗干凈后放入生物脫水機中逐級脫水、透明、石蠟浸泡、包埋，切片4 μm，以常規(guī)蘇木素-伊紅（HE）染色后，采用顯微鏡觀察并拍照。

2.6 裸鼠腫瘤組織中miRNA-155 和Wnt7、β-catenin、TCF-4 mRNA表達水平的檢測

采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）法進行檢測。取各組裸鼠腫瘤組織各20 mg，加入Trizol裂解液1 mL后提取總RNA；取適量總RNA將其反轉錄成cDNA，然后進行PCR 擴增。PCR 反應條件為：95 ℃預變性30 s；95 ℃變 性15 s；循 環(huán)60 次。以U6 或GAPDH為內參，采用2—ΔΔCt法計算miRNA-155和目的基因mRNA 的表達水平。PCR 引物序列及擴增產物長度見表1。

表1 PCR引物序列及擴增產物長度

2.7 裸鼠腫瘤組織中Wnt7、β-catenin、TCF-4蛋白表達水平的檢測

采用Western blot 法進行檢測。取各組裸鼠腫瘤組織各20 mg，剪碎，加入250 μL RIPA 裂解液，并加入適量的PMSF 蛋白酶抑制劑，反復吹打裂解，置于冰上2 h后以12 000 r/min 離心10 min；取上清液加入適量蛋白上樣緩沖液，沸水加熱5 min 變性，采用BCA 試劑盒定量后，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜；以4%脫脂奶粉封閉2 h，加入Wnt（稀釋度為1∶1 000）、β-catenin（稀釋度為1∶1 000）、TCF-4（稀釋度為1∶2 000）、GAPDH（稀釋度為1∶1 000）一抗，于4 ℃孵育過夜；以1%TBST洗膜，加入相應二抗室溫孵育2 h；以1% TBST洗膜后加入適量ECL顯色液顯影，采用凝膠成像儀曝光成像，并用Image J軟件分析圖像，以目的蛋白與內參的灰度值比值表示其表達水平。

2.8 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 21.0 軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料采用-±s表示。方差齊性時組間比較采用方差分析，不符合正態(tài)分布的采用秩和檢驗。檢驗水準α＝0.05。

3 結果

3.1 miRNA-155穩(wěn)定過表達AGS細胞株的構建情況

熒光顯微鏡下觀察細胞熒光及細胞狀態(tài)發(fā)現(xiàn)，在嘌呤霉素篩選后，細胞初期死亡較多，熒光較弱；隨著時間延長，細胞狀態(tài)好轉，熒光增強且能穩(wěn)定傳代，說明miRNA-155 過表達AGS 細胞株構建成功。結果見圖1。

圖1 miRNA-155過表達AGS細胞株的構建過程

3.2 裸鼠腫瘤組織生長情況的觀察結果

與模型組比較，過表達組、對照組和清熱化濕方中、高劑量組裸鼠腫瘤組織質量均顯著降低（P＜0.05），腫瘤抑制率分別為90.23%、63.79%、27.01%、44.25%。結果見圖2、表2。

圖2 各組裸鼠腫瘤組織的觀察結果

表2 各組裸鼠腫瘤組織質量和抑制率的測定結果（n＝5）

3.3 裸鼠腫瘤組織病理形態(tài)學的觀察結果

模型組裸鼠腫瘤細胞排列緊實，核大且染色較深；與模型組相比，過表達組、對照組及清熱化濕方低、中、高劑量組裸鼠的腫瘤細胞均出現(xiàn)不同程度的排列疏松，核染色較淺，出現(xiàn)壞死灶。其中，過表達組裸鼠腫瘤組織的損傷程度最高，對照組次之；清熱化濕方低、中、高劑量組腫瘤組織的損傷程度表現(xiàn)出劑量依賴性。結果見圖3。

圖3 各組裸鼠腫瘤組織的病理變化觀察結果

3.4 清熱化濕方對裸鼠腫瘤組織中miRNA-155、Wnt7、β-catenin和TCF-4 mRNA表達的影響

與模型組比較，過表達組、對照組和清熱化濕方中、高劑量組裸鼠腫瘤組織中Wnt7、β-catenin、TCF-4 mRNA 表達水平均顯著降低（P＜0.05），miRNA-155 表達水平均顯著升高（P＜0.05）。結果見圖4。

圖4 各組裸鼠腫瘤組織中miRNA-155、Wnt7、β-catenin、TCF-4 mRNA表達水平的檢測結果（n＝5）

3.5 清熱化濕方對裸鼠腫瘤組織中Wnt7、β-catenin、TCF-4蛋白表達的影響

與模型組比較，過表達組、對照組和清熱化濕方高劑量組裸鼠腫瘤組織中Wnt7、β-catenin、TCF-4 蛋白表達水平，以及清熱化濕方中劑量組Wnt7 蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.05）。結果見圖5。

圖5 各組裸鼠腫瘤組織中Wnt7、β-catenin、TCF-4 蛋白的表達情況

4 討論

中醫(yī)理論認為，胃癌的形成是在脾胃虛寒的基礎上，飲食生冷，感受濕熱寒邪，日久郁積引起的氣血運行不暢；最常見的證型為脾氣虛證、肝胃不和證、痰濕證、熱毒證、血虛證、血瘀證等；治療原則一般以益氣補脾、活血化瘀、清熱解毒為主[4]。清熱化濕方為經典方“藿樸夏苓湯”加黃連、梔子化裁而成，可宣化表里之濕邪，對胃癌有一定的療效[11]。

miRNAs 是一種長度為19～25 個核苷酸的短鏈非編碼RNA[12]，已被證明參與了多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展[13]。一項研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-155是胃癌組織中下調程度最高的miRNAs之一，可能是胃癌的腫瘤抑制因子[14]，這一結果與本課題組前期的基因芯片分析結果一致[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，過表達的miRNA-155可顯著抑制胃癌荷瘤模型裸鼠腫瘤的生長，與上述研究結果一致。

Wnt/β-catenin 信號通路是一個關鍵的級聯(lián)反應，對許多生理過程至關重要，如細胞增殖和分化、干細胞更新、胚胎發(fā)生和組織穩(wěn)態(tài)[15]。既往研究也提示，Wnt信號通路的病理紊亂可能與胃癌進展有關[16]。其中，Wnt 家族蛋白成員中的Wnt7a蛋白在胃癌組織中高表達，且與患者惡性病理特征顯著相關[17]。β-catenin是Wnt信號通路的關鍵下游效應因子，當Wnt配體與其膜受體復合體結合時，β-catenin 穩(wěn)定并在細胞質中積累，然后與TCF一起進入細胞核，從而驅動多重增殖和凋亡相關基因的轉錄[18]。本研究證實清熱化濕方能夠上調miRNA-155表達，抑制Wnt/β-catenin 信號通路中Wnt7、β-catenin 和TCF-4的表達，從而抑制胃癌細胞的生長，進一步闡明了清熱化濕方防治胃癌的效用機制。

綜上所述，清熱化濕方可通過上調miRNA-155，抑制Wnt/β-catenin信號通路，進而抑制胃癌荷瘤模型裸鼠瘤體生長。但本研究只對miRNA-155進行過表達處理，未進行沉默，后續(xù)筆者將從正反兩方面研究清熱化濕方和miRNA-155之間的關系，積極闡明清熱化濕方治療胃癌的作用機制，為清熱化濕方在臨床中的應用提供更多、更可靠的循證依據(jù)。