王 雪,孫玉榮,張 諾,李忠祥,任志賢,張寶俊
(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院,山西 太谷 030801)
植物在自然界與各類病原生物長(zhǎng)期的攻防和博弈的過(guò)程中[1],形成了一套高效復(fù)雜防御系統(tǒng)以抵御多類病原菌的侵染與為害。由病原體相關(guān)分子模式(Pathogen associated molecular pattern,PAMP)觸發(fā)的免疫反應(yīng)(Pathogen-associated molecular pattern-triggered immunity,PTI)和效應(yīng)子觸發(fā)的免疫反應(yīng)(Effector-Triggered Immunity,ETI)在寄主植物發(fā)揮抗病性、阻礙病菌侵染方面起著重要的作用[2]。其中,PTI途徑由許多類受體激酶(Receptorlike kinases,RLKs)和類受體蛋白調(diào)節(jié)作為誘導(dǎo)第一層防御反應(yīng)的模式識(shí)別受體檢測(cè)PAMP,對(duì)非適生性病原菌具有廣譜抗性[3]。細(xì)胞壁相關(guān)激酶(Wall-associated kinases,WAKs)基因家族是一類獨(dú)特的RLKs 基因,在植物防御病原菌中發(fā)揮著重要作用[4],它們編碼的跨膜蛋白具有胞內(nèi)絲氨酸/蘇氨酸激酶(Ser/Thr kinase,STK)結(jié)構(gòu)域和胞外類表皮生長(zhǎng)因子(Epidermal growth factor-like,EGFlike)結(jié)構(gòu)域[5]。伴隨著WAK 基因家族的鑒定及功能驗(yàn)證研究的深入,其在植物抗病方面的重要作用陸續(xù)被證明。研究發(fā)現(xiàn),ZmWAK-RLK1(Htn1)通過(guò)減少玉米大斑病菌(Exserohilum turcicum)滲透到宿主組織中而導(dǎo)致感染過(guò)程的改變,賦予玉米數(shù)量抗性[6];番茄細(xì)胞壁相關(guān)激酶SlWAK1 依賴于Fls2/Fls3 促進(jìn)對(duì)假單胞菌(Pseudomonas syringae)的質(zhì)外體免疫反應(yīng)[7];棉花中,GhWAK7A通過(guò)調(diào)節(jié)幾丁質(zhì)信號(hào)傳導(dǎo)防御棉花黃萎病菌(Verticillium dahliae)[8];在水稻中,OsWAK91是參與防御水稻紋枯病菌(Rhizoctonia solani)的候選基因[9]。OsWAK1在水稻中的過(guò)表達(dá)增強(qiáng)了對(duì)稻瘟病菌的抗性[10];TaWAK7D通過(guò)調(diào)控小麥多個(gè)病程相關(guān)基因的表達(dá),正向參與小麥對(duì)紋枯病菌(Rhizoctonia cerealis)的防御反應(yīng)[11];ZmWAK在抗性玉米品種的中胚軸中高度表達(dá)[12]。這些發(fā)現(xiàn)表明,WAK 基因家族對(duì)于植物防御病原菌是必不可少的。
谷子一直被作為主要的雜糧作物在我國(guó)栽培[13],具有悠久的種植歷史,在中華文明的形成過(guò)程中發(fā)揮了重要作用,其營(yíng)養(yǎng)均衡且對(duì)糖尿病、腸胃病、心腦血管疾病等多種疾病有食療作用[14]。谷子是一種生長(zhǎng)能力強(qiáng)、CO2利用率高、需水量少的C4 光合途徑作物[15],在保障全球糧食安全中具有潛在作用。由禾生指梗霉(Sclerospora graminicola)引起的谷子白發(fā)病是一種嚴(yán)重威脅谷子安全生產(chǎn)的主要病害,常年的發(fā)病率為20%~30%,一些優(yōu)良易感品種的發(fā)病率甚至達(dá)70%以上[16]。隨著我國(guó)雜糧特色產(chǎn)業(yè)的發(fā)展,該病害發(fā)生面積及發(fā)病程度有逐漸增長(zhǎng)的趨勢(shì),嚴(yán)重威脅著谷子產(chǎn)量和品質(zhì)的提高,因此,挖掘谷子抗白發(fā)病基因及關(guān)鍵調(diào)控因子,加速抗白發(fā)病品種的選育,對(duì)于有效防控谷子白發(fā)病的發(fā)生發(fā)展具有十分重要的意義。WAK基因家族在擬南芥[17]、水稻[18]、棉花[19]、大麻[20]、馬鈴薯[21]、小麥[22]等植物中已被鑒定,但有關(guān)谷子WAK基因家族的研究還未見(jiàn)報(bào)道。
為挖掘谷子中WAK 基因的相關(guān)功能,本研究利用生物信息學(xué)方法對(duì)谷子的WAK 基因進(jìn)行篩選及進(jìn)一步鑒定,對(duì)確定下的谷子WAK 基因家族進(jìn)行基因定位、蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析、進(jìn)化分析、保守基序分析、順式作用元件分析,同時(shí)對(duì)谷子WAK基因家族響應(yīng)禾生指梗霉早期侵染的表達(dá)模式進(jìn)行分析,旨在為探究WAK 基因家族在谷子生長(zhǎng)發(fā)育和抗白發(fā)病代謝途徑中的功能提供理論依據(jù),并為抗白發(fā)病分子育種提供一定的參考。
谷子基因組序列從Multi-omics Database forSetaria italica數(shù)據(jù)庫(kù)(http://foxtail-millet.biocloud.net/home)中獲取。利用TAIR數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.arabidopsis.org/)下載14 條擬南芥WAK 蛋白序列,并通過(guò)國(guó)家水稻數(shù)據(jù)庫(kù)中心(http://www.ricedata.cn/index.htm)獲取9 條水稻W(wǎng)AK 蛋白序列,利用TBtools 中的BLAST GUI Wrapper 程序、以水稻與擬南芥的WAK 蛋白序列作為探針序列對(duì)谷子的全基因蛋白序列進(jìn)行搜索比對(duì),比對(duì)標(biāo)準(zhǔn)為Evalue<0.01,根據(jù)NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中的Batch-CD-Search 功能進(jìn)行結(jié)構(gòu)域確定。
利用在線工具ExPASY-ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)分析谷子WAK 基因家族蛋白的理化性質(zhì),主要有氨基酸數(shù)量、分子質(zhì)量和等電點(diǎn)等。利用在線網(wǎng)站(https://wolfpsort.hgc.jp/)對(duì)谷子WAK 基因家族的亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測(cè)。基因定位根據(jù)谷子的基因組注釋gff3 文件,利用TBtools 對(duì)定位結(jié)果進(jìn)行可視化。
使用MEGA 7.0 軟件對(duì)水稻、擬南芥、谷子WAK 基因家族的蛋白序列進(jìn)行多序列比對(duì),采用Neighbor joining 法(bootstrap 值設(shè)定為1 000)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。
谷子WAK 基因家族的保守基序借助MEME在線工具(http://meme-suite.org/tools/meme)進(jìn)行分析,后通過(guò)TBtools 對(duì)谷子WAK 基因家族的保守基序進(jìn)行可視化做圖。
利用TBtools 軟件的Gtf/Gff3 Sequences Extract 程序提取WAK 基因上游2 000 bp 的起始密碼子,使用Plantcare 數(shù)據(jù)庫(kù)(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)將WAK 基因家族的啟動(dòng)子序列提交至此數(shù)據(jù)庫(kù)中,分析谷子WAK 基因家族的順式作用元件。
試驗(yàn)材料為晉谷21 號(hào)(JG21)及晉谷20 號(hào)(JG20),由雜糧種質(zhì)創(chuàng)新與分子育種山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。晉谷21 號(hào)對(duì)谷子白發(fā)病具有高感性,晉谷20 號(hào)對(duì)谷子白發(fā)病具有高抗性。
以JG21 和JG20 的2 日齡胚芽鞘為材料,用4×105個(gè)/mL 的禾生指梗霉病菌游動(dòng)孢子懸浮液接種2日齡胚芽鞘。分別于接菌前0 h,接菌后12、24、48、96 h 不同時(shí)間段取受侵染的胚芽鞘,放于液氮速凍,-80 ℃保存?zhèn)溆谩? 次重復(fù),共計(jì)30 份樣品,后委托百邁克生物科技有限公司進(jìn)行RNA 測(cè)序。
運(yùn)用RStudio 在線工具,對(duì)谷子WAK 基因響應(yīng)禾生指梗霉侵染的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)繪制熱圖并進(jìn)行分析。
谷子WAK 基因結(jié)構(gòu)域如圖1 所示。
利用BLASTP 在xiaomi基因組中共鑒定得到41 個(gè)WAK 候選基因,再通過(guò)NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中的Batch-CD-Search功能進(jìn)行結(jié)構(gòu)域確定。其中,41個(gè)WAK 候選基因都具有GUB_WAK_bind 結(jié)構(gòu)域(圖1),最終篩選得到谷子WAK 基因共41 個(gè)。谷子WAK 基因家族編碼590~1 131 個(gè)氨基酸,平均為800個(gè);其蛋白分子質(zhì)量為65.62~123.36 ku,等電點(diǎn)為5.18~8.49;Si3g36660、Si7g23280、Si8g19780蛋白親水性均值均為正值,表現(xiàn)為疏水性;除此之外,其他基因的蛋白親水性均值均為負(fù)值,則其蛋白表現(xiàn)為親水性。41 個(gè)基因中,28 個(gè)基因定位于質(zhì)膜,6 個(gè)基因定位于葉綠體,其他基因定位于高爾基體、液泡、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細(xì)胞外基質(zhì)(表1)。在基因定位中,谷子WAK 基因在9 個(gè)染色體上均有分布。其中,Chr3 上所包含基因最多,為7 個(gè);Chr2 上的WAK 基因最少,僅有1 個(gè)(圖2)。
圖2 谷子WAK 基因定位Fig.2 WAK gene location in foxtail millet
系統(tǒng)發(fā)育分析表明,谷子、擬南芥和水稻的WAK 基因家族可分為五大類(圖3)。其中,I、IV、V 類中僅含有水稻與谷子這2 個(gè)物種的WAK 同源基因,I、IV、V 類分別包括6 個(gè)谷子WAK 基因及2 個(gè)水稻W(wǎng)AK 基因、9 個(gè)谷子WAK 基因及3 個(gè)水稻W(wǎng)AK 基因、10 個(gè)谷子WAK 基因及2 個(gè)水稻W(wǎng)AK基因;在II 類中僅包含擬南芥的WAK 同源基因;第III 類中同時(shí)包含谷子、擬南芥、水稻的WAK 同源基因,其中,Si1g24650與Os01g26174、Si1g12300與Os02g02120的同源關(guān)系最近。
圖3 谷子WAK 基因家族系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.3 Phylogenetic evolution analysis of WAK gene family in foxtail millet
對(duì)41 個(gè)谷子的WAK 基因進(jìn)行保守基序分析,經(jīng)分析鑒定其具有8 個(gè)基序,命名為Motif 1~Motif 8。其中,Motif 3、Motif 1、Motif 6、Motif 4、Motif 5 在41 個(gè)谷子的WAK 蛋白序列中均存在,因此,這5 個(gè)基序均較為保守,且這5 個(gè)基序都以Motif 3、Motif 1、Motif 6、Motif 4、Motif 5 的先后位置排布(圖4-A)。保守基序的序列分析表明,Motif1中的保守序列為ZIDZFINEVAILSQINHRNVVKL LGCCLETEVPLLVYEFISNGTLYELLH,Motif3中的保守序列為KTKIFSLEELEKATNNFDKTR VLGRGGHGTVYKGIL(圖4-B)。
圖4 谷子WAK 基因家族保守基序分析Fig.4 Conservative motif analysis of WAK gene family in foxtail millet
谷子WAK 基因家族順式作用元件分析結(jié)果如圖5 所示。
圖5 谷子WAK 基因家族順式作用元件分析Fig.5 Analysis of cis-acting elements of WAK gene family in foxtail millet
順式作用元件預(yù)測(cè)表明(圖5),WAK 基因家族順式作用元件中,與光響應(yīng)有關(guān)的元件較多,說(shuō)明WAK 基因家族可能參與光合作用并發(fā)揮重要作用;同時(shí),赤霉素、茉莉酸甲酯、水楊酸、脫落酸的響應(yīng)元件也分布較多,表明WAK 基因家族在谷子中可能與激素信號(hào)緊密相關(guān);在多個(gè)谷子WAK 基因家族中都有防御和脅迫響應(yīng)元件的分布,這說(shuō)明谷子WAK 基因家族在發(fā)揮寄主抗病性、抵御病菌侵染等方面具有重要作用。
谷子WAK 基因家族響應(yīng)禾生指梗霉侵染的轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析顯示(圖6),共有2 類表達(dá)模式,在class Ⅰ中基因Si4g02780、Si7g23280、Si8g19220在JG21 中受到禾生指梗霉侵染48、96 h 表達(dá)量顯著高于JG20 中的表達(dá)量,并在96 h 差異表達(dá)最顯著,差異倍率分別為4.36、5.64、3.42(圖7)。
圖7 基因表達(dá)量分析Fig.7 Gene expression analysis
class Ⅱ在感病品種JG21 中的表達(dá)量整體低于在抗病品種JG20 中的表達(dá)量,Si6g20040在JG20中受到禾生指梗霉侵染48、96 h 表達(dá)量高,分別為10.39、10.73;Si7g08090和Si8g19780在JG21 和JG20 的表達(dá)量均隨侵染時(shí)間的增加而增加,且在JG20 的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量均高于JG21 中的表達(dá)量,并在48 h 差異表達(dá)最顯著,差異倍率分別為10.46、2.04(圖7)。
細(xì)胞壁關(guān)聯(lián)蛋白激酶(Wall-associated kinases,WAKs)是一類特殊的類受體蛋白激酶,在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和防御脅迫反應(yīng)等方面發(fā)揮著重要作用。WAKs/WAKL 在植物對(duì)真菌病害的防御反應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用[23]。低聚半乳糖苷(OGs)作為胞壁多糖的降解產(chǎn)物,被AtWAK1 所識(shí)別[24]。在擬南芥中過(guò)表達(dá)AtWAK1可以增強(qiáng)對(duì)灰霉病的抗性[25]。位于黑穗病數(shù)量抗性基因(qHSP1)上的ZmWAK基因的高表達(dá)有效地抑制了絲黑穗病菌在中胚軸中的生長(zhǎng)[12]。水稻OsWAK14、OsWAK91和OsWAK92正向調(diào)控稻瘟病菌的防御反應(yīng),而OsWAK112d則負(fù)調(diào)控防御反應(yīng)[26]。本研究共鑒定到41 個(gè)谷子WAK 基因家族成員,與其他植物中WAK/WAKL 基因啟動(dòng)子順式作用元件分析結(jié)果相類似[27],本研究谷子WAK 基因啟動(dòng)子區(qū)域檢測(cè)到大量與光響應(yīng)、植物激素和應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)的基序。Si1g25040、Si3g10590、Si3g32650、Si4g01670、Si4g02770、Si4g02780、Si5g09950、Si7g06570、Si7g08090都含有防御和脅迫響應(yīng)元件,表明這9 個(gè)谷子WAK 基因在發(fā)揮寄主抗病性、抵御病菌侵染等方面具有調(diào)控作用。與未侵染0 h相比,Si6g20040、Si7g08090、Si8g19780基因在抗病品種晉谷20 號(hào)的4 個(gè)不同侵染時(shí)間中基因上調(diào)表達(dá);同時(shí),3 個(gè)基因在晉谷21 號(hào)不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量均低于晉谷20 號(hào)中的表達(dá)量,且在48 h 時(shí)表達(dá)量差異均最顯著,推測(cè)Si6g20040、Si7g08090、Si8g19780在阻礙禾生指梗霉侵染方面發(fā)揮作用。由于Si6g20040、Si7g08090、Si8g19780基因在晉谷21 號(hào)與晉谷20 號(hào)中表達(dá)量差異均在48 h 最顯著,因此,推測(cè)48 h的侵染時(shí)間點(diǎn)可能是一個(gè)關(guān)鍵侵染時(shí)間點(diǎn)。在接下來(lái)的研究中,需要進(jìn)一步研究和挖掘Si6g20040、Si7g08090、Si8g19780基因在谷子抗感品種的差異表達(dá)的原因。本研究結(jié)果可為進(jìn)一步研究谷子的抗病機(jī)制及生長(zhǎng)發(fā)育等提供一定的參考依據(jù)。