黃芪桑葉玉竹顆粒對氣陰兩虛型高血糖大鼠早期腎損傷及TGF-β1/P-Smad3/P-Smad7 信號通路的影響

高 晶，劉佳琪，扈覲璽，姜斯佳，馮穎童，王景霞，高學敏

（北京中醫(yī)藥大學，北京 100029）

糖尿病腎?。―N）是糖尿病患者最為常見、且嚴重的慢性微血管并發(fā)癥[1]，而腎纖維化是糖尿病腎病進行性加重的重要因素[2]。腎纖維化本質(zhì)上是一種創(chuàng)傷愈合的動態(tài)性病理進展，與腎臟炎癥損傷、氧化應激、細胞凋亡、細胞外基質(zhì)的過度沉積密切相關(guān)，機制較為復雜，細胞信號通路交互多樣[3]。中醫(yī)治療糖尿病及其并發(fā)癥以整體觀和辨證論治為導向[4-6]。糖尿病腎纖維化當屬消渴腎病范疇。氣陰兩虛證為糖尿病腎病的主要證型[7-8]。黃芪桑葉玉竹顆粒是根據(jù)中醫(yī)辨證理論組成的治療消渴癥的配方，功能益氣養(yǎng)陰，清熱止渴。方中黃芪益氣養(yǎng)陰，生津止渴，桑葉清肺潤燥，養(yǎng)陰生津，共為君藥；葛根健脾益氣，升舉清陽，布散津液，玉竹益胃生津，除消谷善饑，煩熱口渴等中消之癥，二者共為臣藥。蜂膠入脾胃二經(jīng)，補虛化濁，止消渴[9]。諸藥同用，益氣而不溫燥，養(yǎng)陰而不滋膩，相得益彰[10]。本實驗從提前干預，降低并發(fā)癥風險的角度，將黃芪桑葉玉竹顆粒應用于高血糖大鼠，探究黃芪桑葉玉竹顆粒針對糖尿病早期腎纖維化的預防作用，并從TGF-β1/Smads 信號通路探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 雄性SPF 級SD 大鼠48 只，體質(zhì)量（220±20）g，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司[許可證號：SCXK（京）2016-0006]，大鼠維持飼料由北京科澳協(xié)力飼料有限公司提供。斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司提供特殊高脂飼料（鼠維持飼料52.6%、蔗糖15%、蛋黃粉15%、豬油10%、酪蛋白5%、膽固醇1.2%、碳酸氫鈣0.6%、石粉0.4%、膽酸鈉0.2%）。實驗已通過北京中醫(yī)藥大學醫(yī)學與實驗動物倫理委員會審查，符合倫理學要求，審查批號：BUCM-4-2021052405-2038。黃芪桑葉玉竹顆粒：黃芪、桑葉、玉竹、葛根（均購自安徽亳州市京皖中藥飲片廠）、蜂膠粉（浙江江山健康蜂業(yè)有限公司），比例為4:2.5:3:4:0.3。十味消渴膠囊（天津中新藥業(yè)集團股份有限公司，批號：Z19990033）。磷酸酶抑制劑（批號：S1873），RIPA 裂解液（批號：P0013B）購買于上海碧云天生物技術(shù)有限公司，PMSF（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號：P105539），Trise-Base（Biofroxx，批號：1115GR500），以上試劑購買于國藥集團化學試劑有限公司。30%丙烯酰胺（Biosharp， 批 號：BL513b）， 蛋 白marker（10-250KD）（北京海利克思科技有限公司，批號：P12103-2），蛋白marker（20-120KD）（金斯瑞生物科技股份有限公司，批號：M00521），PVDF 膜（0.45 μm）（Millipore，批號：IPVH00010），兔多抗GAPDH（37KD）（杭州賢至生物有限公司，批號：AB-P-R001），兔多抗TGF-β1（44KD）（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，批號：21898-1-AP），兔多抗p-smad3（58KD）（Affinity，批號：AF3362），兔多抗p-smad7（46KD）（Bioss，批號：bs-20024R）。血尿素氮（BUN）試劑盒（批號：20220310），血清肌酐（Scr）試劑盒（批號：20220310），活性氧（ROS）試劑盒（批號：20220310），過氧化氫酶（CAT）試劑盒（批號：20220310），以上試劑盒購買于上海酶聯(lián)生物科技有限公司。BCA 蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：P0010）。臺式高速冷凍離心機（Centrifuge，TY2017005846），渦旋混合器（Servicebio，MX-F），水浴鍋（姜堰市天力醫(yī)療器械廠有限公司，TL-420D），自動洗板機（Rayto，RT3100），全自動研磨儀（Servicebio，KH-III），酶標檢測儀（美國伯滕儀器有限公司，Epoch2C），全自動生化分析儀（深圳雷杜生命科技，Chemray 240），冰凍切片機（Thermo，Cryotome E），成像系統(tǒng)（日本尼康，Nikon DS-U3），切片刀（上海徠卡儀器有限公司，Leica819），正置光學顯微鏡（日本尼康，Nikon Eclipse CI）。

1.2 實驗方法

1.2.1 藥品制備 黃芪桑葉玉竹顆粒的制備：根據(jù)大鼠體質(zhì)量及實驗周期稱量計算好的中藥飲片，將黃芪、桑葉、玉竹、葛根放入鍋中用蒸餾水浸泡2 h，煎煮2次，每次2 h，合并藥液后加熱濃縮，干燥成干膏并打粉，根據(jù)體質(zhì)量和灌胃量與蜂膠粉、蒸餾水混合制得灌胃藥。十味消渴膠囊（陽性藥）灌胃藥制備：適量稱取十味消渴膠囊粉末，倒入燒杯中，加適量蒸餾水（給藥體積為1 mL/100 g），攪拌至藥物溶解。注射用STZ 混懸液制備：用檸檬酸鈉緩沖液（pH 值4.5，0.1 mol/L）配置，現(xiàn)用現(xiàn)配，注射量為1 mL/100 g。注射用T4 制備：根據(jù)大鼠只數(shù)及質(zhì)量，稱取適量L-甲狀腺素鈉（0.2 mg/kg），加入注射用生理鹽水，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 分組及給藥 雄性SD 大鼠48 只，適應性喂養(yǎng)5 d 后，禁食不禁水12 h，于尾靜脈取血檢測大鼠灌胃葡萄糖0 h（即灌胃葡萄糖前）血糖值，再檢測灌胃葡萄糖（2.5 g/kg）后0.5、2 h 大鼠血糖值，將這3 個指標作為本次實驗動物血糖基礎值。以0、0.5 h 血糖水平將48 只大鼠分為6 個組，即空白組、模型組、十味消渴膠囊陽性藥組、黃芪桑葉玉竹顆粒低、中、高劑量組，3 只1 籠，每組8 只。適應性喂養(yǎng)結(jié)束后，連續(xù)30 d 進行大鼠灌胃給藥，給藥體積為1 mL/100 g。空白組大鼠不予給藥，模型組大鼠灌胃等體積生理鹽水，十味消渴膠囊陽性藥組給藥劑量為1.32 g/kg、黃芪桑葉玉竹顆粒低、中、高劑量組灌胃藥物劑量分別為1.25、2.5、7.5 g/kg。

1.2.3 造模方法 建立由高脂飼料喂養(yǎng)、 T4 皮下注射、聯(lián)合STZ 注射造成氣陰兩虛型胰島素抵抗糖脂代謝紊亂大鼠模型，造模方法參考自《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范2003》輔助降血糖功能評價方法。適應性喂養(yǎng)5 d 后，造模30 d。1）各組予維持料飼養(yǎng)1 周后，模型組和十味消渴膠囊陽性藥組更為高熱能飼料繼續(xù)飼喂3 周。2）實驗第21 ～27 天下午于頸部皮下注射T4 混懸液（0.2 mg/kg）。3）實驗第28 天，模型組、十味消渴膠囊陽性藥組禁食24 h（不禁水），第29 天一次性腹腔注射2%STZ 溶液（30 mg/kg），以1 mL/100 g 劑量進行注射。注射后繼續(xù)給予高熱能飼料喂飼5 d，結(jié)束實驗[10-12]。

1.3 樣品的制備與指標檢測 實驗中每周觀察并記錄各組大鼠行為狀態(tài)。在整個實驗周期中，每周稱量1次體質(zhì)量，并記錄下來，按時根據(jù)體質(zhì)量調(diào)整灌胃劑量。在實驗第34 天，取大鼠尾靜脈血，用便攜式血糖檢測儀，檢測大鼠0、0.5、2 h 血糖值，記錄。在實驗第35天晚上，禁食不禁水，第36 天早晨，進行戊巴比妥鈉麻醉大鼠，腹主動脈取血，3 500 r/min，離心10 min，輕輕吸取上層血清，使用戊巴比妥鈉麻醉大鼠，腹主動脈取血，3 500 r/min，離心10 min，取上層血清。采用酶聯(lián)免疫法按照試劑盒說明檢測血清糖化血紅蛋白（GHbA1c）水平，采用比色法在全自動生化儀上測各組大鼠血清中ALB、TP、BUN、Scr、UA 的濃度變化。處死大鼠后，剪開大鼠腹腔，取出胰腺組織，用10%福爾馬林固定液將胰腺組織進行固定、脫水、石蠟包埋，HE 染色。取出腎臟迅速放入凍存管，液氮凍存，保存在-80 ℃冰箱。檢測方法按生化試劑盒說明，采用比色法測各組大鼠腎臟ROS、CAT 含量。采用Western Blot 法檢測大鼠腎臟組織TGF-β1、P-Smad3、P-Smad7表達水平。

1.4 統(tǒng)計學方法 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析使用SAS 9.4 軟件進行。數(shù)值用均值±標準差（±s）表示，進行正態(tài)分布及方差齊性檢驗，單因素方差（Oneway ANOVA）分析用于組間數(shù)據(jù)比較，各組符合方差齊性則采用Levene統(tǒng)計分析；方差不齊則采用Welch統(tǒng)計分析，以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 實驗結(jié)果

2.1 黃芪桑葉玉竹顆粒對氣陰兩虛型高血糖大鼠FBG、GHbA1c 的影響 見表1。

表1 黃芪桑葉玉竹顆粒對氣陰兩虛型高血糖大鼠FBG、GHbA1c 的影響（± s，n = 8）

表1 黃芪桑葉玉竹顆粒對氣陰兩虛型高血糖大鼠FBG、GHbA1c 的影響（± s，n = 8）

注：與空白組比較，# P ＜0.05；與模型組比較，△P ＜0.05

組別 FBG/（mmol/L） GHbA1c/（pg/mL）空白組 4.95±0.43 307.70±41.51模型組 15.99±2.77# 414.08±45.16#陽性藥組 5.64±1.35△ 300.36±44.87△低劑量組 9.65±2.75△ 368.32±43.16△中劑量組 8.50±2.17△ 338.00±35.83△高劑量組 6.79±2.71△ 305.79±18.41△

2.2 胰腺組織HE 染色病理切片 大鼠正常胰腺組織病理切片顯示，胰島呈橢圓形或圓形細胞團，結(jié)構(gòu)整齊，大小不一，大量細胞團分散在胰腺泡中間。胰島界限清晰，細胞大小均勻，排列緊密，形態(tài)飽滿。與正常組比較，模型組大鼠胰島排列稀疏，數(shù)量較少，部分胰島組織萎縮，形狀不規(guī)則，邊界不清，結(jié)構(gòu)混亂。與模型組比較，藥物干預組大鼠胰島及胰島細胞數(shù)量增加，胰島萎縮程度改善，胰島結(jié)構(gòu)更完整，胰島細胞排列更均勻，見圖1。

圖1 黃芪桑葉玉竹顆粒對氣陰兩虛型高血糖大鼠胰腺HE 染色的影響

2.3 黃芪桑葉玉竹顆粒對氣陰兩虛型高血糖病大鼠血清ALB、TP、UA 的影響 與模型組比較，陽性藥組與黃芪桑葉玉竹顆粒低、中、高劑量組大鼠ALB 顯著降低（P＜0.05），陽性藥組與黃芪桑葉玉竹顆粒低、中劑量組大鼠TP 顯著降低（P＜0.05），陽性藥組與黃芪桑葉玉竹顆粒低劑量組大鼠UA顯著降低（P＜0.05）。見表2。

表2 黃芪桑葉玉竹顆粒對氣陰兩虛型高血糖大鼠ALB、TP、UA 的影響（± s，n = 8）

表2 黃芪桑葉玉竹顆粒對氣陰兩虛型高血糖大鼠ALB、TP、UA 的影響（± s，n = 8）

注：與空白組比較，# P ＜0.05；與模型組比較，△P ＜0.05

組別 ALB/（g/L） TP/（g/L） UA/（μmol/L）空白組 27.34±0.67 60.69±1.52 81.25±7.79模型組 30.53±1.21# 63.78±3.13# 94.64±17.76#陽性藥組 27.32±1.00△ 60.87±2.40△ 79.23±13.33△低劑量組 25.73±1.04△ 57.13±1.74△ 76.90±5.64△中劑量組 25.42±1.11△ 56.90±2.15△ 83.33±10.78高劑量組 27.81±1.85△ 61.94±4.15 86.25±7.40

2.4 黃芪桑葉玉竹顆粒對氣陰兩虛型高血糖大鼠血清BUN、Scr 的影響 與模型組比較，陽性藥組與黃芪桑葉玉竹顆粒低、中、高劑量組大鼠血清BUN、Scr 降低（P＜0.05）。見表3。

表3 黃芪桑葉玉竹顆粒對氣陰兩虛型高血糖大鼠血清BUN、Scr 的影響（± s，n = 8）

表3 黃芪桑葉玉竹顆粒對氣陰兩虛型高血糖大鼠血清BUN、Scr 的影響（± s，n = 8）

注：與空白組比較，# P ＜0.05；與模型組比較，△P ＜0.05

組別 BUN/（ng/mL） Scr/（μmol/L）空白組 20.18±1.96 23.43±4.59模型組 25.68±2.21# 51.71±3.13#陽性藥組 21.45±2.07△ 21.35±4.38△低劑量組 20.90±2.20△ 28.36±7.17△中劑量組 20.91±1.82△ 24.15±5.33△高劑量組 20.91±2.19△ 25.20±3.90△

2.5 黃芪桑葉玉竹顆粒對氣陰兩虛型高血糖大鼠腎臟ROS、CAT 的影響 與模型組比較，陽性藥組與黃芪桑葉玉竹顆粒低、中、高劑量組大鼠腎臟ROS 降低（P＜0.05），CAT 升高（P＜0.05）。見表4。

表4 黃芪桑葉玉竹顆粒對氣陰兩虛型高血糖大鼠腎臟ROS、CAT 的影響（± s，n = 8）

表4 黃芪桑葉玉竹顆粒對氣陰兩虛型高血糖大鼠腎臟ROS、CAT 的影響（± s，n = 8）

注：與空白組比較，# P ＜0.05；與模型組比較，△P ＜0.05

組別 ROS/（熒光強度/g） CAT/（U/g）空白組 1 904.75±177.11 212.51±35.54模型組 2 920.38±362.01# 88.70±7.51#陽性藥組 2 286.88±293.55△ 186.56±25.48△低劑量組 2 466.88±207.32△ 193.98±5.80△中劑量組 2 290.00±246.48△ 190.10±18.38△高劑量組 2 041.75±163.81△ 206.11±14.40△

2.6 黃芪桑葉玉竹顆粒對氣陰兩虛型高血糖大鼠腎臟TGF-β1、P-Smad3、P-Smad7 蛋白表達的影響 與空白組相比，模型組大鼠TGF-β1、P-Smad3 蛋白表達顯著升高（P＜0.05），P-Smad7 蛋白表達顯著降低（P＜0.05）。與模型組比較，陽性藥組與黃芪桑葉玉竹顆粒低、中、高劑量組大鼠TGF-β1、P-Smad3 蛋白表達顯著降低（P＜0.05），P-Smad7蛋白表達顯著升高（P＜0.05）。見表5，圖2。

圖2 黃芪桑葉玉竹顆粒對氣陰兩虛型高血糖大鼠TGF-β1、P-Smad3、P-Smad7 蛋白條帶對比圖

表5 黃芪桑葉玉竹顆粒對氣陰兩虛型高血糖大鼠TGF-β1、P-Smad3、P-Smad7 蛋白表達水平的影響（± s，n = 3）

表5 黃芪桑葉玉竹顆粒對氣陰兩虛型高血糖大鼠TGF-β1、P-Smad3、P-Smad7 蛋白表達水平的影響（± s，n = 3）

注：與空白組比較，# P ＜0.05；與模型組比較，△P ＜0.05

組別 TGF-β1 P-Smad3 P-Smad7空白組 0.192±0.039 0.097±0.028 0.539±0.026模型組 0.780±0.079# 0.579±0.028# 0.126±0.014#陽性藥組 0.407±0.020△ 0.275±0.04△ 0.363±0.058△低劑量組 0.665±0.047△ 0.473±0.06△ 0.174±0.020△中劑量組 0.514±0.034△ 0.354±0.045△ 0.278±0.043△高劑量組 0.313±0.038△ 0.176±0.054△ 0.493±0.063△

3 討論

血糖波動、糖脂毒性等因素作用引發(fā)的非特異性炎癥反應、氧化應激是導致胰島β 細胞衰老、凋亡的的重要原因。隨之造成胰島β 細胞功能缺陷是2 型糖尿病的基本病理生理學機制[13]。在本實驗中，與模型組相比，黃芪桑葉玉竹顆粒組氣陰兩虛型糖尿病模型大鼠FBG、GHbA1c顯著降低，胰島萎縮程度有所改善，結(jié)構(gòu)較為完整，表明黃芪桑葉玉竹顆粒可抑制胰島組織損傷且降糖作用顯著。

糖尿病合并早期腎損傷的患者死亡風險顯著增加，平均壽命縮短[14]。而早期腎損傷病程控制和逆轉(zhuǎn)率較高，因此早期發(fā)現(xiàn)并予以有效干預十分重要。糖尿病腎損傷的早期，腎小球和腎小管的功能和結(jié)構(gòu)已發(fā)生改變[15]。Scr、BUN、UA 在一定程度上能夠反映腎損傷和腎小球濾過能力，可以作為評估腎功能是否正常的重要指標[16]。而ALB 與TP 的含量反映了腎小球濾過膜對血漿蛋白的通透性。在本實驗中，與模型組相比，黃芪桑葉玉竹顆粒組大鼠ALB、TP、BUN、Scr、UA顯著降低。表明黃芪桑葉玉竹顆粒對氣陰兩虛高血糖大鼠有腎臟保護作用。

糖尿病引起的氧化損傷與糖代謝紊亂是造成糖尿病腎損傷的重要原因[17]。高血糖可誘導ROS 堆積，發(fā)生氧化應激反應，引起足細胞凋亡和脫落[18-19]，足細胞不能有效覆蓋基底膜，腎小球濾過膜完整性受到破壞，可導致蛋白尿；CAT 等抗氧化酶基因在高糖狀態(tài)下表達下調(diào)，并使其活性基團糖基化，活性降低，自由基清除能力減弱，進一步造成腎小球基底膜損害[20]；同時氧化應激還參與了糖基化終產(chǎn)物增加導致腎臟毛細血管細胞凋亡的過程，以上均導致腎臟組織及功能受到損害[21]。在本實驗中，與模型組相比，黃芪桑葉玉竹顆粒組大鼠ROS 顯著降低，CAT 顯著升高。表明黃芪桑葉玉竹顆粒可改善高血糖誘導的腎臟氧化應激反應，延緩腎功能損害，從而預防糖尿病腎病的發(fā)展。

糖尿病腎損傷進展過程中腎臟纖維化扮演著重要角色，也是導致腎功能障礙和糖尿病腎病患者死亡的主要原因[22]。細胞外基質(zhì)過度沉積為糖尿病腎間質(zhì)纖維化的重要物質(zhì)基礎，TGF-β/Smads 為關(guān)鍵信號通路[23]。TGF-β 為腎纖維化的關(guān)鍵介質(zhì)，它是一種纖維原性細胞因子，可啟動經(jīng)典和非經(jīng)典途徑發(fā)揮多種生物學效應[24]，TGF-β 誘導Smads 磷酸化（P-Smads）而被活化，刺激細胞外基質(zhì)過量生成并抑制降解[25]。TGF-β1/Smad 是反映腎纖維化的基本通路之一[26]。其中Smad3 屬調(diào)節(jié)型受體，Smad7 屬抑制型受體。TGF-β1受體激酶表達增強可促進Smad3 磷酸化生成P-Smad3，而Smad7 則能抑制P-Smad3 的表達，致使細胞核信號通路受到抑制，轉(zhuǎn)錄效應失效，從而影響TGF-β1/Smad 通路[27]，繼而減輕腎組織纖維化程度。在纖維形成的過程中，Smad3 和Smad7 之間的平衡偏移導致肌成纖維細胞蓄積和活化，使細胞外基質(zhì)過度生成，加劇腎纖維化[28-29]。在本實驗中，與模型組相比，黃芪桑葉玉竹顆粒組大鼠TGF-β1、P-Smad3顯著降低，P-Smad7 顯著升高。說明黃芪桑葉玉竹顆粒通過調(diào)節(jié)TGF-β/P-Smad 信號通路來減輕高血糖誘導的糖尿病大鼠腎臟損壞程度，抑制腎纖維化的發(fā)生，進而防治糖尿病腎病的發(fā)展。

綜上所述，黃芪桑葉玉竹顆粒不僅可以調(diào)節(jié)大鼠糖脂代謝紊亂、氧化應激等水平，還可保護高血糖所致的早期腎損傷，其作用機制可能與調(diào)控TGF-β1/Smads 通路有關(guān)。