肌動蛋白相關(guān)蛋白2/3 復(fù)合體亞基4、環(huán)氧合酶2 在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)及與患者臨床特征和預(yù)后的關(guān)系

王雷，王越月，牛云霞#

1延安大學(xué)咸陽醫(yī)院病理科，陜西 咸陽 712000

2陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院病理科，陜西 咸陽 712000

近年來隨著人們生活方式和飲食習(xí)慣的改變，中國結(jié)直腸癌的發(fā)病率逐漸升高，居全部惡性腫瘤第3 位[1]。結(jié)直腸癌可采取手術(shù)治療，但仍有不可控的轉(zhuǎn)移導(dǎo)致患者死亡，因此盡早診斷結(jié)直腸癌可大大提高患者生存率，延長患者生存期。肌動蛋白相關(guān)蛋白2/3（actin related protein 2/3，Arp2/3）是一種肌動蛋白裝配成核器，可參與微絲的產(chǎn)生，具有構(gòu)建細(xì)胞骨架、參與細(xì)胞運動等功能[2]，其組成成分包括7 種亞基，通過互相作用連接為穩(wěn)定的Arp2/3[3-4]。有報道指出，下調(diào)肌動蛋白相關(guān)蛋白2/3 復(fù)合體亞基5（actin related protein 2/3 complex subunit 5，ARPC5）的表達(dá)可有效抑制肺癌細(xì)胞擴散和惡性增殖，但目前關(guān)于Arp2/3 主要構(gòu)成成分肌動蛋白相關(guān)蛋白2/3 復(fù)合體亞基4（actin related protein 2/3 complex subunit 4，ARPC4）的研究少有報道，ARPC4 與結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展和預(yù)后的關(guān)系仍未明確[5-6]。此外，環(huán)氧合酶2（cyclooxygenase 2，COX2）在結(jié)直腸癌組織中大多為陽性表達(dá)，而在正常組織中為陰性或弱陽性表達(dá)，提示COX2 對結(jié)直腸癌的預(yù)測價值較高。本研究探討ARPC4 和COX2 在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)及與患者臨床特征和預(yù)后的關(guān)系，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2015 年8 月至2017 年8 月延安大學(xué)咸陽醫(yī)院收治的結(jié)直腸癌患者的病歷資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理檢查確診為結(jié)直腸癌，且為首次確診；②未服用過非甾體抗炎藥；③臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他惡性腫瘤；②術(shù)前曾接受過放化療；③合并多臟器衰竭；④妊娠期女性。依據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，本研究納入96 例患者，其中男45例，女51 例；平均年齡（57.18±7.13）歲；直腸癌47例，結(jié)腸癌49 例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審批通過，所有患者均知情同意。

1.2 免疫組織化學(xué)染色法檢測ARPC4、COX2 表達(dá)情況

采用鏈霉抗生物素蛋白-過氧化物酶（streptavidin-peroxidase，SP）連結(jié)法進行免疫組織化學(xué)染色。①烤片。收集結(jié)直腸癌組織標(biāo)本，每例標(biāo)本切取3 張切片，厚度為3 μm，檢查電烤箱是否完好，設(shè)置溫度為60 ℃，預(yù)熱完成后，將切片置于烤架上，烘烤30 min。②脫蠟、水化。將烘烤后的切片置于二甲苯溶液中浸泡5 min，拿出后放置5 min，進行脫蠟。然后分別在100%、95%、75%乙醇中浸泡5 min，完成水化。水化后將切片置于流水下清洗，將乙醇洗去，但注意不能用力沖洗。③高壓抗原修復(fù)。將250 ml 檸檬酸鈉溶解于2 L 蒸餾水中，溶解充分后置于高壓蒸汽鍋中，完全浸泡于水中，煮沸。蒸汽鍋出汽后等待2 min，關(guān)閉電源，等待切片自然冷卻后取出。分2 次浸泡于磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）中，每次5 min。④干燥切片。用免疫組化筆在病灶組織旁畫圈，為將預(yù)加試劑固定于切片做準(zhǔn)備。然后滴加3%過氧化氫，維持10 min，再用PBS 清洗3 次，甩干。⑤一抗孵育。滴加ARPC4、COX2一抗工作液，于4 ℃冰箱孵育過夜。分3次浸泡于PBS中，每次3 min。⑥二抗孵育。滴加兔抗人ARPC4、COX2 多克隆抗體，于室溫下放置30 min，分3 次浸泡于PBS 中，每次3 min。⑦二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色?，F(xiàn)用現(xiàn)配DAB 試劑并滴加，等待1 min 后用PBS 清洗3 次。⑧蘇木素染色。染色30 s 后自來水沖洗1～2 次，甩干。⑨脫水、封片。將切片依次置于75%、95%、100%乙醇中，每次3 min，然后在組織中央滴一滴中性樹脂，封片。

1.3 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果判定

由3 名經(jīng)驗豐富的病理科醫(yī)師對染色結(jié)果進行判定，意見不統(tǒng)一時協(xié)商討論。ARPC4 主要定位于細(xì)胞質(zhì)，COX2 主要定位于核膜與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。采用染色強度和陽性細(xì)胞百分比結(jié)合的半定量方法進行評分，綜合評分=陽性細(xì)胞百分比評分×染色強度評分。陽性細(xì)胞百分比評分：0%～5%為0 分，6%～25%為1 分，26%～50%為2 分，51%～100%為3分；染色強度評分：未著色為1 分，淡黃色為2 分，深黃色為3 分。綜合評分0～1 分為陰性，2～9 分為陽性。

1.4 觀察指標(biāo)

收集患者的臨床資料，包括年齡、性別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、腫瘤直徑、分化程度、T 分期、TNM 分期，比較不同臨床特征結(jié)直腸癌患者結(jié)直腸癌組織中ARPC4、COX2 陽性表達(dá)率，分析結(jié)直腸癌組織中ARPC4 與COX2 表達(dá)的相關(guān)性。所有患者均隨訪3 年，比較不同ARPC4、COX2 表達(dá)情況結(jié)直腸癌患者的3 年生存率。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 23.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。采用回歸分析法進行相關(guān)性分析。以P﹤0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌患者中ARPC4 和COX2 表達(dá)情況

結(jié)直腸癌患者中ARPC4 陽性表達(dá)率為61.46%（59/96），COX2 陽性表達(dá)率為59.38%（57/96）。

2.2 不同臨床特征結(jié)直腸癌患者結(jié)直腸癌組織中ARPC4、COX2 陽性表達(dá)情況的比較

不同年齡、性別、腫瘤直徑、T 分期結(jié)直腸癌患者結(jié)直腸癌組織中ARPC4、COX2 陽性表達(dá)率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P﹥0.05）；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、低分化、Ⅲ～Ⅳ期結(jié)直腸癌患者結(jié)直腸癌組織中ARPC4、COX2 陽性表達(dá)率均高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、中高分化、Ⅰ～Ⅱ期患者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P﹤0.05）。（表1）

表1 不同臨床特征結(jié)直腸癌患者結(jié)直腸癌組織中ARPC4、COX2 表達(dá)情況的比較

2.3 結(jié)直腸癌組織中ARPC4與COX2表達(dá)的相關(guān)性

結(jié)直腸癌組織中ARPC4 與COX2 的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.618，P﹤0.05）。

2.4 生存情況的比較

ARPC4陽性表達(dá)結(jié)直腸癌患者的3年生存率為30.51%（18/59），低于ARPC4陰性表達(dá)患者的54.05%（20/37），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=5.272，P=0.022）。COX2 陽性表達(dá)結(jié)直腸癌患者的3 年生存率為29.82%（17/57），低于COX2陰性表達(dá)患者的51.28%（20/39），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=4.501，P=0.034）。

3 討論

在中國，隨著人們飲食習(xí)慣和環(huán)境的改變，結(jié)直腸癌的發(fā)病率不斷上升。國家癌癥中心統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，2020 年結(jié)直腸癌新發(fā)病例45.6 萬例，其發(fā)病率居全部惡性腫瘤第2 位[7]。研究顯示，結(jié)直腸癌一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移，即使經(jīng)手術(shù)切除，依然容易復(fù)發(fā)[8-9]。接受過結(jié)直腸癌切除術(shù)的患者可能會發(fā)展為異時性結(jié)直腸癌。因此，早期篩查和預(yù)后評估對延長結(jié)直腸癌患者生存期具有重要意義，精準(zhǔn)快捷的檢測手段可指導(dǎo)醫(yī)師判斷病情，從而制訂更規(guī)范的診療計劃，為患者爭取最佳治療機會。

ARPC 蛋白由7 個亞基組成，各亞基通過相互作用形成“C 型”的鉗形結(jié)構(gòu)[10-11]，該蛋白具有3 個帶有極性基團的線性表位，抗原決定簇存在于ARPC 蛋白表面位置，易與相應(yīng)抗體特異性結(jié)合，影響抗原抗體的結(jié)合能力[12-13]。ARPC 可影響腫瘤細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)的運動能力，為惡性腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移奠定基礎(chǔ)。ARPC 可通過磷酸化來發(fā)揮其生物學(xué)活性，磷酸化降低了ARPC 蛋白的穩(wěn)定性，進而使其發(fā)揮作用。ARPC 可降低p53 的活性，抑制BCL2 相關(guān)X 蛋白（BCL2 associated X protein，BAX）轉(zhuǎn)錄，從而降低細(xì)胞膜的選擇透過性，繼而改變細(xì)胞周期和增殖能力，影響細(xì)胞凋亡過程，促進細(xì)胞增殖。本研究結(jié)果顯示，ARPC4陽性表達(dá)結(jié)直腸癌患者的3 年生存率低于ARPC4 陰性表達(dá)患者（P﹤0.05）。說明ARPC4對結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展具有重要作用，ARPC4高表達(dá)與腫瘤細(xì)胞免疫逃逸息息相關(guān)，ARPC4 可促進腫瘤細(xì)胞種植，縮短患者生存期。也有報道指出，ARPC4 可通過調(diào)控膀胱癌、肺癌、肝細(xì)胞癌侵襲轉(zhuǎn)移影響患者預(yù)后[14-15]。

內(nèi)皮細(xì)胞之間的黏附功能對維持正常生命活動十分重要，肌動蛋白微絲骨架可以使內(nèi)皮細(xì)胞之間緊密連接，即形成屏障功能。聯(lián)蛋白（catenin）和鈣黏著蛋白（cadherin）結(jié)合形成復(fù)合體后，維持了屏障功能的正常運行。有學(xué)者指出，ARPC4 可干擾catenin 與cadherin 結(jié)合，加速細(xì)胞周期，并正向調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞中侵襲基因轉(zhuǎn)錄，造成細(xì)胞質(zhì)內(nèi)catenin 濃度升高并進入細(xì)胞核，加速腫瘤細(xì)胞的種植[16]。同時，ARPC4 作為Arp2/3 中心的重要組成部分，可增加微絲的數(shù)量，增強腫瘤細(xì)胞的侵襲性。也有報道指出，ARPC4 可對靶細(xì)胞進行雙向調(diào)節(jié)，通過抑制黑色素瘤中APRC4 的表達(dá)減緩腫瘤的侵襲速度，但其表達(dá)被明顯抑制后卻沒有這一效應(yīng)[17]。

COX2 是一類參與前列腺素合成的限速酶，可被生長因子等物質(zhì)刺激合成[18]。COX2 可在腫瘤中參與前列腺素合成，繼而促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展，有學(xué)者在結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移灶中發(fā)現(xiàn)COX2 呈高表達(dá)，且其表達(dá)活性明顯高于原發(fā)灶，證實COX2 對腫瘤侵襲具有促進作用，會提高結(jié)腸癌的復(fù)發(fā)風(fēng)險[19]。有學(xué)者進行動物實驗后發(fā)現(xiàn)，定期服用COX2 抑制劑可使小鼠結(jié)腸息肉發(fā)生率降低40%，異常隱窩病灶發(fā)生率降低67%，表明COX2 抑制劑可預(yù)防結(jié)直腸疾病[20]。本研究中，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、低分化、Ⅲ～Ⅳ期結(jié)直腸癌患者結(jié)直腸癌組織中ARPC4、COX2 陽性表達(dá)率均高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、中高分化、Ⅰ～Ⅱ期患者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P﹤0.05）。提示ARPC4、COX2與結(jié)直腸癌患者的臨床特征密切相關(guān)。

WNT 信號通路中，ARPC4 可導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)內(nèi)catenin 大量聚集并入核，大大增強了catenin 與轉(zhuǎn)錄因子（transcription factor，TCF）/淋巴細(xì)胞增強結(jié)合因子1（lymphoid enhancer binding factor 1，LEF1）的結(jié)合能力，促進WNT 下游靶基因的表達(dá)。COX2可與TCF 結(jié)合，是眾多WNT 下游靶基因之一，catenin 的濃度變化可影響COX2 的表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌組織中ARPC4 與COX2 的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.618，P﹤0.05）。分析可能因為ARPC4 高表達(dá)是catenin 濃度異常的誘因，而catenin 濃度增加可促進COX2 表達(dá)，進而促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。因此認(rèn)為ARPC4 高表達(dá)→大量catenin 聚集→catenin 與TCF/LEF1 結(jié)合→上調(diào)COX2 表達(dá)→激活前列腺素→致癌，ARPC4 異常表達(dá)會導(dǎo)致COX2無法正常轉(zhuǎn)錄，進而導(dǎo)致癌變。

綜上所述，結(jié)直腸癌組織中ARPC4 與COX2的表達(dá)呈正相關(guān)，其表達(dá)與結(jié)直腸癌患者的臨床特征及預(yù)后有關(guān)。