推拿對(duì)膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎模型大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨白細(xì)胞介素-1β、白細(xì)胞介素-6、腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6、細(xì)胞核因子信使核糖核酸攜帶遺傳信息及蛋白的影響

羅 翱，余 敏*，杜曜宇，郭 嘯，喻溢楠

（1.重慶市北碚區(qū)中醫(yī)院，重慶 400700；2.重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，重慶 401331）

膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）是一種以關(guān)節(jié)周圍骨增生為主要表現(xiàn)的關(guān)節(jié)疾病，其特征是膝關(guān)節(jié)軟骨退行性變化導(dǎo)致軟骨丟失和破壞[1]。常伴有關(guān)節(jié)滑膜繼發(fā)性炎癥病變，又稱退行性關(guān)節(jié)炎、增殖性關(guān)節(jié)炎和老年性關(guān)節(jié)炎等，臨床表現(xiàn)為關(guān)節(jié)疼痛、絞殺、功能障礙[2-3]。目前，對(duì)于KOA 患者，臨床上主要采用藥物治療為主，非藥物治療為輔的治療原則[4]。然而，有研究顯示，西醫(yī)常規(guī)治療KOA 療效不佳，藥物副作用顯著，例如，廣泛使用非甾體抗炎藥和糖皮質(zhì)激素有許多副作用，影響患者的依從性，從而影響其實(shí)際療效[5]。因此，尋求一種經(jīng)濟(jì)、環(huán)保、適用范圍廣、易于操作、接受度高的非藥物治療方法對(duì)KOA 患者來說是非常緊迫的[6]?；诖耍緦?shí)驗(yàn)通過選擇12 周齡雄性美國斯?jié)娎鄹瘛ざ嗬祝⊿D）大鼠27 只，通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，分析推拿對(duì)膝骨性關(guān)節(jié)炎可能的生物學(xué)機(jī)制，現(xiàn)做出如下闡述。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇12 周齡雄性SD 大鼠27 只，體質(zhì)量400～450 g，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，采用隨機(jī)數(shù)字表法選取9 只作為正常對(duì)照組（n=9），余下18只II 型膠原酶誘導(dǎo)建立KOA 大鼠模型，再利用隨機(jī)數(shù)字表將其分為自然恢復(fù)組（n=9）和推拿手法治療組（n=9），正常對(duì)照組于造模前一天取標(biāo)本；自然恢復(fù)組正常喂養(yǎng)并于第1 次造模后4 周處死大鼠取標(biāo)本。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型的制備 將Ⅱ型膠原蛋白酶注入SD 大鼠膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)，1 周后鏡下觀察，關(guān)節(jié)組織有早期KOA 樣改變說明大鼠KOA 模型制備成功。實(shí)驗(yàn)選用美國Sigma 公司Ⅱ型膠原蛋白酶，用無菌生理鹽水將膠原蛋白酶粉末溶解配成濃度為0.02 mg/50 μL（≥25 CDU/50 μL）的溶液備用。實(shí)驗(yàn)步驟：①將大鼠稱重，用新鮮配置的質(zhì)量濃度為2%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉大鼠；②將雙側(cè)膝關(guān)節(jié)用碘伏消毒3 次；③用1 mL 注射器行右膝關(guān)節(jié)穿刺，回抽未見血液回流后將50 μL 配置好的膠原蛋白酶注入關(guān)節(jié)腔內(nèi)；④退針后予碘伏棉簽按壓擦洗傷口，并用敷帖覆蓋傷口，術(shù)后不給予其他特殊處理。

1.2.2 飼養(yǎng)環(huán)境 飼養(yǎng)室的消毒隔離工作是管理中重要的一環(huán)，必須引起高度重視，其是保持大鼠等級(jí)的關(guān)鍵。飼養(yǎng)員進(jìn)入飼養(yǎng)室前必須更衣，以肥皂水洗手并用清水沖洗干凈，戴上消毒過的口罩、帽子、手套后方可進(jìn)入；飼養(yǎng)室內(nèi)保持整潔，門窗、墻壁、地面、鼠盒、架子每天擦洗；每周二、周五用0.1%新潔爾滅或其他消毒劑消毒，隔周更換消毒劑品種，每月進(jìn)行1 次大消毒，用0.1%過氧乙酸噴霧消毒效果較好。

1.2.3 干預(yù)措施 ①2%戊比妥鈉（上海新亞藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字H31021725，規(guī)格：0.1 g）注射麻醉造模成功后待干預(yù)大鼠（40 mg/kg）。②肌群推拿法：將大鼠仰臥位，造模側(cè)腘窩部墊少量棉花使膝關(guān)節(jié)微屈，術(shù)者立于患側(cè)，針對(duì)大腿及小腿肌群采用推、揉、點(diǎn)等方法推揉相關(guān)肌肉群，強(qiáng)化肌肉力量。包括大鼠大腿的股四頭肌、股二頭肌、半腱肌、大收肌、縫降肌和小腿的腓腸肌、腓骨長肌、脛骨前肌等，施術(shù)約3 min；③肌腱、韌帶彈撥法：術(shù)者以大拇指指腹彈、撥、揉相關(guān)肌腱及韌帶：重點(diǎn)為②中所述肌群在膝關(guān)節(jié)附近的肌腱及膝關(guān)節(jié)兩側(cè)副韌帶、冠狀韌帶，時(shí)間約2 min。④揉髕法：術(shù)者以拇食二指按住髕骨，以較輕手法按揉髕骨1 min。⑤手指點(diǎn)穴法：點(diǎn)按大鼠梁丘、血海、陰陵泉、陽陵泉、委中、三陰交、足三里每穴各5 次。⑥關(guān)節(jié)牽引、旋轉(zhuǎn)法：將大鼠側(cè)臥，90°屈膝患肢，術(shù)者右手握緊大鼠小腿近踝端，左手抵住大鼠大腿遠(yuǎn)端近腘窩處，術(shù)者雙手相向用力牽引大鼠膝關(guān)節(jié)，并做順時(shí)針和逆時(shí)針小幅度旋搖膝關(guān)節(jié)，施術(shù)約1 min。⑦放松手法：術(shù)者在其膝關(guān)節(jié)周圍采用雙指疊擦法，以透熱為度，時(shí)長1 min，結(jié)束手法。1 次/d。

1.3 觀察指標(biāo)①比較造模4 周后3 組大鼠的IL-1β、IL-6、TRAF6、NF-κBp65 mRNA 相對(duì)表達(dá)量；②比較造模4 周后3 組大鼠的IL-1β、IL-6、TRAF6、NF-κBp65 蛋白表達(dá)水平。

表1 3 組大鼠的IL-1β、IL-6、TRAF6、NF-κBp65 mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

表1 3 組大鼠的IL-1β、IL-6、TRAF6、NF-κBp65 mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

IL-1β：白細(xì)胞介素-1β；IL-6：白細(xì)胞介素-6；TRAF6：腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6；NF-κBp65：細(xì)胞核因子；mRNA：信使核糖核酸攜帶遺傳信息。

?

表2 3 組大鼠的IL-1β、IL-6、TRAF6、NF-κBp65 蛋白的水平比較（pg/mL，±s）

表2 3 組大鼠的IL-1β、IL-6、TRAF6、NF-κBp65 蛋白的水平比較（pg/mL，±s）

IL-1β：白介素-1β；IL-6：白介素-6；TRAF6：腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6；NF-κBp65：細(xì)胞核因子。

?

IL-1β、IL-6、TRAF6 的檢測方法：開放大鼠左冠狀動(dòng)脈前降支，從右外靜脈通道采集2 mL 血液，3 000 r/min 速度離心10 min，使用雙抗體夾心法結(jié)合酶標(biāo)儀（上海閃譜生物科技公司，型號(hào)：SuPerMax 3100）對(duì)上述指標(biāo)的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行測定。

NF-κBp65 的檢測方法：將樣品在SDS-PAGE中進(jìn)行電泳分離，使用半干式電印記法將轉(zhuǎn)移凝膠上蛋白，使用5%脫脂乳進(jìn)行封閉90 min，再洗滌3 次，每次持續(xù)10～15 min，在一抗工作液中孵育90 min，通過ECL 顯色法，將β-actin蛋白作為內(nèi)參蛋白，使用Imagine-J 分析蛋白灰度比值，表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，其中計(jì)量資料用（±s）來表示，通過F值進(jìn)行驗(yàn)算，P＜0.05 代表差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3 組大鼠的I L-1 β、I L-6、T R A F 6、N FκBp65 mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較正常對(duì)照組大鼠的IL-1β、IL-6、TRAF6、NF-kBp65mRNA 相對(duì)表達(dá)量低于推拿手法治療組和自然恢復(fù)組（P＜0.05），推拿手法治療組的IL-1β、IL-6、TRAF6、NF-κBp65 相對(duì)表達(dá)量低于自然恢復(fù)組（P＜0.05），見表1。

2.23 組大鼠的IL-1β、IL-6、TRAF6、NF-κBp65 蛋白的水平比較正常對(duì)照組大鼠的IL-1β、IL-6、TRAF6、NF-kBp65 蛋白水平低于推拿手法治療組和自然恢復(fù)組（P＜0.05），推拿手法治療組的IL-1β、IL-6、TRAF6、NFκBp65 蛋白水平低于自然恢復(fù)組（P＜0.05），見表2。

3 討論

隨著臨床中對(duì)Toll 樣受體4（TLR4）的研究逐漸深入，KOA 患者組織中的TLR4 水平的變化情況受到廣泛關(guān)注。TLR4 屬于Toll 樣受體（TLRs）家族中的一員，其屬于Ⅰ型跨膜蛋白受體，被激活后，能夠引發(fā)較為強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，在天然免疫以及炎癥反應(yīng)中作用明顯[7]。當(dāng)TLR4 受到激活之后，其能夠經(jīng)過下游的髓樣分化因子（MyD88）依賴性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路使各種炎癥因子被激活[8]。MyD88被激活之后，TLR4 可以結(jié)合MyD88 Toll 結(jié)構(gòu)，形成串級(jí)聯(lián)反應(yīng)，然后和TRAF6 相結(jié)合，使IkB 激酶復(fù)合體被激活[9]。

TRAF6 和許多條滑膜組織的炎癥信號(hào)通路的活化具有密切聯(lián)系，其能夠?qū)ρ装Y因子的形成以及釋放產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用，和破骨細(xì)胞的分化、存活以及骨重吸收具有密切聯(lián)系，并與骨代謝過程、細(xì)胞凋亡進(jìn)程以及應(yīng)激反應(yīng)形成過程具有密切聯(lián)系[10]。本文發(fā)現(xiàn)：正常對(duì)照組的IL-1β、IL-6、TRAF6、NF-kBP65mRNA 及蛋白相對(duì)表達(dá)量均低于推拿手法治療組和自然恢復(fù)組（P＜0.05），推拿手法治療組的IL-1β、IL-6、TRAF6、NF-κBp65mRNA 及蛋白相對(duì)表達(dá)量均低于自然恢復(fù)組（P＜0.05），說明KOA 大鼠和正常大鼠相比，上述指標(biāo)mRNA 以及蛋白表達(dá)水平處于高表達(dá)狀態(tài)下，和膝骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生具有一定聯(lián)系。NF-kB 和炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)、腫瘤形成以及細(xì)胞凋亡具有密切關(guān)聯(lián)，從表1 以及表2 中可以發(fā)現(xiàn)，膝骨性關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜中的上述指標(biāo)水平均有所提升，說明該因子的水平和膝骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生具有一定關(guān)聯(lián)[11]，采用推拿治療，可將IL-1β、IL-6、TRAF6、NF-κBp65mRNA 以及蛋白水平改善，從而減輕炎性因子水平。

傳統(tǒng)中醫(yī)理論認(rèn)為，推拿是具有疏通經(jīng)絡(luò)、推行氣血、扶正祛邪、調(diào)和陰陽的一種治病防病的養(yǎng)生術(shù)。推拿在本質(zhì)上是屬于以“機(jī)械力”為特征，通過作用于局部產(chǎn)生生物力學(xué)效應(yīng)，改善局部組織細(xì)胞生化環(huán)境，調(diào)節(jié)循環(huán)、神經(jīng)及內(nèi)分泌等系統(tǒng)狀態(tài)的一種物理方法，本文研究結(jié)果證明了其效果。

綜上所述，推拿可將膝骨性關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜組織的IL-1β、IL-6、TRAF6、NF-κBp65 mRNA 以及蛋白水平表達(dá)量明顯改善，發(fā)揮消炎止痛效果，從而預(yù)防膝骨性關(guān)節(jié)炎，值得臨床參考。