RNA 甲基化修飾在肺動脈高壓中作用機制研究進展

陳婷珍，劉佩本，李艷秀，左祥榮

肺高血壓（pulmonary hypertension，PH）目前被定義為靜息時肺動脈平均壓（mean pulmonary artery pressure，mPAP）＞20 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）［1］。肺動脈高壓（pulmonary arterial hypertension，PAH）是PH分類中的第一大類，其以肺動脈平滑肌細胞（pulmonary artery smooth muscle cells，PASMCs）異常增殖和內(nèi)皮細胞分泌功能紊亂導致的管壁增厚、肺血管重構為病理特征，而不可逆的肺血管重構和肺動脈壓持續(xù)升高會進一步導致右心衰竭，從而導致患者死亡［2-3］。PAH的發(fā)病機制復雜，目前關于PAH的治療主要為擴張肺血管，但研究報道，經(jīng)積極治療的PAH患者的5年生存率為70%左右，且治療費用昂貴、臨床預后差［4］。大量臨床前研究重點關注抗炎、抑制PASMCs增殖、促PASMCs凋亡及免疫調(diào)節(jié)等機制以尋求PAH的精準治療方案，但在臨床上仍未取得突破性進展［5］。因此，進一步闡明PAH的細胞分子機制，進而尋找潛在的特異性治療靶點是當前學術界關注的熱點。

RNA甲基化修飾作為表觀遺傳學修飾領域調(diào)控轉(zhuǎn)錄后基因表達的關鍵過程，可廣泛參與真核細胞生物的生命活動，并作為各種生物生長發(fā)育過程的關鍵調(diào)節(jié)因子，在不改變基因序列的情況下其可通過調(diào)控甲基的可逆修飾而影響細胞內(nèi)的基因表達［6］。大量研究表明，RNA甲基化修飾在腫瘤、心血管疾病、代謝性疾病等疾病的發(fā)生發(fā)展中起著關鍵的調(diào)節(jié)作用，其已成為未來治療這些疾病的潛在靶點［7-12］。近年來有關RNA甲基化修飾在PAH發(fā)病中的作用也逐漸引起國內(nèi)外學者的重視［13-14］。本文旨在探討RNA甲基化修飾在PAH發(fā)生發(fā)展中的作用機制，以期為RNA表觀遺傳學在PAH中的機制研究、精準治療以及預后判斷提供新思路。

1 RNA甲基化修飾概述

1.1 RNA甲基化修飾的種類和作用 RNA修飾是一種轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控方式，其廣泛分布在包括信使RNA（messenger RNA，mRNA）、轉(zhuǎn)運RNA（transfer RNA，tRNA）、核糖體RNA（ribosomal RNA，rRNA）、長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）和微小RNA（microRNA，miRNA）在內(nèi)的150多種RNA上。1974年，N6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenosine，m6A）修飾首次在細胞mRNA上被發(fā)現(xiàn)，其是mRNA中豐度最高的甲基化修飾形式，被認為是目前最普遍、最豐富的一種RNA修飾方式，在多種生物的生長發(fā)育及代謝過程中發(fā)揮著重要的生物學作用［15-16］。m6A失調(diào)可能會導致炎癥、心血管疾病、腫瘤、免疫系統(tǒng)疾病的發(fā)生［17-18］。除此之外，非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA）的m6A在細胞的生理功能中也起著關鍵作用，約67%的mRNA的m6A峰3'-UTR有ncRNA的結合位點［19］。除m6A外，RNA甲基化修飾還包括N1-甲基腺嘌呤（N1-methyladenosine，m1A）、5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，m5C）和7-甲基鳥苷（7-methylguanosine，m7G）修飾。作為新型RNA甲基化修飾，m5C修飾和m7G修飾的作用也在mRNA及ncRNA中被證實，二者均可調(diào)節(jié)RNA轉(zhuǎn)錄、翻譯、出核及穩(wěn)定性等［20-22］，且在細胞增殖分化、細胞凋亡、應激等生物學功能中起著關鍵作用［23］。

1.2 m6A修飾主要蛋白及其功能 m6A修飾主要蛋白有三類：甲基轉(zhuǎn)移酶（Writers）可以催化m6A的發(fā)生；去甲基化酶（Erasers）可以催化去甲基化過程；甲基識別蛋白（Readers）通過直接或間接與甲基化位點結合而促進翻譯表達。

1.2.1 Writers Writers 主要包括甲基轉(zhuǎn)移酶樣3（methyltransferase-like 3，METTL3）、甲基轉(zhuǎn)移酶樣14（methyltransferase-like 14，METTL14）、Wilm腫瘤1相關蛋白（Wilms tumor 1-associated protein，WTAP）。METTL3作為第一個被發(fā)現(xiàn)的Writers，以S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl methionine，SAM）作為甲基供體的催化亞基，但其與METTL14一起成體系才有活性［24］。METTL14主要起支撐、穩(wěn)定復合物的作用，并能夠識別特定的5'-RRACH-3'序列，將其作為催化底物［25］。一項來自斑馬魚的研究表明，WTAP為Writers中唯一沒有催化活性的亞基，其能夠?qū)TAPMETTL3-METTL14復合物募集并錨定到富含mRNA前體加工因子的核斑點，該核斑點是m6A動態(tài)調(diào)節(jié)的發(fā)生部位，WTAP在RNA選擇性剪接和基因表達中至關重要［26］。

1.2.2 Erasers Erasers包括脂肪量和肥胖相關蛋白（fat mass and obesity-associated protein，F(xiàn)TO）和AlkB同源蛋白5（AlkB homolog 5，ALKBH5）。FTO與核斑點標志分子SC35和轉(zhuǎn)錄酶RNA PolⅡ有共定位，并可募集到核斑點擦除mRNA上的m6A修飾位點。ALKBH5屬于α-酮戊二酸鹽依賴型雙加氧酶，其表達下調(diào)后細胞質(zhì)中的mRNA表達降低，m6A明顯升高，其有催化Erasers活性并調(diào)控mRNA輸出和RNA代謝的作用［25］。

1.2.3 Readers Readers主要有YTH結構域蛋白家族（YTH domain family protein，YTHDF）1、YTHDF2、YTHDF3、YT512-同源結構域蛋白（YT512-B homology domaincontaining protein，YTHDC）1、YTHDC2、異質(zhì)核糖核蛋白（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein，HNRNP）家族、胰島素樣生長因子2 mRNA結合蛋白（insulin-like growth factor 2 binding protein，IGF2BP）1、IGF2BP2、IGF2BP3等［26-27］。其中YTHDF1具有募集翻譯的起始復合物以促進翻譯的作用，且YTHDF1和YTHDF2、YTHDF3均具有運輸mRNA、促進RNA降解的作用［28］。此外，YTHDF2還可以促進mRNA的剪切。YTHDC1主要與mRNA的可變剪切和核轉(zhuǎn)運作用有關［29-30］。此外，YTHDC1還可以迅速結合ncRNA如X染色體失活特異轉(zhuǎn)錄子（X-inactive specific transcript，XIST）、富核轉(zhuǎn)錄因子1（nuclear enriched abundant transcript 1，NEAT1）和肺腺癌轉(zhuǎn)移相關轉(zhuǎn)錄子1（metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1）上的m6A位點，進而介導ncRNA的m6A修飾［31］。YTHDC2可結合的m6A位點較少，通常以選擇性結合的方式與甲基化位點結合并促進mRNA翻譯。有研究表明，YTHDC2可以通過招募5'-3'的外切核糖核酸酶Xrn1而促進RNA降解［32］。HNRNP家族主要起識別功能，HNRNPA2/B1被報道可識別初級miRNA的m6A， 修飾從而促進其加工［33］。除此之外，IGF2BP1、IGF2BP2、IGF2BP3也可識別m6A修飾并通過m6A修飾依賴而促進mRNA的穩(wěn)定和翻譯作用［34］。

綜上，m6A修飾主要通過Writers、Erasers、Readers動態(tài)調(diào)控mRNA的轉(zhuǎn)錄、翻譯、剪接、折疊、降解和輸出，進而在基因表達和各種生命活動中發(fā)揮關鍵作用［35］。

2 m6A修飾在PAH中的作用機制

2.1 Writers主要蛋白METTL3和Readers主要蛋白YTHDF在PAH中的作用機制 m6A修飾在PAH發(fā)生發(fā)展中的作用已引起許多學者的關注，其中Writers主要蛋白METTL3在PAH中的作用研究得最為深入。為了探討低氧導致的PAH中m6A修飾的變化，XU等［36］檢測了新生SD大鼠PAH模型中總m6A修飾以及Writers主要蛋白的變化，結果發(fā)現(xiàn)，總m6A修飾沒有明顯變化，但除了WTAP表達無差異外，其他Writers主要蛋白表達均下調(diào)；然后通過RNA甲基化免疫共沉淀高通量測序（methylated RNA immunoprecipitation sequencing，MeRIPseq）和基因本體（gene ontology，GO）技術分析得出，PAH的發(fā)展可能與低氧導致的METTL3持續(xù)低表達影響了PAH血管相關基因的m6A修飾有關。該研究揭示了m6A修飾可能是調(diào)節(jié)低氧導致的PAH和肺發(fā)育關鍵基因表觀遺傳修飾的一種生物標志物，且m6A修飾可能是PAH潛在的治療靶點。然而，m6A修飾與PAH之間的具體調(diào)控機制以及如何通過調(diào)控m6A修飾來治療PAH仍需要進一步探索。QIN等［37］通過體內(nèi)外實驗發(fā)現(xiàn)，低氧誘導的PASMCs異常增殖和成年大鼠PAH模型中m6A修飾和METTL3表達升高，被閱讀蛋白YTHDF2識別后促進其關鍵靶基因PTEN的降解，從而促進PASMCs增殖和遷移，提示METTL3可能通過影響PASMCs的功能而調(diào)控PAH。該研究不僅證實了m6A修飾通過調(diào)控PASMCs增殖和遷移來導致PAH，而且進一步表明了Writers主要蛋白METTL3作為PAH中m6A修飾潛在治療靶點的可能性及其機制。

同時，METTL3失調(diào)介導的PASMCs異常增殖和血管重構過程中Readers主要蛋白YTHDF的作用也引起了關注。HU等［38］在多種PAH模型中發(fā)現(xiàn)總m6A修飾、YTHDF1表達水平升高，并首次驗證了YTHDF1通過促進黑色素瘤抗原家族D1（melanoma antigen family D1，MAGED1）的翻譯而促進PASMCs增殖和肺血管重構，從而導致PAH的發(fā)生發(fā)展，且METTL3也參與了這一過程。以上研究表明，METTL3和YTHDF的相互作用可能在PAH的m6A修飾中起著重要作用，但這種作用還需要進一步研究驗證。

綜上所述，METTL3在被YTHDF識別后介導PASMCs異常增殖和肺血管重構的具體機制可能為通過靶向調(diào)控m6A修飾來治療PAH提供了最有前途和吸引力的方法。

2.2 Writers和Readers的其他蛋白在PAH中的作用機制METTL14作為另一個比較重要的Writers的主要蛋白，在PAH發(fā)生中至關重要。ZHOU等［39］研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠PAH模型和PASMCs中m6A修飾、METTL14和YTHDF2表達增加，而特異性敲除PASMCs中的Setd2可降低METTL14表達水平，逆轉(zhuǎn)低氧導致的右心室收縮壓、平均動脈壓及mPAP升高，提示Setd2和METTL14是防治PAH及保護右心功能的靶點，但具體機制還有待進一步探究。LIU等［40］研究也發(fā)現(xiàn)，PAH患者和小鼠PAH模型肺組織中總m6A修飾和METTL14表達水平升高，并通過m6A-RIP首次發(fā)現(xiàn)YTHDF2可通過調(diào)節(jié)METTL14與GRAP的結合、抑制RAS/ERK信號通路而抑制PASMCs的過度增殖和遷移，進而減輕PAH。該研究第一次突出了甲基化修飾GRAP的功能，為以METTL14/YTHDF2/GRAP軸為靶點治療PAH提供了依據(jù)。更重要的是，這兩項研究不僅更新了研究者對除METTL3外的甲基化轉(zhuǎn)移酶調(diào)控PASMCs增殖在PAH中的作用的認識，也為尋找新的治療PAH的表觀遺傳學靶點提供了充分的證據(jù)。

除此之外，CHEN等［41］研究發(fā)現(xiàn)，肺動脈中METTL14表達水平升高可導致血管鈣化，這為探索METTL14治療PAH機制研究提供了新的思路和研究方向。雖然目前關于WTAP在PAH發(fā)生發(fā)展中作用的研究相對較少，但其作用不容忽視。XIN等［42］首次提出，WTAP介導的谷胱甘肽過氧化物酶4的m6A修飾會觸發(fā)PASMCs中的鐵死亡和肺纖維化，但其介導的m6A修飾在PAH形成中的具體作用尚不清楚。

2.3 Erasers在PAH中的作用機制 既往研究顯示，大鼠PAH模型中FTO和ALKBH5表達水平降低［36-37，41］。ZENG等［43］通過GO功能富集分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TO和ALKBH5可能通過調(diào)節(jié)炎癥、糖酵解相關基因和血小板衍生生長因子（platelet-derived growth factor，PDGF）信號通路相關基因等的表達而參與PAH的發(fā)生。目前關于FTO和ALKBH5介導m6A修飾而參與PAH的研究尚淺，但其潛在的研究價值和臨床意義卻見微知著。MATHIYALAGAN等［44］研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TO過表達能抑制心肌纖維化并促進血管生成，但FTO表達升高能否促進PAH血管新生還需要進一步驗證。這也意味著FTO和ALKBH5調(diào)控PAH的機制研究空間非常大，深入研究FTO和ALKBH5表達降低是否參與調(diào)控PASMCs增殖和遷移是PAH治療的新靶點。

2.4 ncRNA m6A修飾在PAH中的作用機制 除mRNA外，ncRNA也含有豐富的m6A修飾。lncRNA和miRNA在肺血管重塑中至關重要［45-46］。目前關于ncRNA m6A修飾的研究大多聚焦于腫瘤的發(fā)生，對PAH的關注較少。2020年，SU等［47］首次揭示環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）即circXpo6和circTmtc3的m6A修飾降低會通過circRNA-miRNA-mRNA表達網(wǎng)絡而促進PASMCs增殖，這為ncRNA m6A修飾在PAH中的機制研究提供了新的思路和方向。一項研究提示，HNRNPA2/B1可能通過與lncRNA/miRNA/mRNA相互作用、促進PASMCs表型轉(zhuǎn)換而在PAH中發(fā)揮作用［13］，但該結論仍需要進一步研究驗證。

3 m5C修飾在PAH中的作用機制

與m6A修飾類似，m5C修飾也主要依賴Writers、Erasers及Readers的調(diào)節(jié)而發(fā)揮生物學功能，如調(diào)節(jié)mRNA的轉(zhuǎn)運、RNA的穩(wěn)定性、翻譯、線粒體活性等［48］。m5C修飾的Writers主要有NOL1/NOP2/sun（NSUN）甲基轉(zhuǎn)移酶和DNA甲基轉(zhuǎn)移酶類似物DNMT2；m5C修飾的Readers主要有Aly/REF輸出因子（Aly/REF export factor，ALYREF）和Y-框結合蛋白1（Y-box bindingprotein 1，YBX1）；m5C修飾的Erasers指10-11易位蛋白（ten-eleven translocation，TET）1、TET2、TET3［49］。

HIRAIDE等［50］報道，145例日本PAH患者中TET2突變的頻率較高。此外，POTUS等［51］研究發(fā)現(xiàn)，0.39%的PAH患者有12個TET2突變，且TET2基因敲除小鼠會發(fā)生不良肺血管重構和炎癥，并發(fā)展為PAH。不同種族PAH患者白細胞甲基轉(zhuǎn)移酶和去甲基化酶的表達存在差異，并且與PAH嚴重程度相關：西班牙裔/非洲裔美國PAH患者DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1和TET2、TET3的表達水平高于高加索PAH患者，肺毛細血管楔壓也更高［52］。

4 m7G修飾在PAH中的作用機制

作為新型RNA甲基化修飾，m7G修飾在PAH中的研究較少，但已經(jīng)得到學者的關注。研究顯示，m7G修飾基因表達與PAH的發(fā)生有關［53］。m7G修飾在真核生物mRNA中是帶正電荷的5'帽修飾，同時也普遍存在于rRNA、tRNA和lncRNA中，WANG等［54］研究發(fā)現(xiàn)，大鼠PAH模型中l(wèi)ncRNA m7G修飾降低，并首次進行全轉(zhuǎn)錄組分析，結果顯示，上調(diào)的m7G lncXR_591973和m7G lncXR_592398可能參與PAH的血管平滑肌收縮過程。這為lncRNA m7G修飾在PAH中作用的潛在分子機制的研究提供了新方向。此外，WANG等［55］在PAH患者與正常人肺組織中篩選出15種m7G修飾差異基因，通過聚類分析發(fā)現(xiàn)，鑒定出的3個PAH新型診斷基因——CYFIP1、EIF4E、IFIT5在多種免疫細胞（如活化的CD4+T淋巴細胞、調(diào)節(jié)性T淋巴細胞、輔助型T淋巴細胞2或CD56自然殺傷細胞、骨髓來源的抑制性細胞和單核細胞）中的表達水平存在差異。提示PAH和腫瘤同樣需要免疫細胞創(chuàng)造的炎癥微環(huán)境，這或許與血管重塑過程有關，這為進一步研究m7G修飾作為PAH治療靶點提供了新的方向。

5 小結與展望

PAH被認為是一種特殊的“心血管癌癥”，患者5年生存率低，其發(fā)病機制復雜，目前藥物治療效果有限、不良反應多且治療費用高昂。隨著醫(yī)療及科研技術的發(fā)展，RNA甲基化修飾不僅開辟了表觀遺傳修飾調(diào)控PAH研究的新領域，且多項研究提示RNA甲基化修飾可通過多種作用機制促進PAH的發(fā)生發(fā)展，其中Writers、Erasers及Readers在PAH動物模型中加重或緩解肺血管重塑和右心室肥厚的作用機制正逐漸被揭示，尤其是m6A修飾中的METTL3。RNA甲基化修飾及其蛋白在PAH中的主要作用見表1。未來靶向調(diào)控m6A修飾有望成為治療PAH的新靶點。

未來有很多潛在價值較大的蛋白和機制值得深入探究。首先，Erasers中的FTO和ALKBH5盡管在腫瘤、代謝性疾病中的研究較為深入，但目前其在PAH中的研究還有待進一步拓展；其次，對于PAH中m5C修飾的研究目前僅停留在臨床研究方面；最后，m7G修飾在PAH中的作用機制成為新的研究熱點，但目前還需要深入探討其具體的作用機制，才能更全面地揭示RNA甲基化修飾在PAH發(fā)生發(fā)展中的作用及尋找潛在的治療靶點。

作者貢獻：陳婷珍、劉佩本進行文章的構思與設計，論文撰寫；陳婷珍、劉佩本、李艷秀進行資料收集；陳婷珍進行資料整理；李艷秀進行論文的修訂；左祥榮負責文章的質(zhì)量控制及審校，對文章整體負責、監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。