體液因子及其相關(guān)miRNA 與慢性阻塞性肺疾病合并外周骨骼肌功能障礙的關(guān)系

那媛媛，劉朝暉，趙祝香，徐慧，梁志科，汪新龍

數(shù)據(jù)顯示，截至2015年，我國40歲以上人群慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary diseases，COPD）發(fā)病率已達(dá)14%；2019年全球確診COPD患者例數(shù)較1990年增加了85%［1］。隨著病情進(jìn)展，COPD患者體質(zhì)量及肌肉耐力不斷下降，運(yùn)動能力不斷變差，從而引起一系列級聯(lián)反應(yīng)；而外周骨骼肌功能障礙（peripheral skeletal muscle dysfunction，PSMD）作為COPD最常見的一種合并癥，是預(yù)測COPD患者預(yù)后的一個關(guān)鍵指標(biāo)，且COPD患者一旦發(fā)生PSMD，其預(yù)后不良［2］。目前評估COPD患者合并PSMD的方法主要為CT檢查和MRI檢查，其可以直觀地測量患者的肌肉面積和觀察肌肉形態(tài)，且診斷準(zhǔn)確性高，但CT檢查具有輻射性，對幼兒和妊娠期婦女危害較大；而MRI檢查費(fèi)用高昂，且具有檢查時間長、檢查條件嚴(yán)苛的特點(diǎn)，不適用于危重癥患者［3］。因而尋找有效且方便無創(chuàng)的COPD合并PSMD的診療手段是非常有必要和有意義的。

研究發(fā)現(xiàn)，COPD患者肌肉中的蛋白質(zhì)合成和降解均受到相關(guān)體液因子包括肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2（myocyte enhacer factor 2，MEF2）、胰島素樣生長因子1（insulin-like growth factor 1，IGF-1）、組蛋白去乙?；福╤istone deacetylase，HDAC）4和血清應(yīng)答因子（serum response factor，SRF）等的調(diào)控［4-7］。miRNA是一種長度約為22個核苷酸的非編碼單鏈RNA，其依靠內(nèi)源性基因編碼，主要生物學(xué)功能是調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄；在人類基因組中，共有1 700多種miRNA，且越來越多的miRNA被確定在人類的肌肉形成、發(fā)育和肌肉萎縮的損傷修復(fù)中起關(guān)鍵作用［8］，這為miRNA成為治療COPD合并PSMD的新靶點(diǎn)提供了依據(jù)。本研究旨在分析體液因子（MEF2A、IGF-1、HDAC4、SRF）及其相關(guān)miRNA與COPD合并PSMD的關(guān)系，以期為尋找更多COPD合并PSMD的治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)時間 本實(shí)驗(yàn)時間為2021年12月至2022年9月。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物 健康雄性C57BL/6小鼠11只（廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供），8～10周齡，體質(zhì)量為20～25 g。將小鼠飼養(yǎng)于12 h光照/12 h黑暗、溫度控制在26 ℃、溫差不高于3 ℃、濕度為40%～70%的無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級別的環(huán)境中，自由飲水和攝食，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始動物實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)廣州醫(yī)科大學(xué)動物倫理委員會審批通過（倫理批號：2022102）。

1.3 主要實(shí)驗(yàn)試劑和儀器 紅梅牌香煙（烤煙型，焦油量：1 3 m g）購自云南紅塔集團(tuán)有限公司，MEF2A抗體（批號：AF6381）購自美國Affinity公司，IGF-1抗體（批號：BS6817）、HDAC4抗體（批號：BS6486）、SRF抗體（批號：BS9121）購自Bioworld Technology公司，HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（批號：GB23303）、HRP標(biāo)記的驢抗山羊IgG二抗（批號：GB23304）、HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG二抗（批號：GB23301）、HRP標(biāo)記的山羊抗大鼠IgG二抗（批號：GB23302）、有機(jī)玻璃染毒箱（120 cm×80 cm×80 cm）購自湖南省凱達(dá)生物科技有限公司，DSI Buxco PFT動物肺功能檢測系統(tǒng)購自美國DSI公司，ECL化學(xué)發(fā)光液購自美國Bio-Rad公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù)方法 將11只健康雄性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為對照組（n=6）與模型組（n=5）。對照組小鼠自由進(jìn)食和飲水，不做任何處理。模型組小鼠采用煙熏法構(gòu)建COPD合并PSMD模型，具體方法如下：將小鼠置于有機(jī)玻璃染毒箱內(nèi)，點(diǎn)燃10支紅梅牌香煙進(jìn)行煙熏，30 min/次，2次/d，兩次間隔時間至少為4 h，連續(xù)干預(yù)6個月。

1.4.2 觀察小鼠大體情況 實(shí)驗(yàn)期間，觀察小鼠的呼吸（有無咳嗽、氣急、喘鳴等）、毛發(fā)（光澤度及脫落情況）、飲水和進(jìn)食情況、活潑度以及對外界刺激的反應(yīng)情況。分別測量兩組小鼠干預(yù)0、1、2、3、4、5、6個月時的體質(zhì)量。

1.4.3 檢測小鼠肺功能指標(biāo) 干預(yù)6個月后，采用1%戊巴比妥鈉（100 mg/kg）腹腔注射以麻醉小鼠，采用DSI Buxco PFT動物肺功能檢測系統(tǒng)檢測肺功能指標(biāo)，包括50毫秒用力呼氣容積（forced expiratory volume in 50 millisecond，F(xiàn)EV50）/用力肺活量（forced vital capacity，F(xiàn)VC）、每分通氣量（minute ventilation，MV）、氣道阻力（airway resistance，AR）、動態(tài)肺順應(yīng)性（dynamic lung compliance，Cdyn）、吸氣峰流量（peak inspiratory flow，PIF）、呼氣峰流量（peak expiratory flow，PEF）。

1.4.4 小鼠胸大肌標(biāo)本的收集 完成肺功能指標(biāo)檢測后采用頸椎脫臼法處死各組小鼠，在小鼠胸骨左側(cè)第3、4肋間沿胸大肌邊緣做一長為1 cm左右的切口，鈍性分離皮下組織達(dá)深筋膜淺面，向兩側(cè)適當(dāng)分離皮瓣，銳性打開深筋膜，暴露胸大肌后將其剪下。將一部分胸大肌組織立即放入液氮內(nèi)凍存，另一部分胸大肌組織置于4%甲醛溶液中保存。

1.4.5 HE染色檢測小鼠胸大肌組織肌纖維數(shù)量、肌纖維總面積、橫切肌纖維平均面積 取4%甲醛溶液中的小鼠胸大肌組織，進(jìn)行脫水、石蠟包埋、切片處理，之后進(jìn)行HE染色，采用中性樹膠封固，使用CaseViewer 2.2軟件掃描切片并截取3張400倍視野的截圖，采用Image-Pro Plus 6.0軟件計(jì)數(shù)3個視野中肌纖維數(shù)量、肌纖維總面積，并計(jì)算橫切肌纖維平均面積（橫切肌纖維平均面積=肌纖維總面積/肌纖維數(shù)量）。

1.4.6 Western blot法檢測小鼠胸大肌組織中MEF2A、IGF-1、HDAC4、SRF表達(dá)水平 取50 mg液氮內(nèi)凍存的小鼠胸大肌組織，解凍，用冷卻過的PBS沖洗干凈，然后裝入勻漿管內(nèi)，添加已經(jīng)被蛋白酶抑制劑裂解過的裂解液進(jìn)行勻漿，再將勻漿管放入冰上裂解0.5 h，震蕩數(shù)次，直至組織完全被裂解；在4 ℃條件下將裂解組織以12 000 r/min的速率離心10 min（離心半徑10 cm），取上清液，分離出實(shí)驗(yàn)所需要的小鼠胸大肌總蛋白溶液，采用100 ℃金屬浴加熱5 min以變性，進(jìn)行SDS-PAGE，終止電泳后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜（轉(zhuǎn)膜條件為300 mA恒流轉(zhuǎn)膜0.5 h），快速涮洗轉(zhuǎn)印完的膜，室溫下封閉30 min，加入MEF2A、IGF-1、HDAC4、SRF抗體進(jìn)行孵育，用TBST清洗3次、5 min/次，加入二抗（1∶5 000稀釋）后室溫下孵育30 min，用TBST清洗3次、5 min/次，在暗室中加入ECL化學(xué)發(fā)光液進(jìn)行充分反應(yīng)，然后進(jìn)行壓片、顯影、曝光，從而分析目標(biāo)蛋白表達(dá)水平。

1.4.7 預(yù)測Mef2a、Igf-1、Hdac4、Srf基因的miRNA使用R語言multiMiR軟件包預(yù)測Mef2a、Igf-1、Hdac4、Srf基因的miRNA；選取預(yù)測出的最相關(guān)的1%的miRNA，并使用Cytoscape 3.8.2軟件繪制mRNA-miRNA網(wǎng)絡(luò)圖；選擇Mef2a、Igf-1、Hdac4、Srf 4個基因中有交集的miRNA進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.4.8 qPCR法檢測小鼠mmu-miR-466I-3p、mmumiR-705表達(dá)水平 取小鼠胸大肌組織50 mg，提取總RNA，并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，采用qPCR法檢測mmu-miR-466I-3p、mmu-miR-705表達(dá)水平。PCR條件：95 ℃10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，共40個循環(huán)，72 ℃30 s。mmu-miR-466l-3p的上游引物為：5'-ACACT CCAGCTGGGATACACACACACATAC-3'，下游引物為：5'-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGT TGAGTAGTGTGT-3'；mmu-miR-705的上游引物為：5'-ACACTCCAGCTGGGGGTGGGAGGTGGGG-3'，下游引物為：5'-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCA ATTCAGTTGAGTGCCCACC-3'；內(nèi)參U6的上游引物為：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物為：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以（±s）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠大體情況 干預(yù)前，兩組小鼠均比較健康，飲水與進(jìn)食正常，活潑好動，毛發(fā)有光澤，沒有咳嗽或打噴嚏等癥狀。干預(yù)過程中，模型組小鼠逐漸出現(xiàn)食欲不振，毛發(fā)逐漸失去光澤且顏色發(fā)黃，精神萎靡，活動量明顯減少，部分小鼠出現(xiàn)了打噴嚏癥狀；且煙熏時小鼠喜歡扎堆，倦怠蜷縮，出汗明顯，腹部脹大，呼吸急促，出現(xiàn)點(diǎn)頭運(yùn)動甚至張口呼吸。干預(yù)0、1個月時，對照組和模型組小鼠體質(zhì)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；干預(yù)2、3、4、5、6個月時，模型組小鼠體質(zhì)量低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 對照組和模型組小鼠不同時間點(diǎn)體質(zhì)量比較（±s，g）Table 1 Comparison of body mass between control group and model group at different time points

表1 對照組和模型組小鼠不同時間點(diǎn)體質(zhì)量比較（±s，g）Table 1 Comparison of body mass between control group and model group at different time points

組別只數(shù)干預(yù)0個月干預(yù)1個月干預(yù)2個月干預(yù)3個月干預(yù)4個月干預(yù)5個月干預(yù)6個月對照組623.8±0.525.5±1.730.1±1.831.2±1.832.2±1.532.2±1.432.7±1.0模型組523.7±1.024.1±1.425.4±1.625.9±1.525.9±1.525.5±1.126.0±1.6 t值0.2011.3764.1264.8936.3747.7047.715 P值0.8480.2020.0030.001＜0.001＜0.001＜0.001

2.2 肺功能指標(biāo) 模型組小鼠FEV50/FVC低于對照組，MV、Cdyn小于對照組，AR大于對照組，PIF、PEF慢于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 對照組和模型組小鼠肺功能指標(biāo)比較（±s）Table 2 Comparison of lung function indexes between control group and model group

表2 對照組和模型組小鼠肺功能指標(biāo)比較（±s）Table 2 Comparison of lung function indexes between control group and model group

注：FEV50=50毫秒用力呼氣容積，F(xiàn)VC=用力肺活量，MV=每分通氣量，AR=氣道阻力，Cdyn=動態(tài)肺順應(yīng)性，PIF=吸氣峰流量，PEF=呼氣峰流量；1 cm H2O=0.098 kPa

組別只數(shù)5022）PEF（ml/s）對照組60.46±0.1027.98±2.130.65±0.140.05±0.021.04±0.0421.97±1.04模型組50.33±0.0523.62±0.741.13±0.070.03±0.010.96±0.0414.51±3.92 t值2.8534.332-6.8512.7823.3914.140 P值0.0240.002＜0.0010.0340.0080.011

2.3 小鼠胸大肌組織肌纖維數(shù)量、肌纖維總面積、橫切肌纖維平均面積 模型組小鼠胸大肌組織肌纖維數(shù)量少于對照組，肌纖維總面積、橫切肌纖維平均面積小于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表3、圖1。

表3 對照組和模型組小鼠胸大肌組織肌纖維數(shù)量、肌纖維總面積、橫切肌纖維平均面積比較（±s）Table 3 Comparison of the number of muscle fibers，the total area of muscle fibers and the average area of cross-cut muscle fibers in pectoralis major muscle tissue of mice between control group and model group

表3 對照組和模型組小鼠胸大肌組織肌纖維數(shù)量、肌纖維總面積、橫切肌纖維平均面積比較（±s）Table 3 Comparison of the number of muscle fibers，the total area of muscle fibers and the average area of cross-cut muscle fibers in pectoralis major muscle tissue of mice between control group and model group

組別只數(shù) 肌纖維數(shù)量（根）肌纖維總面積（mm2）橫切肌纖維平均面積（mm2/根）對照組661.4±12.00.08±0.010.002 2±0.000 8模型組548.8±19.60.07±0.010.001 5±0.000 5 t值-2.281-4.561-3.124 P值0.029＜0.0010.004

2.4 小鼠胸大肌組織中MEF2A、IGF-1、HDAC4、SRF表達(dá)水平 對照組和模型組小鼠胸大肌組織中MEF2A、HDAC4、SRF表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；模型組小鼠胸大肌組織中IGF-1表達(dá)水平高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表4。

表4 對照組和模型組小鼠胸大肌組織中MEF2A、IGF-1、HDAC4、SRF表達(dá)水平比較（±s）Table 4 Comparison of expression levels of MEF2A，IGF-1，HDAC4 and SRF in pectoralis major muscle tissue of mice between control group and model group

表4 對照組和模型組小鼠胸大肌組織中MEF2A、IGF-1、HDAC4、SRF表達(dá)水平比較（±s）Table 4 Comparison of expression levels of MEF2A，IGF-1，HDAC4 and SRF in pectoralis major muscle tissue of mice between control group and model group

注：MEF2=肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2，IGF-1=胰島素樣生長因子1，HDAC4=組蛋白去乙酰化酶4，SRF=血清應(yīng)答因子

組別只數(shù)MEF2AIGF-1HDAC4SRF對照組60.84±0.33 0.62±0.21 0.65±0.27 0.35±0.26模型組51.03±0.44 0.91±0.17 0.84±0.08 0.52±0.15 t值-0.823-2.272-1.554-1.261 P值0.4310.0340.1560.240

2.5 Mef2a、Igf-1、Hdac4、Srf基因的miRNA 沒有預(yù)測到任何關(guān)于Igf-1基因的miRNA，而可預(yù)測到較多關(guān)于Mef2a、Hdac4、Srf基因的miRNA。選取最相關(guān)的1%的miRNA，結(jié)果顯示，Mef2a、Hdac4、Srf基因的miRNA數(shù)目分別為7、33、16個，Mef2a、Srf基因共同受mmu-miR-466l-3p調(diào)控，Mef2a、Hdac4基因共同受mmu-miR-705調(diào)控。

2.6 小鼠mmu-miR-466I-3p、mmu-miR-705表達(dá)水平 對照組和模型組小鼠mmu-miR-466I-3p、mmu-miR-705表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表5。

表5 對照組和模型組小鼠mmu-miR-466I-3p、mmu-miR-705表達(dá)水平比較（±s）Table 5 Comparison of the expression levels of mmu-miR-466I-3p and mmu-miR-705 in mice between control group and model group

表5 對照組和模型組小鼠mmu-miR-466I-3p、mmu-miR-705表達(dá)水平比較（±s）Table 5 Comparison of the expression levels of mmu-miR-466I-3p and mmu-miR-705 in mice between control group and model group

組別只數(shù)mmu-miR-466I-3p mmu-miR-705對照組61.17±0.702.79±2.46模型組51.47±0.683.88±2.03 t值-0.732-0.793 P值0.4950.451

3 討論

目前全球COPD發(fā)病率和死亡率均在逐年攀升，隨著年齡增長，患者活動受限，蛋白質(zhì)分解增加，導(dǎo)致營養(yǎng)不良，同時大量使用類固醇類藥物等會引起PSMD；且COPD合并PSMD的病因復(fù)雜，慢性心功能不全、慢性腎功能不全、惡性腫瘤、結(jié)核、代謝性疾?。ㄈ缣悄虿?、甲狀腺功能亢進(jìn)）等均可導(dǎo)致PSMD［8］。COPD合并PSMD的機(jī)制與肌肉蛋白質(zhì)合成減少和分解增多導(dǎo)致機(jī)體蛋白質(zhì)平衡被打破有關(guān)［9］。而在許多疾病中，肌肉蛋白質(zhì)合成和降解均受到相關(guān)體液因子包括MEF2A、IGF-1、HDAC4、SRF等的調(diào)控［10］。此外，包括miRNA調(diào)控在內(nèi)的表觀遺傳事件已成為COPD合并PSMD的研究熱點(diǎn)。研究顯示，骨骼肌中大量表達(dá)的miRNA可以作為診斷COPD合并PSMD的分子標(biāo)志物［11-12］。本研究旨在分析MEF2A、IGF-1、HDAC4、SRF及其相關(guān)miRNA與COPD合并PSMD的關(guān)系。

研究顯示，COPD合并PSMD患者不僅表現(xiàn)為氣促、咳嗽、呼吸困難等，還會出現(xiàn)肺功能異常，同時也會出現(xiàn)軀體總質(zhì)量下降、骨骼肌萎縮，在分子層面上表現(xiàn)為骨骼肌相關(guān)蛋白質(zhì)合成減少、降解增加［13］。本研究結(jié)果顯示，干預(yù)過程中，模型組小鼠逐漸出現(xiàn)食欲不振，毛發(fā)逐漸失去光澤且顏色發(fā)黃，精神萎靡，活動量明顯減少，部分小鼠出現(xiàn)了打噴嚏癥狀；且煙熏時小鼠喜歡扎堆，倦怠蜷縮，出汗明顯，腹部脹大，呼吸急促，出現(xiàn)點(diǎn)頭運(yùn)動甚至張口呼吸；干預(yù)2、3、4、5、6個月時，模型組小鼠體質(zhì)量小于對照組；模型組小鼠FEV50/FVC低于對照組，MV、Cdyn小于對照組，AR大于對照組，PIF、PEF慢于對照組；模型組小鼠胸大肌組織肌纖維數(shù)量少于對照組，肌纖維總面積、橫切肌纖維平均面積小于對照組；提示COPD合并PSMD模型構(gòu)建成功。

COPD合并PSMD患者的主要表現(xiàn)是機(jī)體骨骼肌發(fā)生器質(zhì)性和功能性改變。MEF2屬于有絲分裂阻滯缺陷蛋白（mitotic arrest deficient，MAD）家族成員，是一種轉(zhuǎn)錄因子，其主要作用是調(diào)控肌肉發(fā)育過程［14］。IGF-1主要來源于肝細(xì)胞，其不僅可以調(diào)控肝細(xì)胞的功能，還可以調(diào)控一些其他組織如骨骼肌、心肌、腦的功能［10］。HDAC是細(xì)胞內(nèi)重要的一種蛋白，其可以調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄，即協(xié)同組蛋白乙酰化酶（histone acetyltransferase，HAT）使蛋白乙酰化和去乙?；_(dá)到動態(tài)平衡，從而維持基因轉(zhuǎn)錄的穩(wěn)定性［15］。在有脊椎動物中，HDAC分為四種亞型，即HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC4，目前研究最多的亞型是HDAC4，其主要作用是調(diào)控機(jī)體內(nèi)的葡萄糖代謝和脂類代謝，抑制葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4（glucose transporter 4，GLUT 4）和肉毒堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶1（carnitine palmitoyl transferase 1，CPT1）基因轉(zhuǎn)錄，從而抑制骨骼肌、心臟及大腦等的功能［16］。研究顯示，HDAC4可抑制卵泡抑素的表達(dá)，而卵泡抑素有拮抗肌肉細(xì)胞生成的作用，可導(dǎo)致肌肉質(zhì)量的損失［17］。SRF是MAD轉(zhuǎn)錄因子家族一員，其在生物體的生長發(fā)育和信號傳導(dǎo)中發(fā)揮著重要作用，如調(diào)控骨骼肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞或平滑肌細(xì)胞中的基因轉(zhuǎn)錄［18］。本研究結(jié)果顯示，模型組小鼠胸大肌組織中IGF-1表達(dá)水平高于對照組，提示COPD合并PSMD可能與IGF-1表達(dá)水平升高有關(guān)，分析原因?yàn)椋篊OPD合并PSMD時，機(jī)體為了代償，會產(chǎn)生更多的IGF-1來修復(fù)肌肉損傷［16］。但本研究結(jié)果還顯示，對照組和模型組小鼠胸大肌組織中MEF2A、HDAC4、SRF表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，分析原因可能與本研究樣本量較小或者實(shí)驗(yàn)重復(fù)次數(shù)不足有關(guān)，尚需要大樣本量的研究進(jìn)一步證實(shí)。

目前關(guān)于COPD合并PSMD相關(guān)miRNA的研究大多集中在少數(shù)幾個miRNA，如miR-1、miR-133、miR-206等，在龐大的miRNA家族里，應(yīng)該可以挖掘出更多可以作為COPD合并PSMD診斷和治療靶點(diǎn)的miRNA［19］。本研究選擇MEF2A、SRF、HDAC4和IGF-1 4個肌肉萎縮相關(guān)分子進(jìn)行溯源，即檢索Mef2a、Igf-1、Hdac4、Srf基因的miRNA，結(jié)果顯示，沒有預(yù)測到任何關(guān)于Igf-1基因的miRNA，而可預(yù)測到較多關(guān)于Mef2a、Hdac4、Srf基因的miRNA；選取最相關(guān)的1%的miRNA，結(jié)果顯示，Mef2a、Hdac4、Srf基因的miRNA數(shù)目分別為7、33、16個，Mef2a、Srf基因共同受mmu-miR-466l-3p調(diào)控，Mef2a、Hdac4基因共同受mmu-miR-705調(diào)控。進(jìn)一步比較對照組和模型組小鼠mmu-miR-466I-3p、mmu-miR-705表達(dá)水平，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示mmu-miR-466I-3p、mmu-miR-705與COPD合并PSMD可能無關(guān)，也可能與multiMiR軟件包內(nèi)所收集數(shù)據(jù)有限有關(guān)。

綜上所述，IGF-1與COPD合并PSMD可能有關(guān)，而MEF2A、SRF、HDAC4與COPD合并PSMD可能無關(guān)，且調(diào)控Mef2a、Hdac4、Srf基因的mmu-miR-466I-3、mmu-miR-705與COPD合并PSMD可能無關(guān)。但本研究尚存在一定局限性：（1）樣本量較小，未來可以考慮增加樣本量以減少隨機(jī)誤差；（2）雖然人和小鼠的基因有很大的同源性，但COPD合并PSMD患者與COPD合并PSMD模型小鼠依然存在很大區(qū)別，除了物種不同，前者還常受到外界環(huán)境、醫(yī)療干預(yù)等的影響。

作者貢獻(xiàn)：那媛媛、劉朝暉進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計(jì)；那媛媛進(jìn)行研究的實(shí)施與可行性分析、數(shù)據(jù)收集、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，撰寫論文；趙祝香進(jìn)行數(shù)據(jù)整理；徐慧、梁志科、汪新龍進(jìn)行結(jié)果的分析與解釋；劉朝暉對文章整體負(fù)責(zé)，監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。