• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    人工膝關節(jié)不同體外磨損周期的UHMWPE磨屑特征及細胞毒性研究

    2023-10-13 11:24:52付松卿彭業(yè)萍劉偉強
    摩擦學學報 2023年9期
    關鍵詞:潤滑液磨屑納米級

    付松卿 ,王 松 ,陳 凱 ,張 述 ,秦 穎 ,彭業(yè)萍 ,劉偉強,2

    (1.清華大學 機械工程系,北京 100084;2.深圳清華大學研究院 生物醫(yī)用材料及植入器械實驗室,廣東 深圳 518057;3.中國礦業(yè)大學 材料與物理學院,江蘇 徐州 221116;4.天津醫(yī)療器械質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心,天津 300384;5.天津科技大學 生物工程學院,天津 300457;6.深圳大學 機電與控制工程學院 廣東省電磁控制與智能機器人重點實驗室,廣東 深圳 518060)

    隨著全球人口老齡化加劇,骨關節(jié)炎逐漸成為最主要的致殘性疾病之一[1].人工關節(jié)置換術則是1種專門針對終末期骨關節(jié)炎的成熟治療方法.膝關節(jié)作為骨關節(jié)炎最常見的發(fā)病部位之一,每年都有大量患者接受人工膝關節(jié)置換[2].用于置換術的人工關節(jié)材料需要滿足輕量化和生物相容性好等要求.自Charnley型人工髖關節(jié)誕生以來,人工關節(jié)材料從不銹鋼發(fā)展到鈷合金、高分子聚合物和生物陶瓷等,而目前廣泛應用的人工膝關節(jié)假體則由鈷合金和超高分子量聚乙烯(UHMWPE)制成[3].UHMWPE憑借其優(yōu)異的機械性能和生物相容性,在人工膝關節(jié)領域得到大量研究,并常制成脛骨襯墊與鈷合金股骨髁配合[4].人工膝關節(jié)的長期可靠性對于患者極為重要,研究表明大部分的膝關節(jié)翻修是由人工關節(jié)無菌性松動引起的,而磨屑誘導的假體周圍骨溶解是導致無菌性松動的首要原因[5].由于UHMWPE的耐磨性比鈷合金更差,人工膝關節(jié)假體磨損產(chǎn)生的磨屑也主要源于UHMWPE[6].因此,當前人工膝關節(jié)磨屑的研究主要聚焦于UHMWPE磨屑的定量表征.

    采用人工膝關節(jié)摩擦磨損試驗機開展體外磨損試驗已成為研究磨屑生成和特征分析的主要方法,但對不同磨損周期下UHMWPE磨屑的數(shù)量、尺寸、形狀和分布等特征的定量研究仍較少.一方面是由于體外磨損試驗一般采用小牛血清溶液作為潤滑液,其中的血清蛋白等生物大分子會對磨屑提取產(chǎn)生嚴重干擾,需要通過使其中的生物大分子水解或變性降解的方式將其與磨屑分離,試驗流程較為復雜[7].另一方面,磨屑數(shù)量眾多,對其形態(tài)和尺寸等特征的定量提取較為繁瑣.鑒于此,本研究中通過酸處理法分離生物潤滑液中的人工膝關節(jié)UHMWPE磨屑,并結合自主開發(fā)的磨屑特征識別算法對磨屑的掃描電子顯微鏡(SEM)照片進行分析,揭示人工膝關節(jié)不同體外磨損周期下UHMWPE磨屑特征.

    此外,考慮到UHMWPE磨屑會誘導成纖維細胞吞噬異物并引起其凋亡,這一生物作用機制也是導致骨溶解現(xiàn)象出現(xiàn)的重要原因之一[8].因此,本研究中系統(tǒng)開展不同尺寸和濃度的UHMWPE磨屑對小鼠成纖維細胞的細胞毒性的影響,以期為未來人工膝關節(jié)設計和使用提供理論支持.

    1 材料與方法

    1.1 試驗材料

    人工膝關節(jié)體外模擬磨損試驗選擇CoCrMo合金為股骨髁和高交聯(lián)超高分子量聚乙烯(UHMWPE)脛骨襯墊配副的人工關節(jié)來開展,CoCrMo股骨髁為鑄造鈷鉻鉬合金,購買自施樂輝醫(yī)用產(chǎn)品國際貿(mào)易(上海)有限公司,UHMWPE脛骨襯墊由江蘇德鍵醫(yī)療科技發(fā)展有限公司提供.CoCrMo股骨髁表面粗糙度不大于0.05 μm,UHMWPE脛骨襯墊表面糙度不大于0.3 μm.人工膝關節(jié)摩擦磨損試驗機(Simulation Solution Ltd,UK)具有6個自由度和5個軸,能同時實現(xiàn)軸向力(A/F)、外展和內(nèi)收(A/A)、上彎屈伸展擺動(F/E)、下試樣扭轉和下試樣前后方向位移(A/P)的加載功能,試驗加載參考 ISO 14243 標準中規(guī)定的膝關節(jié)運動標準曲線,磨損周期為500萬次.潤滑液為去離子水與新生牛血清(杭州四季青)按體積比為1:1的混合溶液,其蛋白質(zhì)濃度約為20 g/L,添加適量慶大霉素-兩性霉素混合溶液以防潤滑液在試驗過程中變質(zhì)(1 L上述潤滑液加入100 mg慶大霉素和25 mg兩性霉素).試驗過程中每隔50萬次磨損周期取1次含有磨屑的潤滑液,并注入新的潤滑液.試驗中分別選取磨損周期為100萬次、200萬次、300萬次、400萬次和500萬次的潤滑液這5組試樣作為磨屑樣本來源.

    由于難以控制試驗中分離所得到磨屑的尺寸和濃度,因此選擇了尺寸分別為5、10和 25 μm和納米級的UHMWPE顆粒代替UHMWPE磨屑,并利用完全培養(yǎng)基將其濃度分別配置為0.1、0.5和2.5 mg/mL,因此得到12組用于細胞毒性試驗的試樣.細胞毒性試驗的試驗對象為小鼠成纖維細胞L929.

    1.2 試驗方法

    1.2.1 磨屑分離

    試驗中采用酸處理法將人工膝關節(jié)UHMWPE磨屑從潤滑液中分離出來,具體步驟如圖1所示.首先取2 mL含有人工膝關節(jié)磨屑的潤滑液,超聲振蕩1 h使其分散均勻,將震蕩后的潤滑液加入8 mL體積分數(shù)為37%的濃鹽酸中,并在60 ℃水浴條件下處理1 h.待處理后的溶液冷卻至室溫,再將其以10 000 r/min的轉速離心處理2 h.由于UHMWPE密度較小且略低于水,離心后大部分的UHMWPE磨屑分布在離心管上層[9],取1 mL上層懸浮液,并用50倍體積的甲醇稀釋懸浮液[10].超聲振蕩1 h稀釋后的懸浮液,使磨屑重新分散均勻,用孔徑為0.05 μm的聚碳酸酯膜對液體進行真空抽濾,再將聚碳酸酯膜轉移進通風櫥干燥12 h,便可得到分離提純的UHMWPE磨屑.在分離過程中,應當注意避免各步驟中溶液和儀器與外界發(fā)生接觸,以免引入雜質(zhì)影響后續(xù)觀測效果.對前文中所述5組試樣分別重復3次此操作后,得到15張附著UHMWPE磨屑的聚碳酸酯膜,并進行電鏡形貌分析.

    Fig.1 Separation steps of UHMWPE wear debris:(a) ultrasonic oscillation;(b) heating in water bath;(c) high-speed centrifugation;(d) dilution with methanol;(e) vacuum filtration;(f) drying圖1 UHMWPE磨屑分離步驟:(a)超聲振蕩;(b)鹽酸水浴;(c)高速離心;(d)甲醇稀釋;(e)真空抽濾;(f)通風干燥

    1.2.2 磨屑的SEM照片處理

    本研究中用掃描電子顯微鏡(SEM)進行UHMWPE磨屑形貌觀測.首先,用碳膠帶將干燥后附有磨屑的聚碳酸酯膜粘貼在顯微鏡樣品臺上,再進行鍍層厚度5 nm左右的噴金處理,使聚合物表面具備導電性.之后將其移入掃描電子顯微鏡樣品室進行觀察,加速電壓為5 keV,放大50 000倍左右.為了保證觀測結果的隨機性,采用一定規(guī)律在每個樣品的36個特定位置進行觀察,并獲得磨屑的SEM照片.

    對于UHMWPE磨屑形貌觀測后獲得的SEM照片,需要對其中的所有磨屑進行目標檢測和輪廓提取,從而獲得其各項特征尺寸數(shù)據(jù).由于磨屑照片和背景差異較為顯著,利用機器學習的方法,可以獲得快速且優(yōu)異的處理效果.在本研究中使用YOLOv4[11]和U-Net[12]網(wǎng)絡來處理UHMWPE磨屑照片,其中前者用于進一步確定單個磨屑在照片上的位置和區(qū)域,后者用于提取磨屑的輪廓,算法處理效果如圖2所示.獲得磨屑照片輪廓坐標數(shù)據(jù)后,結合照片比例尺等信息,可以計算得出磨屑的各項尺寸數(shù)據(jù),如面積(A)、長徑(dmax)、短徑(dmin)、長寬比(r)、圓度(R)、矩形度(Re)和形狀因子(F)等.

    醫(yī)學模擬教學(simulation based medical education,SBME)是通過模擬技術對患者、臨床進行模擬操作,仿真的進行治療,創(chuàng)造出高真模擬場景,進行臨床教學和試驗的教學方式[1]。該種教學方式的重復性較好,訓練的內(nèi)容比較真實,規(guī)范性高,成本較低,因此能夠有較高的應用價值,能夠讓醫(yī)學生對基本的操作規(guī)范進行掌握,具有很大的優(yōu)勢,可以彌補教學病種的缺失,診療病例不足等問題,提升學生的綜合操作能力和處理能力[2-3],現(xiàn)在臨床教學中已經(jīng)有比較多的應用。模擬人為主的教學模式得到了醫(yī)學教育界的廣泛認可[4]。此次主要是對模擬教學應用于全科醫(yī)學專業(yè)研究生教學的效果進行探討分析。

    Fig.2 Effect of contour extraction:(a) SEM micrograph of wear debris;(b) contour of wear debris圖2 輪廓提取效果:(a)磨屑電鏡圖像;(b)磨屑輪廓

    1.2.3 磨屑細胞毒性

    將培養(yǎng)好的小鼠成纖維細胞制備成濃度為5×105mL-1的細胞懸液,再將細胞懸液接種至96孔板.向64個孔中加入90 μL細胞懸液,其中48個作為試驗組(Mimic),16個作為對照組(Control);向另外16個孔中加入90 μL完全培養(yǎng)基,作為空白組(Blank).向48個試驗組孔內(nèi)加入10 μL試樣,12組試樣每組重復4次,并向剩下32個孔內(nèi)加入10 μL完全培養(yǎng)基.培養(yǎng)細胞24 h后,向各孔加入10 μL CCK-8(Cell counting Kit-8)試劑,繼續(xù)培養(yǎng)2 h使培養(yǎng)液充分發(fā)生顯色反應,如圖3所示.使用熒光顯微鏡觀測和記錄細胞生長形態(tài),并利用酶標儀測定培養(yǎng)液光密度(Optical density,OD),將光密度數(shù)據(jù)平均值代入如下公式,即可計算出小鼠成纖維細胞增殖率(P).

    Fig.3 Cytotoxicity analysis according to the color development of 96-well plate culture medium圖3 根據(jù)96孔板培養(yǎng)液顯色進行細胞毒性分析

    2 結果與討論

    2.1 不同體外磨損周期的UHMWPE磨屑特征

    針對5組潤滑液樣本,共收集到540張SEM照片,從中提取了1 217粒磨屑輪廓,基于后驗知識和能譜分析,除去259個在形態(tài)、尺寸和元素構成上異常的顆粒數(shù)據(jù),獲得了958個有效磨屑輪廓數(shù)據(jù).在958個有效磨屑中,來自100萬、200萬、300萬、400萬和500萬磨損周期潤滑液的分別是137個、189個、245個、261個和126個,可見隨著磨損循環(huán)次數(shù)增加,磨屑生成數(shù)量呈現(xiàn)先增多后減少的趨勢.

    在磨屑尺寸數(shù)據(jù)方面,本研究中重點關注磨屑長徑這一最為關鍵的特征,即磨屑輪廓上任意連線經(jīng)過質(zhì)心的兩點間最大歐式距離,后文如未特別指定,尺寸均指磨屑長徑.不同體外磨損周期的UHMWPE磨屑尺寸分布如圖4所示,圖中Mc為數(shù)量單位“百萬次”.從圖4中可以看出45.6%的磨屑長徑小于1 μm,14.1%的磨屑長徑為1~5 μm,11.0%的磨屑長徑為5~10 μm,11.6%的磨屑長徑為10~25 μm,17.7%的磨屑長徑大于25 μm.此外,無論磨屑來自哪個磨損周期,都以長徑小于1 μm的占比最多,且到磨損后期時(400萬次和500萬次),納米級磨屑占比急劇增加,甚至達到80%以上,而尺寸大于10 μm的磨屑大多來自磨損早期.因此,可以得出結論,磨損過程中納米級磨屑占比始終在30%以上,且隨著磨損周期增加,納米級磨屑占比逐漸增加.

    Fig.4 Size distribution of UHMWPE wear debris in different million cycles in vitro圖4 不同體外磨損周期的UHMWPE磨屑尺寸分布

    在磨屑形狀方面,ASTM F1877-16標準中定性地給出了顆粒物的形狀類別,但并未具體說明如何根據(jù)磨屑的特征參數(shù)來進行定量的分類,標準中磨屑的形狀分類仍然較為主觀.McMullin等[13]結合ASTM F1877標準和受試者判斷,開發(fā)了基于統(tǒng)計的方法,將超高分子量聚乙烯磨屑的形狀與尺寸數(shù)據(jù)定量地聯(lián)系了起來.本研究中根據(jù)實際的觀測情況和歸納推理,對磨屑的外形進行了分類,由整理得到的長寬比、圓度和矩形度等磨屑幾何參數(shù)得出的分類邏輯,即圓度大于0.9的歸為球狀,其余磨屑中矩形度大于0.8的歸為片狀,其中長寬比大于2.5的歸為桿狀,矩形度小于0.4的歸為纖維狀,其余磨屑中圓度大于0.3且矩形度大于0.5的歸為顆粒狀,剩下不便分類的作為其他.

    不同形狀磨屑的典型SEM照片如圖5所示.從圖5中可以發(fā)現(xiàn):球狀磨屑表面非常光滑,且尺寸基本小于1 μm,形狀較為規(guī)則;片狀磨屑表面紋理光滑,厚度較小,邊緣也較為平整,尺寸也以1 μm以下為主;纖維狀磨屑表面紋理平整且光滑,邊緣有卷曲現(xiàn)象,尺寸在1~5 μm;桿狀磨屑體態(tài)較大,表面粗糙但邊緣比較平整,尺寸多大于10 μm且可達數(shù)十微米;顆粒狀磨屑厚度較大,邊緣較平齊但表面粗糙,切削感嚴重,且尺寸分布較廣,從納米級到數(shù)十微米;其他磨屑表面較為粗糙,厚度適中,邊緣存在一定的折疊和卷曲,部分呈現(xiàn)出撕裂感.

    Fig.5 Different shapes of UHMWPE wear debris:(a) spherical;(b) flakes;(c) fibrillar;(d) rods;(e) granular;(f) others圖5 不同形狀的UHMWPE磨屑:(a)球狀;(b)片狀;(c)纖維狀;(d)桿狀;(e)顆粒狀;(f)其他

    根據(jù)試驗結果繪制不同磨損周期下的人工膝關節(jié)UHMWPE磨屑形狀數(shù)量分布如圖6所示.不同周期產(chǎn)生的磨屑形狀都以顆粒狀占比最高.從整體上來看,顆粒狀磨屑數(shù)量占比達62%,其次為占比12%的球狀磨屑,片狀、纖維狀和桿狀等類型磨屑則較少.對比不同周期下產(chǎn)生磨屑的形狀,可以看出隨著磨損周期數(shù)的增加,球狀磨屑占比不斷增加而纖維狀磨屑占比不斷減少;在100萬次磨損周期下產(chǎn)生的桿狀磨屑略多而片狀磨屑較少,隨著磨損周期增加,這2種形狀的磨屑占比變化不大,且均較少.

    Fig.6 Shape distribution of UHMWPE wear debris圖6 UHMWPE磨屑形狀分布

    2.2 不同尺寸和濃度的UHMWPE磨屑細胞毒性

    Fig.7 Average cell proliferation rate of mouse fibroblasts cultured with UHMWPE wear debris at different particle sizes and concentrations圖7 不同尺寸和濃度下UHMWPE磨屑培養(yǎng)小鼠成纖維細胞的細胞增殖率

    圖8所示為熒光顯微鏡下觀察到的不同尺寸和濃度的UHMWPE磨屑培養(yǎng)小鼠成纖維細胞的細胞形態(tài)照片.可以看出,圖8(c)中死亡的細胞最多,視野中已出現(xiàn)大量細胞凋亡后的深色殘余物,且?guī)缀鯖]有正常增殖的細胞,圖8(b)中大部分細胞形態(tài)呈現(xiàn)為圓形,證明較多的細胞瀕臨死亡,圖8(b)和圖8(c)中對應的均是納米級磨屑,且濃度分別是0.5和2.5 mg/mL.而同樣采用納米級磨屑的圖8(a)中對應磨屑濃度為0.1 mg/mL,其細胞增殖狀態(tài)更好,這同時也驗證了前文中所述納米級顆粒毒性最強且濃度越大細胞毒性越強的結果.圖8(f)中展示了UHMWPE磨屑尺寸較小(5 μm)但濃度較大(2.5 mg/mL)時細胞的培養(yǎng)情況,其中的細胞相對圖8(d)和圖8(e)也出現(xiàn)了更多的圓形形態(tài),這也證明了圖7的結論,即對5 μm的磨屑而言,同樣是磨屑濃度越大,細胞毒性越強.其他試樣的細胞形態(tài)大部分呈現(xiàn)梭形,證明細胞增殖情況良好.

    Fig.8 Fluorescent micrographs of cell morphology of mouse fibroblasts cultured with UHMWPE debris at different sizes and concentrations圖8 不同尺寸和濃度下UHMWPE磨屑培養(yǎng)小鼠成纖維細胞的細胞形態(tài)的熒光顯微鏡照片

    2.3 討論

    本研究中得到了不同體外磨損周期的UHMWPE磨屑,從磨屑形狀上看,絕大部分為不規(guī)則的顆粒狀,也有小部分球狀和片狀磨屑,以及極少數(shù)的桿狀和纖維狀磨屑.此外,不同體外磨損周期產(chǎn)生的磨屑在數(shù)量、尺寸和形狀等特征上也存在顯著差異:從數(shù)量上看,在400萬次體外磨損周期之前,由于UHMWPE襯墊表面仍存在粗糙峰,由于疲勞和熱效應,材料磨損情況會隨著周期數(shù)增加而趨于嚴重,產(chǎn)生的磨屑數(shù)量也逐漸增多,而后材料表面的粗糙峰去除,變得更加光滑,產(chǎn)生的磨屑數(shù)量又開始減少;從尺寸上看,產(chǎn)生的大多數(shù)磨屑長徑在5 μm以下,且隨著磨損周期增加,磨損形式由磨粒磨損向疲勞和黏著磨損過渡,UHMWPE主要由切削去除變?yōu)轲ぶ撀?,小尺寸磨屑的比例迅速增大;從形狀上看,結合不同形狀的典型SEM照片,可以推知顆粒狀磨屑在磨損的各個時期都會大量產(chǎn)生,尺寸較大的纖維狀和桿狀磨屑則主要產(chǎn)生于磨粒磨損階段,而球狀磨屑主要產(chǎn)生于疲勞和黏著磨損階段,因此隨著周期數(shù)的增加,纖維狀和桿狀磨屑占比減少而球狀磨屑占比增加.Chen等[14]的研究指出,人工膝關節(jié)UHMWPE假體的主要磨損機制是磨粒磨損和疲勞磨損.此外,還有大量體外研究[15-17]表明人工膝關節(jié)磨屑形狀和尺寸分布范圍與本文中得到的結果吻合.除了膝關節(jié)以外,人工髖關節(jié)也是最常被置換的關節(jié).在Wu等[18]和Zohdi等[19]針對髖關節(jié)UHMWPE磨屑的研究中同樣指出磨屑的尺寸為微納米級,但髖關節(jié)磨屑整體尺寸略小于本文中提取得到的膝關節(jié)磨屑尺寸,后者的研究中也提出隨著周期增加,髖關節(jié)UHMWPE磨屑的平均粒徑減小.

    在細胞毒性方面,UHMWPE磨屑尺寸和濃度均對小鼠成纖維細胞有顯著影響,劉鵬等[20]指出磨屑可以通過影響成纖維細胞來引起骨代謝失衡.從尺寸上看,納米級磨屑的細胞毒性最大,且比尺寸為5、10和25 μm的磨屑毒性要顯著得多.Musib等[21]認為磨屑的細胞毒性與細胞自身尺寸有關:小鼠成纖維細胞本身尺寸為20~30 μm,能夠容易吞噬1 μm以下磨屑,進而刺激凋亡進程表達,但更大的磨屑很難被吞噬且無直接的生理毒性.有學者認為,納米級顆粒更具有生物毒性,其激活的炎癥反應會帶來更高的骨溶解發(fā)生率[22].濃度方面,在試驗設計的濃度范圍內(nèi),UHMWPE磨屑的細胞毒性隨著磨屑濃度的增大而加劇,但與納米級別尺寸的磨屑相比,微米級別尺寸的磨屑細胞毒性隨濃度加劇的程度不如前者.

    盡管本研究中為人工膝關節(jié)UHMWPE磨屑的分離和分析提供了可行的思路和解決方案,并且揭示了不同體外磨損周期的UHMWPE磨屑特征和尺寸以及濃度等對細胞毒性的影響規(guī)律,但未來仍有如下問題需要進一步開展:(1)增加磨屑樣本量;(2)減少磨損循環(huán)取樣周期;(3)構建不同磨損周期下的UHMWPE磨屑圖譜.

    3 結論

    通過提取不同體外磨損周期下的人工膝關節(jié)UHMWPE磨屑,對其形狀、尺寸和數(shù)量等特征進行分析,并針對UHMWPE磨屑探究對小鼠成纖維細胞的細胞毒性,得出以下結論:

    a.人工膝關節(jié)體外磨損的UHMWPE磨屑形狀特征為顆粒狀磨屑占比可達62%,其次為占比12%的球狀磨屑,片狀、纖維狀和桿狀等類型磨屑則較少.

    b.不同磨損周期下的UHMWPE磨屑尺寸特征為磨損過程中納米級磨屑占比始終在30%以上,且隨著磨損周期增加,納米級磨屑占比逐漸增加,最高可以達到80%.

    c.不同磨損周期下的UHMWPE磨屑數(shù)量特征為隨著磨損周期增加,磨屑數(shù)量呈現(xiàn)先增多后減少趨勢.

    d.磨屑細胞毒性方面,納米級磨屑細胞毒性最強,隨著磨屑尺寸從5到25 μm增加,細胞毒性逐漸減小;在0.1~2.5 mg/mL濃度范圍內(nèi),細胞毒性基本遵循磨屑濃度越大毒性越強的規(guī)律.

    猜你喜歡
    潤滑液磨屑納米級
    天然橡膠/順丁橡膠并用膠的耐磨性能與磨屑分形維數(shù)的關聯(lián)性
    維生素E 穩(wěn)定型高交聯(lián)聚乙烯人工膝關節(jié)磨屑的分離提取
    納米BN 作為水基潤滑添加劑在鎂合金表面的摩擦學行為研究
    材料保護(2023年4期)2023-05-22 09:22:24
    磨屑對TC4鈦合金微動磨損行為的影響
    摩擦學學報(2022年5期)2022-10-11 07:37:00
    人工關節(jié)CoCrMo-UHMWPE 配副在不同接觸應力下的摩擦、磨損和磨屑特征
    材料保護(2022年12期)2022-02-16 13:15:56
    納米級針尖制備控制系統(tǒng)設計與實現(xiàn)
    電子制作(2019年14期)2019-08-20 05:43:44
    微納米級“外衣”讓控釋肥料“變聰明”
    納米級穩(wěn)定性三型復合肥
    滑私處干澀,增添夫妻濃情
    健康人生(2018年3期)2018-05-14 12:54:55
    為什么關節(jié)會咔咔響
    大自然探索(2017年3期)2017-04-07 21:18:45
    午夜久久久久精精品| www国产在线视频色| 美女cb高潮喷水在线观看 | 女人被狂操c到高潮| 高清在线国产一区| 亚洲 欧美一区二区三区| 欧美日韩国产亚洲二区| 熟女电影av网| 国产高潮美女av| 日韩欧美国产一区二区入口| 男人舔女人的私密视频| 免费在线观看影片大全网站| 亚洲电影在线观看av| 欧美日韩黄片免| 欧美+亚洲+日韩+国产| 亚洲美女黄片视频| 热99在线观看视频| 麻豆国产97在线/欧美| cao死你这个sao货| 香蕉国产在线看| 精品一区二区三区视频在线 | 首页视频小说图片口味搜索| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 丁香六月欧美| 国内精品一区二区在线观看| 亚洲电影在线观看av| av天堂在线播放| 久久久水蜜桃国产精品网| 青草久久国产| 国产精品野战在线观看| 欧美一区二区精品小视频在线| 亚洲av免费在线观看| 一边摸一边抽搐一进一小说| 日韩欧美在线二视频| 91九色精品人成在线观看| 成人国产一区最新在线观看| av在线天堂中文字幕| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 丁香六月欧美| 午夜免费成人在线视频| 舔av片在线| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 免费一级毛片在线播放高清视频| 两个人的视频大全免费| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 国产伦精品一区二区三区四那| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 91麻豆精品激情在线观看国产| 国产精品久久视频播放| 一本精品99久久精品77| 12—13女人毛片做爰片一| 国产欧美日韩精品亚洲av| 国产亚洲精品久久久com| 亚洲国产欧美网| 色老头精品视频在线观看| 亚洲乱码一区二区免费版| 久久久国产精品麻豆| 国产成人aa在线观看| 丁香六月欧美| av天堂在线播放| 极品教师在线免费播放| 日本黄色片子视频| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 村上凉子中文字幕在线| 亚洲av美国av| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 国产精品久久久人人做人人爽| 国产精品日韩av在线免费观看| 一边摸一边抽搐一进一小说| e午夜精品久久久久久久| 午夜久久久久精精品| 国产伦一二天堂av在线观看| 亚洲国产高清在线一区二区三| 人人妻人人澡欧美一区二区| 丰满人妻一区二区三区视频av | 婷婷六月久久综合丁香| 国产精品爽爽va在线观看网站| 欧美乱妇无乱码| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 又黄又粗又硬又大视频| 欧美一区二区精品小视频在线| 91麻豆精品激情在线观看国产| 一个人免费在线观看电影 | 国产一级毛片七仙女欲春2| 国产真人三级小视频在线观看| 亚洲国产欧美人成| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 热99re8久久精品国产| 久久人妻av系列| 超碰成人久久| 日本免费一区二区三区高清不卡| 一区福利在线观看| 一个人免费在线观看的高清视频| a在线观看视频网站| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 99国产精品99久久久久| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 在线视频色国产色| 国产精品九九99| 中国美女看黄片| 欧美黄色淫秽网站| 免费在线观看日本一区| 国产精品一区二区精品视频观看| 日韩欧美国产一区二区入口| 国产成年人精品一区二区| 亚洲国产欧美一区二区综合| 99久久综合精品五月天人人| 在线观看舔阴道视频| 一区二区三区高清视频在线| 国产私拍福利视频在线观看| 国产精品 国内视频| 免费看日本二区| 国产探花在线观看一区二区| 手机成人av网站| 日本免费一区二区三区高清不卡| 91麻豆精品激情在线观看国产| 男女之事视频高清在线观看| 无人区码免费观看不卡| 制服人妻中文乱码| 手机成人av网站| 2021天堂中文幕一二区在线观| 亚洲av美国av| 亚洲成人精品中文字幕电影| 俄罗斯特黄特色一大片| 久久性视频一级片| 成人三级做爰电影| 婷婷精品国产亚洲av| 一a级毛片在线观看| 婷婷六月久久综合丁香| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 亚洲中文日韩欧美视频| 悠悠久久av| 亚洲国产欧美人成| 热99re8久久精品国产| 久久久久久久久中文| 亚洲精品在线观看二区| 宅男免费午夜| 中亚洲国语对白在线视频| 色尼玛亚洲综合影院| 天天一区二区日本电影三级| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 国产黄色小视频在线观看| 最新在线观看一区二区三区| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 激情在线观看视频在线高清| av在线蜜桃| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 黄频高清免费视频| 国产麻豆成人av免费视频| 一级毛片高清免费大全| 两个人的视频大全免费| 国产真人三级小视频在线观看| 叶爱在线成人免费视频播放| 99精品久久久久人妻精品| 国产成人av激情在线播放| av福利片在线观看| 国产精品久久久av美女十八| 一个人免费在线观看电影 | 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 国产一级毛片七仙女欲春2| 十八禁网站免费在线| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 99热精品在线国产| 国产午夜福利久久久久久| 1024香蕉在线观看| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 午夜激情福利司机影院| 哪里可以看免费的av片| 精品一区二区三区视频在线 | 日本熟妇午夜| 欧美在线黄色| 亚洲国产欧美一区二区综合| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 国产精品乱码一区二三区的特点| 精品人妻1区二区| 欧美一区二区国产精品久久精品| xxxwww97欧美| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 国内精品美女久久久久久| 亚洲精品美女久久av网站| 亚洲国产精品成人综合色| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 在线观看66精品国产| 亚洲精品在线观看二区| 黄色女人牲交| 亚洲av熟女| 国产av一区在线观看免费| 国产精品1区2区在线观看.| 99re在线观看精品视频| 男女之事视频高清在线观看| 国产精品久久电影中文字幕| 亚洲av五月六月丁香网| 国内揄拍国产精品人妻在线| 香蕉av资源在线| 亚洲中文av在线| 国产亚洲av嫩草精品影院| 久久性视频一级片| 欧美另类亚洲清纯唯美| 欧美日韩精品网址| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 两个人视频免费观看高清| 精品日产1卡2卡| 一个人看视频在线观看www免费 | 日本 av在线| 嫩草影院入口| 日韩欧美在线二视频| 小说图片视频综合网站| 国产精品,欧美在线| 午夜福利视频1000在线观看| 真实男女啪啪啪动态图| 亚洲成人免费电影在线观看| 国产欧美日韩一区二区三| 麻豆av在线久日| 天堂影院成人在线观看| 国产精品久久久久久久电影 | 天天添夜夜摸| 国产 一区 欧美 日韩| 国产三级在线视频| 欧美日韩一级在线毛片| 九九在线视频观看精品| 色播亚洲综合网| 中文字幕av在线有码专区| 久久久成人免费电影| 亚洲人成伊人成综合网2020| ponron亚洲| 国产高清激情床上av| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 啦啦啦韩国在线观看视频| 日本与韩国留学比较| 久久久久久久精品吃奶| xxx96com| 国产高清视频在线播放一区| 国产欧美日韩精品亚洲av| 亚洲欧美日韩高清专用| 一级毛片精品| 国产精品影院久久| 黄色视频,在线免费观看| 欧美3d第一页| www日本在线高清视频| 久久这里只有精品中国| 午夜福利视频1000在线观看| 国内精品久久久久精免费| 91字幕亚洲| 成在线人永久免费视频| 精品久久蜜臀av无| 欧美精品啪啪一区二区三区| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 禁无遮挡网站| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 欧美日本亚洲视频在线播放| cao死你这个sao货| 亚洲天堂国产精品一区在线| 麻豆久久精品国产亚洲av| 国产一区二区激情短视频| 三级毛片av免费| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 18禁国产床啪视频网站| 老司机午夜福利在线观看视频| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 18美女黄网站色大片免费观看| netflix在线观看网站| 黄片小视频在线播放| 色av中文字幕| 国产精品久久久av美女十八| 色视频www国产| 国内精品美女久久久久久| 母亲3免费完整高清在线观看| 91九色精品人成在线观看| 亚洲精品美女久久av网站| 亚洲第一电影网av| 一a级毛片在线观看| 国产视频内射| 成人国产一区最新在线观看| 精品熟女少妇八av免费久了| 人妻夜夜爽99麻豆av| 亚洲精华国产精华精| 又黄又粗又硬又大视频| 久久中文字幕一级| 亚洲成av人片在线播放无| 国产av不卡久久| 级片在线观看| 一区福利在线观看| 女人被狂操c到高潮| 大型黄色视频在线免费观看| 最近在线观看免费完整版| 亚洲专区国产一区二区| 天天躁日日操中文字幕| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 黄色视频,在线免费观看| 国产欧美日韩精品一区二区| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 男女那种视频在线观看| 精品国产美女av久久久久小说| 91麻豆av在线| 国产精品久久久av美女十八| 狂野欧美激情性xxxx| www.自偷自拍.com| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 成人国产一区最新在线观看| 久99久视频精品免费| 不卡av一区二区三区| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 欧美日韩精品网址| 日本熟妇午夜| 久久99热这里只有精品18| 成人性生交大片免费视频hd| 香蕉久久夜色| 在线永久观看黄色视频| 久久久国产成人免费| 国产精品亚洲美女久久久| 久久精品国产清高在天天线| 热99re8久久精品国产| 日韩精品中文字幕看吧| 长腿黑丝高跟| 日本黄色片子视频| 国产亚洲av高清不卡| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 成人亚洲精品av一区二区| 国产极品精品免费视频能看的| 国产精品爽爽va在线观看网站| 夜夜夜夜夜久久久久| 亚洲av五月六月丁香网| 国产精品日韩av在线免费观看| 99久久成人亚洲精品观看| 国产真人三级小视频在线观看| 欧美黄色淫秽网站| 国产极品精品免费视频能看的| 日韩欧美免费精品| 久99久视频精品免费| 给我免费播放毛片高清在线观看| 精品国内亚洲2022精品成人| 国产精品av视频在线免费观看| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 国产精品 欧美亚洲| 亚洲av五月六月丁香网| 黄色女人牲交| 两性夫妻黄色片| 一个人看视频在线观看www免费 | 99在线人妻在线中文字幕| 老司机福利观看| 男人舔女人的私密视频| 丝袜人妻中文字幕| 99久久精品一区二区三区| 日本 av在线| 欧美丝袜亚洲另类 | 搡老妇女老女人老熟妇| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 午夜a级毛片| 两人在一起打扑克的视频| 精品国产亚洲在线| 免费看美女性在线毛片视频| 亚洲人成电影免费在线| 又黄又爽又免费观看的视频| 久久久久久国产a免费观看| 亚洲国产中文字幕在线视频| 全区人妻精品视频| 欧美一区二区国产精品久久精品| 日韩欧美在线二视频| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 亚洲精华国产精华精| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 亚洲av电影不卡..在线观看| 好男人电影高清在线观看| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 国产亚洲精品av在线| 1024香蕉在线观看| 性欧美人与动物交配| 日本黄色视频三级网站网址| 观看美女的网站| 99精品在免费线老司机午夜| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 国产淫片久久久久久久久 | 国产成人精品无人区| 看黄色毛片网站| 国产91精品成人一区二区三区| 精品久久久久久成人av| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 高清毛片免费观看视频网站| 欧美日韩综合久久久久久 | 网址你懂的国产日韩在线| cao死你这个sao货| 九九在线视频观看精品| 最近在线观看免费完整版| 老熟妇仑乱视频hdxx| 久99久视频精品免费| 日韩精品青青久久久久久| 久久这里只有精品19| 精品人妻1区二区| 性欧美人与动物交配| 啦啦啦免费观看视频1| 特大巨黑吊av在线直播| 久久久成人免费电影| 久久人妻av系列| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 国产成人精品久久二区二区免费| 性色av乱码一区二区三区2| 又黄又爽又免费观看的视频| 日韩高清综合在线| 成人av一区二区三区在线看| 99热6这里只有精品| 日本与韩国留学比较| 99久国产av精品| 国产不卡一卡二| 亚洲第一电影网av| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 丁香六月欧美| 免费观看人在逋| 激情在线观看视频在线高清| 亚洲精品久久国产高清桃花| 国产一区二区三区视频了| 午夜精品久久久久久毛片777| 嫩草影视91久久| 夜夜夜夜夜久久久久| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 国产成人啪精品午夜网站| 国产91精品成人一区二区三区| 精品国产乱子伦一区二区三区| 久久精品综合一区二区三区| 国产亚洲精品一区二区www| 欧美日韩乱码在线| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 日本一二三区视频观看| 日韩人妻高清精品专区| 日本黄色片子视频| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 亚洲天堂国产精品一区在线| 国产精品九九99| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 男女之事视频高清在线观看| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 999久久久国产精品视频| 夜夜夜夜夜久久久久| 午夜福利欧美成人| 久久久久精品国产欧美久久久| 国产美女午夜福利| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 婷婷精品国产亚洲av| 又粗又爽又猛毛片免费看| 美女cb高潮喷水在线观看 | 国产成人影院久久av| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 日韩欧美国产一区二区入口| 久9热在线精品视频| 国产精品久久久久久久电影 | 亚洲成av人片免费观看| 不卡av一区二区三区| 国产精品精品国产色婷婷| 国产精品电影一区二区三区| 国产精品一及| 亚洲精品乱码久久久v下载方式 | 岛国视频午夜一区免费看| 蜜桃久久精品国产亚洲av| www日本黄色视频网| 国产成人欧美在线观看| 久久人人精品亚洲av| 亚洲人成伊人成综合网2020| 国产爱豆传媒在线观看| 99在线视频只有这里精品首页| 国产极品精品免费视频能看的| 一本久久中文字幕| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 嫩草影院入口| 国产黄片美女视频| 亚洲国产精品成人综合色| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 十八禁网站免费在线| 黄频高清免费视频| netflix在线观看网站| 1024香蕉在线观看| 亚洲第一电影网av| 久久这里只有精品中国| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 亚洲美女黄片视频| 露出奶头的视频| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 久久这里只有精品中国| 中文在线观看免费www的网站| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 中文在线观看免费www的网站| 热99在线观看视频| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 色在线成人网| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 老熟妇仑乱视频hdxx| 桃红色精品国产亚洲av| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 久久亚洲真实| 色老头精品视频在线观看| 日本a在线网址| 一个人看视频在线观看www免费 | 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 国产精品电影一区二区三区| 天堂√8在线中文| 日韩大尺度精品在线看网址| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 精品久久久久久久久久免费视频| 欧美黄色片欧美黄色片| 91老司机精品| 亚洲av免费在线观看| 久久久久久久久免费视频了| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 久久久精品大字幕| 长腿黑丝高跟| 免费一级毛片在线播放高清视频| 色综合站精品国产| 久久久久久久久中文| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 香蕉久久夜色| а√天堂www在线а√下载| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 免费人成视频x8x8入口观看| 一二三四在线观看免费中文在| a级毛片在线看网站| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 亚洲欧美日韩高清专用| 一进一出抽搐gif免费好疼| 国产精品亚洲av一区麻豆| 国产欧美日韩一区二区三| 亚洲av片天天在线观看| a级毛片在线看网站| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 国产三级黄色录像| h日本视频在线播放| 国产真实乱freesex| 亚洲国产看品久久| 国产1区2区3区精品| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 丰满的人妻完整版| 日韩欧美在线乱码| 国产成人影院久久av| 男女午夜视频在线观看| 国产精品一区二区免费欧美| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 亚洲精品在线美女| 99久国产av精品| 国产av不卡久久| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 国产美女午夜福利| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 国产成人精品久久二区二区免费| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 九九热线精品视视频播放| 在线a可以看的网站| 国产视频内射| 日本精品一区二区三区蜜桃| 国产精品乱码一区二三区的特点| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 美女午夜性视频免费| 国产精品野战在线观看| 欧美日韩乱码在线| av福利片在线观看| 男人和女人高潮做爰伦理| 日韩精品青青久久久久久| 国产91精品成人一区二区三区| 一本精品99久久精品77| 免费高清视频大片| 亚洲无线观看免费| 51午夜福利影视在线观看| 国产精品亚洲一级av第二区| 欧美日韩福利视频一区二区| 此物有八面人人有两片| aaaaa片日本免费| 午夜视频精品福利| 精品国产三级普通话版| 99久久成人亚洲精品观看| 免费高清视频大片| 99精品在免费线老司机午夜| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 综合色av麻豆| 国产成+人综合+亚洲专区| 日韩av在线大香蕉| 欧美三级亚洲精品| 美女 人体艺术 gogo| 一级a爱片免费观看的视频| 99久久成人亚洲精品观看| 亚洲精品美女久久av网站| 91九色精品人成在线观看| 免费搜索国产男女视频| 国产一级毛片七仙女欲春2| 99热6这里只有精品| 国产一区在线观看成人免费| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 久久香蕉国产精品| 不卡av一区二区三区| 俺也久久电影网| 此物有八面人人有两片| 成人亚洲精品av一区二区| 97超视频在线观看视频| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 性色av乱码一区二区三区2| 日本成人三级电影网站| 久99久视频精品免费| 国产精品久久久av美女十八| 天堂影院成人在线观看| 久久精品综合一区二区三区| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 午夜福利视频1000在线观看| 此物有八面人人有两片| 亚洲avbb在线观看| 国产精品一及| 日韩欧美在线乱码| 日本 欧美在线| 日本免费一区二区三区高清不卡| 久久草成人影院| 精品乱码久久久久久99久播|