糜子PmNAC1 的克隆及生物信息學(xué)分析

辛旭霞 ，鄭香然 ，王海崗 ，陳 凌 ，Santra Dipak K ，王瑞云 ，，喬治軍

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)基因資源研究中心/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部黃土高原作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室/雜糧種質(zhì)資源發(fā)掘與遺傳改良山西省重點實驗室，山西 太原 030031；3.內(nèi)布拉斯加大學(xué) 林肯分校農(nóng)藝系小宗糧豆研究與推廣中心，美國 內(nèi)布拉斯加州 69361）

糜子（Panicum miliaceumL.）又稱黍稷，屬于禾本科黍?qū)?，是古老的粟類作物，其遺傳變異豐富[1]，谷粒富含抗性淀粉，可降低血糖和血脂，是保持腸道健康的功能食品[2]。此外，糜子具有獨特的營養(yǎng)價值，是一種保健的好食品，其在禾谷類作物中的堿性蛋白質(zhì)含量較高，并且還含有豐富的容易吸收的維生素、微量元素、氨基酸等[3]。與其他作物相比，糜子是一種抗旱性極強的1 年生草本作物，具有耐鹽堿、耐瘠，以及生育周期較短等特點[4-5]。干旱是主要的非生物脅迫之一，嚴(yán)重影響植物的生長發(fā)育、產(chǎn)量、品質(zhì)及種植范圍，進(jìn)而影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)[6]。王綸等[7]研究表明，黍稷資源的抗旱性在每個個體中都表現(xiàn)出比較大的差異[8]。

糜子起源于我國黃河流域黃土高原地區(qū)，山西的種質(zhì)資源數(shù)量占全國第一[9]，是我國最早的農(nóng)作物，大約在8 000 a 前開始在我國種植[10]，3 000 a 前左右流傳到歐洲和世界各地，被廣泛種植于歐亞大陸，全球種植糜子的栽培面積有550 萬～600 萬hm2。我國糜子的種植區(qū)域非常廣泛，幾乎各個省市均有種植，但是主要產(chǎn)區(qū)集中于我國北方地區(qū)，平均每年種植面積多達(dá)50 萬～60 萬hm2[11]。在禾谷類作物中，粟類作物是除水稻、小麥、玉米、大麥、高粱外的第六大作物，養(yǎng)育著全世界1/3 以上的人口[12]。盡管我國糜子的栽培歷史悠久，但是和水稻、玉米、小麥等相比種植面積較少，因此，其關(guān)注程度較低。糜子是我國北方旱區(qū)主要制米作物之一，主要分布在我國西北、華北、東北干旱、半干旱地區(qū)[13]，也是干旱和半干旱地區(qū)主要的糧食作物之一[14]，在遭受嚴(yán)重的干旱后遇水能夠快速生長[15]，植物表皮蠟質(zhì)可以通過減少植物表皮水分的散失，從而對植物起到保水抗旱的作用[16]，是理想的復(fù)種作物，因此，糜子尤其適宜在較為干旱的地方種植。不僅給我國干旱半干旱地區(qū)的廣大人們帶來了食物支撐，而且成為該地區(qū)最主要的救災(zāi)備荒作物[17]，在我國的國民經(jīng)濟中占據(jù)重要地位。

在陸生植物所具有的轉(zhuǎn)錄因子中，NAC 轉(zhuǎn)錄因子所占的比例是最大的，其名稱是由擬南芥ATAF1/2基因、矮牽牛（Petunia hybridaVilm.）NAM基因以及CUC1/2基因的縮寫字母組成[18-19]，NAC 轉(zhuǎn)錄因子包括ATAF、NAM、CUC 等3 個家族[20]，而本試驗所研究的基因正是屬于NAM 家族的基因。NAC 結(jié)構(gòu)域是指具有一個和NAM 蛋白高度同源的NAC 蛋白N 端的高度保守氨基酸序列，NAC 結(jié)構(gòu)域最初的特征在于來自NAM、ATAF1/2 和CUC2 的共有序列。NAC 蛋白含有結(jié)合DNA 的NAC 結(jié)構(gòu)域，其大約150 個氨基酸位于蛋白質(zhì)的N 末端，形成了5 個亞結(jié)構(gòu)區(qū)域[21]，其中，A、C、D 3 個亞結(jié)構(gòu)域是非常保守的[22]，它具有與蛋白質(zhì)或DNA 結(jié)合的作用，亞結(jié)構(gòu)域A 可能與NAC 蛋白形成二聚體，亞結(jié)構(gòu)域B、E 變化多樣，會賦予NAC基因不同的功能。NAC 家族的蛋白序列通常包含大約400 個氨基酸，包括典型和非典型2 種不同結(jié)構(gòu)[23]，NAC 轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控植物生長發(fā)育、相關(guān)目的基因的表達(dá)、響應(yīng)非生物脅迫及激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，包括次生壁合成[24]、葉片衰老[25]、細(xì)胞擴增[26]等多種植物生命活動過程，對增強植株的抗逆性發(fā)揮著重要作用。許多NAC 蛋白具有類似的二聚體結(jié)合位點，因此，大部分的NAC 蛋白均以同源二聚體的形式發(fā)揮作用[27]。目前，人們對水稻、玉米、小麥等作物中的NAC 轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行了大量研究。NURUZZAMAN 等[28]的研究證實了TRR基序?qū)τ谀硞€特殊的NAC 亞家族來說是比較保守的，結(jié)果在不同亞家族間存在差異。KUSANO等[29]在水稻中分離得到了1 個NAC 轉(zhuǎn)錄因子，屬于NAM 亞組。HU 等[30]克隆了水稻抗旱基因SNACI，促進(jìn)了水稻逆境條件下的基因表達(dá)。邵歡歡[31]通過PEG 模擬干旱脅迫從256 份材料鑒定出40 份糜子芽期強抗旱材料和10 份苗期強抗旱材料，并利用二代重測序技術(shù)對糜子芽期和苗期抗旱性基因進(jìn)行GWAS 分析，注釋到糜子染色體13 和染色體16 上有2 個NAC 蛋白結(jié)構(gòu)域。

通過結(jié)合前期轉(zhuǎn)錄測序[14]和邵歡歡[31]的研究結(jié)果對糜子基因組染色體16 上注釋的NAC基因進(jìn)行克隆，包括糜子基因組DNA 的提取、引物設(shè)計及純化產(chǎn)物測序等過程；將對檢測得到的序列進(jìn)行生物信息學(xué)研究分析，通過預(yù)測該蛋白的保守結(jié)構(gòu)域及二、三級結(jié)構(gòu)等，探討在非生物脅迫下，糜子中NAC 轉(zhuǎn)錄因子的反應(yīng)。本試驗通過克隆糜子PmNAC基因及生物信息學(xué)分析，以期為糜子抗逆分子育種提供候選基因資源和理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

本試驗所選材料由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所資源中心谷子高粱糜子課題組提供，分別為晉黍9 號（00009143）、鴨爪白（00000832）、大白黍（00006586）、紫稈大糜（00001178）、硬地黃（00001284）、黃糜子（00003199）、太原1084（00006539）。

克隆載體及菌株的選擇：pMDTM19-T Vector，購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司（TaKaRa）；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞（E.coli DH5α Competent Cells），購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物設(shè)計 根據(jù)已發(fā)布的NCBI 糜子基因組（登錄號：GCA 003046395.2）染色體16 上注釋的NAC基因序列為模板，PCR 反應(yīng)程序為：2×Taq PCR MasterMix 10 μL，CBR-KF 0.8 μL，CBR-KR 0.8 μL，糜子gDNA 1 μL，ddH2O 7.4 μL。將擴增后的產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳（緩沖液為TBE）檢測后，使用DiaSpin DNA Gel Extraction Kit 試劑盒膠回收純化。

試驗所用上游引物序列（NAC-S）：5'-CTAGC CCATCCACCCCTGCG-3'；下游引物序列（NACX）：5'-ATGTATAGGTTAGCATGGCTTCTGT TAAAGGTACC-3'。

PCR 反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性40 s，65.8 ℃退火40 s，72 ℃延伸2 min，34 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃ 30 min。

1.2.2 T-A 克隆 將PCR 純化產(chǎn)物通過連接克隆載體pMD19-T 進(jìn)行T 載體連接轉(zhuǎn)化（連接體系見TaKaRa pMDTM19-T Vector 說明書）至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)單菌落，送至上海生工生物工程有限公司，利用菌落PCR（通用引物M13）提取陽性克隆的質(zhì)粒測序，檢查該序列是否為目標(biāo)序列。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 使用Primer premier 5.0軟件進(jìn)行設(shè)計引物擴增全長序列，將引物交到上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行合成，進(jìn)行PCR擴增獲得目的片段，同時，用生物信息學(xué)分析所測序的正確序列。利用NetNGlyc 1.0 軟件預(yù)測編碼蛋白的糖基化位點；使用NetPhos 3.1 軟件預(yù)測編碼蛋白的磷酸化位點；使用SMART（https://services.healthtech.dtu.dk/）在線軟件對蛋白跨膜區(qū)域進(jìn)行預(yù)測；用ProtScale 程序?qū)Φ鞍走M(jìn)行疏水性分析；使用SignalP-5.0 識別蛋白的信號肽；利用PSIPRED 在線工具（http://bioinfadmin.cs.ucl.ac.uk/downloads/psipred/old_versions/psipred3.5. tar.gz）對蛋白的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測；利用在線程序SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/）對PmNAC1基因編碼蛋白進(jìn)行3D 結(jié)構(gòu)模擬；使用MEGA 7.0 及GeneDoc 在線軟件（https://www.omicsclass.com/article/502）進(jìn)行氨基酸序列多重比對及系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建；利用DNAMAN 6.0 軟件對測序基因序列進(jìn)行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 糜子NAC1 目的基因的獲得

對糜子DNA 進(jìn)行提取，以該DNA 為模板克隆糜子NAC基因，經(jīng)過PCR 擴增序列全長為1 634 bp，結(jié)果如圖1 所示。膠回收純化后將目的片段與pMD19-T 載體連接，連接產(chǎn)物導(dǎo)入到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，將菌液送至上海生工生物工程有限公司利用菌落PCR（通用引物M13）提取陽性克隆的質(zhì)粒測序，將測序結(jié)果通過DNAMAN 進(jìn)行序列對比，結(jié)果與CM009705.2 上注釋序列一致（圖2）。由圖3 可知，基因編碼423 個氨基酸。

圖1 NAC-S/NAC-X 擴增產(chǎn)物電泳分析Fig.1 Electrophortic pattern analysis of NAC-S/NAC-X amplification products

圖2 DNAMAN 序列比對結(jié)果Fig.2 DNAMAN sequence alignment results

2.2 生物信息學(xué)分析

2.2.1 PmNAC1 蛋白的理化性質(zhì) 利用Protparam 分析基因編碼蛋白理化性質(zhì)，PmNAC1基因編碼蛋白的分子式為C703H1034N182O214S11，原子總數(shù)為2 144 個，帶負(fù)電殘基總數(shù)為18 個，帶正電殘基總數(shù)為7 個。NAC 蛋白包括的氨基酸有Ala（9.5%）、Arg（2.7%）、Asn（2.0%）、Asp（8.8%）、Cys（1.4%）、Gln（6.1%）、Glu（3.4%）、Gly（13.6%）、His（1.4%）、Ile（0.7%）、Leu（6.1%）、Lys（2.0%）、Met（6.1%）、Phe（6.1%）、Pro（7.5%）、Ser（6.8%）、Thr（2.0%）、Trp（2.7%）、Tyr（3.4%）和Val（7.5%）。PmNAC1 蛋白與NAM 蛋白家族類似（圖4）。使用Prot Scale 程序?qū)Φ鞍走M(jìn)行疏水性分析，結(jié)果顯示（圖5），氨基酸Score 值在第150 位最低（-3.267），在第107 位最高（1.644），平均疏水性為-0.811 5，屬于親水蛋白。保守位點73～211 號，有一個前肽裂解位點153 號，并且有精氨酸和亮氨酸的核輸出信號（圖6）。

圖4 PmNAC1 蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測Fig.4 Protein domain prediction of PmNAC1 protein

圖5 PmNAC1 蛋白序列的親疏水性預(yù)測Fig.5 Prediction of hydrophilicity and hydrophobicity of PmNAC1 protein

圖6 PmNAC1 蛋白序列的核輸出位點Fig.6 Nuclear export sites of PmNAC1 protein

2.2.2 PmNAC1 蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)、信號肽和二、三級結(jié)構(gòu) 采用TMHMM 2.0 預(yù)測糜子NAC 蛋白，結(jié)果如圖7 所示。

圖7 PmNAC1 蛋白序列的跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測Fig.7 Transmembrane domain prediction of PmNAC1 protein sequence

由圖7 可知，NAC 蛋白不存在跨膜結(jié)構(gòu)域。利用SignalP-5.0 識別到該蛋白不具有信號肽序列（圖8），該蛋白可能并非分泌蛋白。利用SOPMA預(yù)測蛋白的二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示（圖9），在二級結(jié)構(gòu)中氨基酸主要由8 個α-螺旋、14 個β-折疊、延伸鏈和無規(guī)則卷曲組成，其中，β-折疊占比為15.19%，含量最高，α-螺旋占比為0.03%。利用在線程序SWISS-MODEL 對PmNAC1基因編碼蛋白進(jìn)行3D 結(jié)構(gòu)模擬，以水稻NAC 催化結(jié)構(gòu)域的晶體結(jié)構(gòu)（SMTL ID：3ulx.1 序列號）為模板預(yù)測PmNAC1 3D 結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)該蛋白包括8 個α-螺旋和14 個β-折疊（圖10）。

圖8 PmNAC1 蛋白序列的信號肽預(yù)測Fig.8 Signal peptide prediction of PmNAC1 protein sequence

圖9 預(yù)測PmNAC1 蛋白二級結(jié)構(gòu)Fig.9 Prediction of the secondary structure of PmNAC1 protein

2.2.3PmNAC1編碼蛋白的糖基化位點和磷酸化位點 使用NetNGlyc 1.0 在線軟件，預(yù)測編碼蛋白的糖基化位點，超出水平線0.5 的有糖基化位點（圖11）。通過NetPhos 3.1 在線軟件對編碼蛋白激酶進(jìn)行磷酸化位點預(yù)測，從圖12 可以看出，蛋白磷酸化位點共計59 個，包含絲氨酸（S）31 個、蘇氨酸（T）22 個、酪氨酸（Y）6 個。參考蛋白激酶的分級標(biāo)準(zhǔn)，特異性激酶包括屬于ACG 組依賴環(huán)腺苷酸（cAMP）的蛋白激酶PKA、依賴磷脂的蛋白激酶PKC、依賴環(huán)鳥甘酸（cGMP）的蛋白酶PKG 和鈣以及近親激酶PKB，屬于傳統(tǒng)PTK 組的EGFR，屬于CMGG 組的作用于下游的磷酸化級聯(lián)系統(tǒng)以及其他的植物蛋白激酶。

圖11 NAC 蛋白糖基化位點預(yù)測Fig.11 Prediction of glycosylation sites of NAC protein

圖12 NAC 蛋白磷酸化位點預(yù)測Fig.12 Prediction of phosphorylation sites of NAC protein

2.2.4 PmNAC1 蛋白序列系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建 將研究克隆所得到的PmNAC1編碼蛋白序列進(jìn)行序列對比，從NCBI 上下載玉米（Zea mays）、高粱（Sorghum bicolor）、小麥（Triticum aestivum）等與Pm-NAC1編碼蛋白序列相似性較高的NAC 轉(zhuǎn)錄因子氨基酸序列，通過MEGA 7.0 中的ClustalW 比對，構(gòu)建糜子轉(zhuǎn)錄因子NAC 氨基酸序列系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。結(jié)果表明（圖13），PmNAC1 蛋白與柳枝稷（Panicum virgatum）CUC2 的親緣關(guān)系最近，二者的遺傳變異系數(shù)為0.06，都為禾本科作物，可能為旁系同源基因，與番茄的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，可見隸屬于同一科的作物蛋白序列更容易聚為一類。

圖13 PmNAC1 與其他NAC 家族蛋白序列進(jìn)化樹構(gòu)建Fig.13 Phylogenetic tree construction of PmNAC1 and other NAC family proteins

3 結(jié)論與討論

目前,人們對于植物NAC 轉(zhuǎn)錄因子有進(jìn)一步研究，其具有NAM 功能域，在單、雙子葉植物中具有高度保守性，但現(xiàn)在研究最多的是擬南芥等植物。本試驗通過對糜子NAC基因克隆并測序，獲得了1 條總長度為1 634 bp 的核苷酸序列，編碼423 個氨基酸；生物信息學(xué)預(yù)測編碼的PmNAC1 蛋白屬于親水性蛋白，無跨膜結(jié)構(gòu)，不能產(chǎn)生信號肽，含有59 個磷酸化位點，說明不是膜結(jié)合蛋白[32]。

空間結(jié)構(gòu)在很大程度上決定了蛋白質(zhì)的功能，通過對糜子蛋白的二、三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測可知，NAC 蛋白由8 個α-螺旋和14 個β-折疊組成，該蛋白以無規(guī)則卷曲為主。何姍等[33]使用玉米骨干自交系Mo17，通過RT-PCR 克隆得到了玉米轉(zhuǎn)錄因子NAC 78，分析得到NAC 78 蛋白質(zhì)N 端含有1 個NAM 保守結(jié)構(gòu)域，由8 個α-螺旋和7 個β-折疊構(gòu)成。本試驗研究發(fā)現(xiàn)，PmNAC1 蛋白質(zhì)的N-端含有1個編碼423個氨基酸的NAC 保守結(jié)構(gòu)域，由8個α-螺旋和14 個β-折疊構(gòu)成。該結(jié)構(gòu)與何姍等[33]對玉米、田云等[34]對煙草和趙才美等[20]對水稻NAC轉(zhuǎn)錄因子的保守結(jié)構(gòu)域之間存在著一定同源性。系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示，NAC 蛋白與柳枝黍（Panicum virgatum）CUC2 的親緣關(guān)系最近，表明二者可能由同一個祖先進(jìn)化而來，與番茄的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)；且與谷子、玉米、狗尾草、野生稻等都有較高的同源性，表明NAC 轉(zhuǎn)錄因子在植物中可能具有相同的功能。

蛋白質(zhì)磷酸化是在植物蛋白激酶和細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的過程中起關(guān)鍵作用的一種技術(shù),也是生物界最常見、最重要的一種蛋白質(zhì)翻譯后修飾[35]。蛋白質(zhì)磷酸化是調(diào)控和調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的活性和功能最基本、最關(guān)鍵的機制。蛋白質(zhì)磷酸化的功能主要有3個方面：第一是植物體內(nèi)信號的傳導(dǎo)有磷酸化蛋白質(zhì)的參與；第二是影響蛋白質(zhì)之間的相互作用；第三是受體蛋白質(zhì)的活性通過磷酸化修飾而改變[36]。本研究表明，糜子NAC 蛋白磷酸化位點總計59 個，包含31 個絲氨酸、22 個蘇氨酸以及6 個酪氨酸。推測糜子NAC 轉(zhuǎn)錄因子可能存在多種翻譯后水平的修飾作用以調(diào)節(jié)其自身的表達(dá)水平。

轉(zhuǎn)錄因子在植物抗性生理中扮演著非常重要的角色，分離鑒定逆境相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，揭示其調(diào)控的分子機制是植物抗性研究的首要任務(wù)。NAC 轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控機制上的研究取得了一定的進(jìn)展，但仍不完善。NAC 轉(zhuǎn)錄因子在擬南芥和水稻2 種模式植物中的研究較為成熟，在大豆、煙草等植物中都有所報道，本試驗通過克隆糜子NAC 轉(zhuǎn)錄因子，并進(jìn)行生物學(xué)信息分析，為研究糜子生物學(xué)功能提供了理論依據(jù)。農(nóng)業(yè)部黃土高原作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室正創(chuàng)建表達(dá)糜子PmNAC1 材料，NAC 轉(zhuǎn)錄因子在糜子中的功能有利于闡明PmNAC1 轉(zhuǎn)錄因子在糜子中的生物學(xué)功能及其分子機理，為NAC 轉(zhuǎn)錄因子在糜子育種中的應(yīng)用提供依據(jù)。