樺褐孔菌菌絲體多糖提取工藝優(yōu)化及其降血糖能力測定

陳盛宇，張淑梅，王玉霞，田緣，馬俊秀，胡基華，潘鈺，韓增華

（黑龍江省科學院微生物研究所，黑龍江哈爾濱 150010）

樺褐孔菌（Inonotus obliquus）又稱樺樹茸、樺樹菇等，主要分布于北半球的寒帶地區(qū)，是一種的食藥用菌。樺褐孔菌富含多糖和三萜類等活性成分，大量研究表明，樺褐孔菌多糖具有抗氧化[1]、降血糖[2]、抗炎[3]、抗疲勞[4]和抗癌[5]等功效。但是野生樺褐孔菌資源日益稀少，難以滿足現(xiàn)階段的研究和開發(fā)。有文獻表明，樺褐孔菌發(fā)酵菌絲體多糖的含量和生物活性可媲美野生樺褐孔菌[6-7]。

樺褐孔菌多糖的提取方式有溶液浸提法[8]、微波輔助提取法[9]、超聲波輔助提取法[10]、高壓脈沖輔助提取法[11]、閃式提取法[12]和酶提取法[13]等，微波輔助提取法、超聲波輔助提取法、高壓脈沖輔助提取法、閃式提取法和酶提取法等方法存在設備要求高、成本高、難以規(guī)?；崛〉葐栴}[14]，酸提取和堿提取會對多糖結構造成不可逆的影響，熱水浸提法具有操作簡單且安全、成本低、無污染、條件溫和等優(yōu)勢，可進行大規(guī)模提取，適用于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。目前，對于樺褐孔菌的研究主要集中在野生資源活性成分的提取和作用功效以及液體發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化等方面[15-18]，而對提取工藝和活性研究的相關報道較少。Ⅱ型糖尿病主要癥狀為高血糖，是小腸黏膜細胞的α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶催化碳水化合物水解為易吸收的單糖所引起的[19]，市面上的降糖藥物主要通過競爭性抑制α-葡萄糖苷酶或α-淀粉酶的活性達到降血糖的目的，但長期服用可引起不良副作用，如胃腸道不適、乳酸酸中毒、腿部或腳踝腫脹等毒副作用[20-21]。本研究采用熱水浸提法提取樺褐孔菌菌絲體多糖，對其提取工藝進行優(yōu)化，并對體外降血糖活性進行評價，旨在為樺褐孔菌菌絲體多糖的深入研究和綜合開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樺褐孔菌發(fā)酵菌絲體（干品）：黑龍江省科學院微生物研究所藥物中心。

4-硝基苯基-β-D-吡喃葡糖糖苷（4-nitrophenyl β-D-glucopyranoside，PNPG）（純度為99%）、α-淀粉酶（14 U/mg）、阿卡波糖：上海源葉生物科技有限公司；α-葡萄糖苷酶（≥10 U/mg）：美國Sigma 公司；重蒸酚、3，5-二硝基水楊酸（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）、可溶性淀粉：北京索萊寶科技有限公司；濃硫酸：天津市科密歐化學試劑有限公司；以上試劑均為分析純。

1.2 主要儀器設備

高速冷凍離心機（3K15）：德國Sigma 公司；恒溫水浴鍋（PURA）：優(yōu)萊博技術有限公司；酶標儀（INFINITE 200 PRO）：瑞士帝肯公司；冷凍干燥機（FDU-200）：東京理化器械株式會社；電熱恒溫鼓風干燥箱（DHG-9245）：蘇州江東精密儀器有限公司；旋轉蒸發(fā)器（RE-52）：上海亞榮生化儀器廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 多糖提取

樺褐孔菌發(fā)酵菌絲體干燥后粉碎，過120 目標準篩，精確稱取適量樣品，按一定液料比加入蒸餾水，置于水浴鍋中加熱提取，然后10 000 r/min 離心10 min，沉淀加入蒸餾水重復提取，合并后濃縮提取液，加入4倍體積的95%乙醇，4 ℃靜置12 h，10 000 r/min 離心10 min，收集沉淀，無水乙醇清洗3 次，冷凍干燥即得樺褐孔菌菌絲體粗多糖。

1.3.2 多糖提取率測定

總多糖采用苯酚-硫酸法[22]測定，繪制葡萄糖標準曲線，曲線方程為y=10.448x+0.069 2，相關系數(shù)R2=0.994 8。還原糖測定采用DNS 法[23]，標準曲線為y=0.729 6x+0.031 9，相關系數(shù)R2=0.997 7。精確稱取干燥和過篩后菌絲體粉末1.000 g，采用1.3.1 的方法提取多糖，粗多糖樣品用50 mL 容量瓶定容，分別測定總多糖和還原糖含量，以公式（1）計算多糖提取率（W，%）。

式中：C1為回歸方程計算出的稀釋后總多糖濃度，mg/mL；C2為回歸方程計算出的稀釋后還原糖濃度，mg/mL；N為稀釋倍數(shù)；V為粗多糖樣品復溶后體積，mL；W為樺褐孔菌菌絲體多糖提取率，%；M為稱量原料的質量，g。

1.3.3 單因素試驗

1.3.3.1 提取次數(shù)對多糖提取率的影響

稱取1.000 g 菌絲體粉末，固定試驗條件為80 ℃、液料比40 ∶1（mL/g），提取時間2 h，考察提取次數(shù)（1、2、3、4）對多糖提取率的影響，每個處理3 次重復。

1.3.3.2 提取溫度對多糖提取率的影響

稱取1.000 g 菌絲體粉末，固定液料比40 ∶1（mL/g）加入蒸餾水，提取時間2 h，提取3 次，考察不同提取溫度（60、70、80、90、100 ℃）對多糖提取率的影響，每個處理3 次重復。

1.3.3.3 液料比對多糖提取率的影響

稱取1.000 g 菌絲體粉末，按上述試驗確定的最佳提取溫度，固定提取時間2 h，提取3 次，考察不同液料比[20 ∶1、30 ∶1、40 ∶1、50 ∶1、60 ∶1（mL/g）]對多糖提取率的影響，每個處理重復3 次。

1.3.3.4 提取時間對多糖提取率的影響

稱取1.000 g 菌絲體粉末，按上述試驗確定的最佳提取溫度和液料比，考察不同提取時間（1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h）對多糖提取率的影響，每個處理重復3 次。

1.3.4 響應面優(yōu)化

在單因素的基礎上，提取溫度、液料比和提取時間作為考察的因素，利用Design-Expert V12.0.1 軟件進行三因素三水平Box-Behnken 試驗設計，優(yōu)化樺褐孔菌菌絲體多糖的提取工藝。試驗因素與水平見表1。

表1 響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface tests

1.3.5 酶活性試驗

1.3.5.1 多糖對α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響

參照Ren 等[24]的方法，略作修改。多糖、阿卡波糖、α-葡萄糖苷酶和PNPG 溶液均用0.1 mol/L，pH6.8的磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS）配制，優(yōu)化條件下提取的多糖濃度為1、2、4、6、8、10 mg/mL，以阿卡波糖作為陽性對照。取40 μL 的樣品，加入到96 孔板中，然后加入40 μL 1 U/mL 的α-葡萄糖苷酶液混勻，于37 ℃水浴15 min，再加入20 μL的7.5 mmol/L PNPG 溶液37 ℃水浴30 min，最后加入100 μL 0.2 mol/L Na2CO3溶液結束反應，于405 nm 波長測OD 值（A0），每組3 個平行。樣品對照組中，以40 μL的PBS 代替樣品組酶液測其OD 值（A1）；在空白組中，以40 μL 的PBS 代替樣品溶液測其OD 值（A2），按照公式（2）計算α-葡萄糖苷酶抑制率（Y1，%）。

2012年，勝利油田“四化”工作開始標準化采購，并于2014年在全油田推開。實施標準化采購以來，油田物資采購模式發(fā)生積極轉變，不僅質量管控更有效，采購流程更順暢，而且采購資金降幅也更大，為油田降低成本4億多元。油田物資標準化采購比例大幅提高，物資采購實現(xiàn)了從“傳統(tǒng)采購”到“定制采購”變革。

1.3.5.2 多糖對α-淀粉酶抑制活性的影響

參照湯陳鵬等[25]、王鑫等[26]的方法，略作修改。多糖、阿卡波糖、α-淀粉酶和淀粉溶液均用0.1 mol/L，pH6.8 的PBS 配制，優(yōu)化條件下提取的多糖濃度為1、2、4、6、8、10 mg/mL，以阿卡波糖作為陽性對照。向各試管中分別加入300 μL 不同質量濃度的多糖和阿卡波糖溶液及300 μL 1 U/mL 的α-淀粉酶溶液，混合均勻，于37 ℃下水浴15 min，再分別加入300 μL 質量分數(shù)1%的淀粉溶液水浴15 min，最后加入500 μL DNS 試劑顯色，并立即沸水浴10 min 終止反應；加入10 mL蒸餾水稀釋并混勻，于540 nm 波長處測定其吸光度A0。以等體積PBS 代替α-淀粉酶溶液，測定其吸光度A1；以等體積PBS 代替樣品溶液，測定其吸光度A2，按公式（3）計算α-淀粉酶抑制率（Y2，%）。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗重復3 次，數(shù)據(jù)采用平均值±標準差表示，通過SPSS 17 進行統(tǒng)計分析，用Origin 22 進行繪圖，Design-Expert V12.0.1 進行響應面設計，Graphpad prism 8.0.1 進行半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）的計算。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗分析

各單因素對多糖提取率的影響見圖1～圖4。

圖1 提取次數(shù)對多糖提取率的影響Fig.1 Effect of extraction times on the yield of polysaccharides

圖2 提取溫度對多糖提取率的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on the yield of polysaccharides

圖3 液料比對多糖提取率的影響Fig.3 Effect of liquid-to-solid ratio on the yield of polysaccharides

圖4 提取時間對多糖提取率的影響Fig.4 Effect of extraction time on the yield of polysaccharides

由圖1 可知，提取次數(shù)達到第3 次時，多糖提取率為（6.70±0.43）%，多糖提取率增長趨于平緩，考慮到耗時和耗能問題，后續(xù)試驗提取次數(shù)固定為3 次。

由圖2 可知，提取溫度在60～90 ℃時，多糖提取率與提取溫度呈正相關關系。提取溫度為90 ℃時，多糖提取率達到最大值，為（7.43±0.03）%，繼續(xù)升高提取溫度后多糖提取率略有下降，原因是高溫對多糖分子結構具有降解作用，導致多糖含量減少，或高溫溶解了其他水溶性物質，提高溶液的黏稠度從而阻礙多糖的溶出[27]。

由圖3 可知，液料比為20 ∶1～50 ∶1（mL/g）時，多糖提取率與溶劑的加入量呈正相關關系，在50 ∶1（mL/g）時達到峰值，多糖提取率為（7.93±0.26）%。當提取溶劑較少時，多糖無法充分溶解，造成提取率較低。當溶劑增多時，加快了多糖的擴散速度，多糖不斷從細胞溶出。達到峰值后再增加溶劑，導致濃縮時間延長，增加了多糖降解幾率[28]。

2.2 響應面優(yōu)化試驗結果

響應面試驗設計及結果表2，回歸模型方差分析見表3。

表2 響應面試驗設計及結果Table 2 Design and results of response surface test

續(xù)表2 響應面試驗設計及結果Continue table 2 Design and results of response surface test

根據(jù)Design-Expert V12.0.1 軟件設計響應面優(yōu)化試驗，進行響應面二次回歸擬合分析，得到回歸方程：多糖提取率=8.08+0.50A+0.076B-0.24C+0.042AB-0.13AC+0.23BC-0.53A2-0.33B2-0.99C2。

由表3 可知，模型P<0.000 1，說明具有顯著性；失擬項的P值是0.117 8>0.05，即不顯著；線性相關系數(shù)R2＝0.994 4，表明該模型與實際試驗情況擬合度較好；調整決定系數(shù)R2＝0.987 3 與預測決定系數(shù)R2=0.932 1的差值不大于0.2，信噪比為32.579，表明回歸模型合理，具有較高的可信度和準確度，可用于樺褐孔菌菌絲體多糖提取率的預測和分析。由表3 可知，A和C影響極顯著（P＜0.01），B影響差異顯著（P＜0.05）；A2，B2，C2對多糖的提取率的影響均極顯著（P＜0.01）；AC影響顯著（P＜0.05），BC影響極顯著（P＜0.01），AB不顯著；通過F值可知，各因素對提取率的影響順序為A（提取溫度）>C（提取時間）>B（液料比）。

表3 回歸模型方差分析Table 3 ANOVA of the regression model

各因素交互作用的響應面見圖5 和圖6。

圖5 提取時間與提取溫度之間交互作用對多糖提取率的影響Fig.5 Effect of interaction between extraction time and extraction temperature on the yield of polysaccharides

圖6 提取時間與液料比之間交互作用對多糖提取率的影響Fig.6 Effect of interaction between extraction time and liquid-to-solid ratio on the yield of polysaccharides

在各因素交互作用的3D 曲面和等高線中，曲面圖的陡峭程度、等高線的線橢圓分布致密程度與顯著性成正相關關系[31]。由圖5 可知，提取溫度與提取時間的曲面圖陡峭，坡度大，等高線呈現(xiàn)明顯的橢圓形，說明對多糖的提取率的影響較大。由圖6 可知，液料比與提取時間的曲面圖最陡峭，坡度大，等高線呈現(xiàn)明顯的橢圓形，說明對多糖的提取率的影響較大。

通過Design-Expert V12.0.1 軟件分析可知，提取工藝的最佳條件為提取溫度97.599 ℃、液料比51.439 ∶1（mL/g）、提取時間1.903 h，提取3 次，在此條件下提取率為8.188%。結合實際情況，選擇提取溫度97 ℃、液料比51 ∶1（mL/g）、提取時間1.9 h、提取3 次，進行3 次平行試驗，最終得到多糖提取率為（8.02±0.45）%，與預測值僅相差0.168%，說明響應面得到的結論可信度和準確度較高。

2.3 多糖對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響

α-淀粉酶和α-葡萄糖酶抑制劑通過抑制糖原、淀粉等物質形成葡萄糖的過程，從而降低餐后血糖水平[32]，這兩種酶是調節(jié)血液中葡萄糖含量的關鍵因子，

因而受到了廣泛的關注。阿卡波糖作為典型的α-葡萄糖抑制劑，本試驗以阿卡波糖作為陽性對照。

樺褐孔菌菌絲體多糖對α-葡萄糖苷酶活性和α-淀粉酶的抑制作用分別見圖7 和圖8。

圖7 樺褐孔菌菌絲體多糖對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用Fig.7 Inhibitory effect of extracted polysaccharides on αglucosidase activity by polysaccharides from mycelia of Inonotus obliquus

圖8 樺褐孔菌菌絲體多糖對α-淀粉酶活性的抑制作用Fig.8 Inhibitory effect of extracted polysaccharides on αamylase activity by polysaccharides from mycelia of Inonotus obliquus

由圖7 和圖8 可知，熱水浸提法在最優(yōu)條件下提取到的樺褐孔菌菌絲體多糖對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的活性均具有抑制作用，多糖濃度與抑制率呈正相關，即劑量依賴性，說明樺褐孔菌菌絲體多糖具有降血糖活性。相比于α-淀粉酶，α-葡萄糖苷酶的抑制作用更為明顯。在多糖濃度10 mg/mL 時，α-葡萄糖苷酶抑制率為（77.64±1.78）%，而此時α-淀粉酶為（39.20±1.17）%。α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的半抑制濃度IC50值分別為17.20、3.07 mg/mL，對應的阿卡波糖的IC50值為0.011 26、0.001 023 mg/mL，與阿卡波糖相比，抑制效果存在一定差距。

3 討論

通過人工栽培馴化獲取樺褐孔菌子實體，目前技術尚未成熟，液體發(fā)酵是目前獲取菌絲體的有效途徑之一，具有周期短、可控和成本低等優(yōu)勢，靈芝等珍稀真菌的液體發(fā)酵研究已相當成熟[33]，而樺褐孔菌液體發(fā)酵研究起步較晚、發(fā)展較慢。響應面法是一種有效獲取最佳工藝參數(shù)的統(tǒng)計學方法，是目前獲取真菌多糖最佳提取工藝的重要手段。本試驗樺褐孔菌菌絲體多糖提取率的研究結果，與於雨碟等[34]、紀欣童等[35]、張瑞等[23]的研究結果存在一定的差異，可能是試驗材料、條件和方法等因素的差異性所引起的。本試驗通過熱水浸提法提取樺褐孔菌菌絲體多糖，并對其提取工藝進行了優(yōu)化。通過F值分析可知，提取溫度對多糖提取率的影響最顯著，其次是提取時間，最后是液料比，這與朱杰等[36]、楊娟等[37]、郝金斌等[29]提取其他多糖影響因素的大小相似，說明提取過程中，提取溫度的控制尤為關鍵，在提高提取率的同時也要避免多糖的降解。體外酶活性試驗表明，樺褐孔菌菌絲體多糖在1～10 mg/mL 濃度范圍內對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶均有抑制作用，呈劑量依賴性關系。樺褐孔菌菌絲體多糖作為一種具有潛力的降血糖資源，后續(xù)可進一步對其作用機制和功效作用進行深入研究，本研究為樺褐孔菌菌絲體多糖在食品、藥品等領域的綜合開發(fā)利用提供一定的理論參考。

4 結論

采用熱水浸提法提取樺褐孔菌菌絲體多糖，以單因素試驗篩選和響應面設計相結合對提取工藝進行優(yōu)化，結果表明最佳提取條件為提取溫度97 ℃、液料比51 ∶1（mL/g）、提取時間1.9 h、提取3 次，在此條件下提取率為（8.02±0.45）%。樺褐孔菌菌絲體多糖對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶具有良好的抑制作用，IC50值分別為17.20、3.07 mg/mL，初步判斷樺褐孔菌菌絲體多糖具有體外降血糖活性，為今后樺褐孔菌菌絲體多糖在食藥領域的深入研究和綜合開發(fā)提供參考。