ANKRD13A在肝癌組織中的表達(dá)及對其生物學(xué)行為的影響

生 禹 吳書楨 葛思佳 陳 婧 劉肇修 黃 偉 陸翠華

原發(fā)性肝癌是我國第4位常見的惡性腫瘤及第2位的腫瘤致死病因,包括肝細(xì)胞癌、肝內(nèi)膽管癌和混合型肝細(xì)胞癌-膽管癌3種病理學(xué)類型,其中肝細(xì)胞癌(簡稱肝癌)占75%～85%[1,2]。我國每年新發(fā)的肝癌數(shù)量占全球肝癌發(fā)病數(shù)的一半以上,由于肝癌早期診斷較為困難,絕大多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時已處于肝癌進(jìn)展期甚至已經(jīng)有其他臟器的受累,這進(jìn)一步導(dǎo)致肝癌的預(yù)后不佳[3,4]。因此,深入研究肝癌發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制,尋找有效的預(yù)防和治療的措施,是當(dāng)前肝癌研究的熱點(diǎn)和關(guān)鍵點(diǎn)。

ANKRD13家族包括ANKRD13A、13B和13D,該蛋白家族分子結(jié)構(gòu)中含有多個高度保守的泛素相互作用基序(ubiquitin-interacting motif,UIM)。研究表明,ANKRD13A可通過其UIM結(jié)構(gòu)域與一些內(nèi)吞蛋白相互作用,從而阻止后者內(nèi)化,在miR-204介導(dǎo)下ANKRD13A可抑制晶狀體上皮細(xì)胞的遷移[5～7]。ANKRD13A與卵巢癌患者的預(yù)后有著顯著的相關(guān)性,但是ANKRD13A在肝癌發(fā)生、發(fā)展過程中的作用及分子機(jī)制鮮見報道[8]。本研究旨在探討ANKRD13A在肝癌組織中的表達(dá)情況以及對肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響以及可能的分子機(jī)制,以期為肝癌的臨床診斷及治療提供新思路。

材料與方法

1.一般資料:選取南通大學(xué)附屬醫(yī)院2012年1月～2021年5月收集的肝癌組織和相對應(yīng)的癌旁組織(n=20)。由南通大學(xué)附屬醫(yī)院研制了含有106例肝癌樣本的人體組織芯片。所有樣本均來自于手術(shù)切除,所有組織術(shù)后均經(jīng)病理確認(rèn)。本研究通過筆者醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會審查(倫理學(xué)審批號:2015-045),所有患者均知情同意。

2.細(xì)胞培養(yǎng)及傳代:人肝癌細(xì)胞株SMMC- 7721來源于中國科學(xué)院細(xì)胞庫(上海),將肝癌細(xì)胞按要求放入含10%-胎牛血清的培養(yǎng)基(DMEM)中培養(yǎng),置入恒溫培養(yǎng)箱,每2天換液1次,待細(xì)胞融合至70%～80%時進(jìn)行細(xì)胞傳代,取對數(shù)期的細(xì)胞用于后續(xù)試驗。

3.細(xì)胞轉(zhuǎn)染:過表達(dá)質(zhì)粒和對照質(zhì)粒購自武漢淼靈生物科技有限公司。根據(jù)試劑說明書用Lipofectamine 2000將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到目標(biāo)細(xì)胞系中,48h后棄除轉(zhuǎn)染液使用正常培養(yǎng)基培養(yǎng),并用嘌呤霉素篩選轉(zhuǎn)染過表達(dá)ANKRD13A質(zhì)粒和空載質(zhì)粒的SMMC-7721細(xì)胞10～14天,成功構(gòu)建含目標(biāo)質(zhì)粒的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系。

4.免疫組織化學(xué)染色(IHC):組織固定后包埋,制作連續(xù)切片(厚4μm),然后用二甲苯脫蠟,抗原修復(fù),接著加入ANKRD13A一抗抗體,置入4℃冰箱過夜,加入二抗,室溫烘烤30min后PBS洗滌3次,二氨基聯(lián)苯胺顯色10min,蘇木精復(fù)染,顯微鏡拍照。根據(jù)陽性染色強(qiáng)度和腫瘤細(xì)胞染色比例進(jìn)行評分(0分: 0～5%,1分: 6%～30%,2分: 31%～70%, 3分:>71%)。Thomas綜合計分法計算結(jié)果:0～7 分為陰性表達(dá)(-),8～12 分為陽性表達(dá)(+)。

5.Western blot法檢測:收取各組細(xì)胞,肝癌和癌旁組織分別加入等比例的RIPA 裂解液,提取總蛋白,調(diào)整好上樣量,SDS-PAGE電泳分離后轉(zhuǎn)印至PVDF膜上,使用5%脫脂牛奶封閉2h后,加入ANKRD13A、ERK1/2、p-ERK1/2、MEK、p-MEK一抗置入4℃冰箱敷育過夜,后取出用PBS清洗,加入IgG二抗室溫敷育2h,繼續(xù)用PBS清洗,應(yīng)用顯影液避光顯影, 凝膠成像系統(tǒng)曝光拍照,并通過ImageJ軟件進(jìn)行量化。

6.實(shí)時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測: 將TRIzol試劑1ml分離加入已稱量好的肝癌組織和癌旁組織(100mg)靜置10min,再加入氯仿200μl,振蕩混勻后,12000r/min離心15min,取上清液加入等體積的異丙醇,混勻后再次離心去下層沉淀,用乙醇洗滌后,加入DEPC溶解,分光光度計測量RNA濃度。將1μg的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,進(jìn)行PCR擴(kuò)增。ANKRD13A上游引物:5′-TGCACCTCCTAGTCTGGAAAA-3′,下游引物:5′-AGATGCAATAATGTTCGACCTCG-3′。ETS上游引物:5′-GTGGCCAGGAGATGGGGAAA-3′,下游引物:5′-CATGGCGTGCAGCTCTTCAG-3′。c-Myc上游引物:5′-CGTCTCCACACATCAGCACAA-3′,下游引物:5′-CACTGTCCAACTT GACCCCTCTTG-3′。Elk-1上游引物:5′-TCCCTGCTTCCTACGCATACA-3′,下游引物:5′-GCTGCCACTGGATGGAAACT-3′。內(nèi)參18S上游引物:5′-CGCCGCTAGAGGTGAAATTC-3′,下游引物:5′-CCAGTCGGCATCGTTTATGG-3′。反應(yīng)條件:95℃ 5min, 95℃ 10s, 60℃ 30s, 40 個循環(huán)。每個樣本重復(fù) 3 次,計算平均值,所有步驟均符合MIQE規(guī)則。

7.CCK-8實(shí)驗:將各組別的細(xì)胞以 5000 個/孔接種于 96 孔板中,分別培養(yǎng) 0、24、48、72h,在對應(yīng)的時間點(diǎn)向每孔中分別加入 10μl CCK-8試劑,置入恒溫培養(yǎng)箱避光孵育2h后,取出培養(yǎng)板放置于酶標(biāo)儀檢測450nm處的吸光度(A)值。

8.Transwell實(shí)驗:在各組別的細(xì)胞分別計數(shù)兩萬個重懸于200μl無血清的培養(yǎng)基(DMEM)中,加入到預(yù)選準(zhǔn)備的小室上室中,將含 10%胎牛血清的600μl培養(yǎng)基添加到下室,置入恒溫培養(yǎng)箱敷育48h后,取出小室使用多聚甲醛固定,結(jié)晶紫染色,后于顯微鏡下計數(shù)遷移到濾膜下的腫瘤細(xì)胞。

9.劃痕愈合實(shí)驗:將各組別的細(xì)胞接種于6孔板中,置入恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng),后取出6孔板棄出培養(yǎng)基,用200μl的槍頭垂直于6孔板作直線劃痕,分別于劃痕后0h和24h拍攝所劃區(qū)域細(xì)胞遷移圖像,記錄分析比較各組之間的差異。

結(jié) 果

1.ANKRD13A在肝癌組織中低表達(dá):與對應(yīng)的癌旁組織比較,ANKRD13A在肝癌組織中的表達(dá)水平顯著降低(圖1中A～C)。進(jìn)一步根據(jù)ANKRD13A在肝癌組織芯片中的染色情況,將患者分為高表達(dá)組(n=27)和低表達(dá)組(n=72),分析ANKRD13A蛋白的表達(dá)水平與患者臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性。統(tǒng)計分析顯示,ANKRD13A蛋白的表達(dá)水平與患者的BCLC分期(P=0.001)以及是否存在肝硬化(P=0.003)顯著相關(guān),而與患者的年齡、性別、甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)水平、乙型肝炎病毒表面抗原(hepatitis B virus surface antigen,HBsAg)以及有無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等臨床病理參數(shù)無顯著相關(guān)(表1)。同時,在CPTAC數(shù)據(jù)庫中分析發(fā)現(xiàn),與癌旁組織比較,ANKRD13A蛋白在肝癌組織中的表達(dá)水平顯著降低(P<0.001),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(圖1D)。以上結(jié)果提示,在肝癌的發(fā)生、發(fā)展過程中,ANKRD13A蛋白可能發(fā)揮了重要的抑制作用。

圖1 ANKRD13A在肝癌組織中低表達(dá)A.Western blot法檢測ANKRD13A蛋白在3例肝癌組織和癌旁組織中的表達(dá)差異;B.RT-qPCR檢測ANKRD13A mRNA在30例肝癌組織和癌旁組織中表達(dá)差異;C.ICH檢測ANKRD13A蛋白在肝癌組織和癌旁組織中的表達(dá)情況;D.ANKRD13A蛋白在CPTAC數(shù)據(jù)庫中的表達(dá)情況。GAPDH為內(nèi)參

表1 ANKRD13A蛋白的表達(dá)水平與患者臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性

2.過表達(dá)ANKRD13A可顯著抑制肝癌細(xì)胞在體外的增殖和遷移活力:為了進(jìn)一步探究ANKRD13A對肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響,本研究構(gòu)建了穩(wěn)定過表達(dá)ANKRD13A或?qū)φ召|(zhì)粒的SMMC-7721細(xì)胞系(圖2A)。通過CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗發(fā)現(xiàn),在SMMC-7721細(xì)胞中過表達(dá)ANKRD13A可顯著抑制細(xì)胞的體外增殖活力(圖2B)。同時,通過細(xì)胞劃痕愈合實(shí)驗和Transwell遷移實(shí)驗發(fā)現(xiàn),過表達(dá)ANKRD13A也可顯著抑制肝癌細(xì)胞的體外遷移能力(圖2中C～F)。以上結(jié)果表明,在體外細(xì)胞模型中,過表達(dá)ANKRD13A可顯著抑制肝癌細(xì)胞的增殖和遷移能力。

圖2 過表達(dá)ANKRD13A可抑制肝癌細(xì)胞在體外的增殖和遷移能力A.Western blot法驗證成功構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)ANKRD13A和對照質(zhì)粒的SMMC-7721細(xì)胞系;B.CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗探究過表達(dá)ANKRD13A后對SMMC-7721細(xì)胞增殖活性的影響;C、D.細(xì)胞劃痕實(shí)驗探究過表達(dá)ANKRD13A后對SMMC-7721細(xì)胞遷移速度的影響;E、F.Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗探究過表達(dá)ANKRD13A后對SMMC-7721細(xì)胞遷移能力的影響。GAPDH為內(nèi)參,*P<0.01,**P<0.001

3.過表達(dá)ANKRD13A 可抑制肝癌細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的生長:為了進(jìn)一步驗證ANKRD13A 對肝癌細(xì)胞增殖能力的影響,將過表達(dá)ANKRD13A 或?qū)φ战M的SMMC-7721細(xì)胞注射到裸鼠皮下(圖3A),每周測量裸鼠皮下腫瘤的體積,4周后處死裸鼠并取出腫瘤組織進(jìn)行稱量,結(jié)果顯示,過表達(dá)ANKRD13A組裸鼠皮下腫瘤的生長速度以及腫瘤重量和體積均較對照組顯著降低(圖3中B、C)。將取出的腫瘤組織進(jìn)一步進(jìn)行增殖細(xì)胞相關(guān)的核抗原ki-67染色,結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對照組比較,過表達(dá)ANKRD13A組腫瘤細(xì)胞的ki-67染色減弱(圖3D)。以上結(jié)果表明,過表達(dá)ANKRD13A可顯著抑制腫瘤細(xì)胞在小鼠體內(nèi)的增殖。

圖3 過表達(dá)ANKRD13A可顯著抑制肝癌細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的生長能力A.左圖為裸鼠皮下成瘤的大體圖像;左側(cè)為對照組,右側(cè)為過表達(dá)ANKRD13A組;右圖為裸鼠腫瘤的大體圖像:上一排為對照組,下一排為過表達(dá)ANKRD13A組;B.腫瘤重量;C.腫瘤體積;D.兩組裸鼠皮下腫瘤切片的ki-67染色。*P<0.05

4.ANKRD13A可能通過抑制MEK磷酸化發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng):細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)信號通路是絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)家族中的一條信號通路,包括ERK1和ERK2兩個重要成員。ERK1/2受上游特異性刺激分子MEK1/2的雙磷酸化而激活,磷酸化的ERK1/2形成二聚體,從細(xì)胞質(zhì)移位到細(xì)胞核,進(jìn)而磷酸化一系列下游轉(zhuǎn)錄因子,例如c-Myc、stat、SAP-1等,從而調(diào)控細(xì)胞周期和生存等過程[9]。本研究中,為了初步探究ANKRD13A調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的可能分子機(jī)制,筆者利用Western blot法檢測了ERK1/2信號通路相關(guān)蛋白的活化水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn),過表達(dá)ANKRD13A可抑制肝癌細(xì)胞中ERK1/2的磷酸化水平,并且可顯著抑制其上游MEK1/2蛋白的磷酸化水平(圖4A)。同時,通過RT-qPCR實(shí)驗發(fā)現(xiàn),ERK1/2信號通路的下游轉(zhuǎn)錄因子c-Myc、Elk-1、ETS的表達(dá)水平也顯著降低(圖4B)。既往研究表明,在腫瘤相關(guān)疾病中,MEK信號通路參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力。例如,MEK抑制劑曲美替尼能夠降低甲狀腺癌的增殖能力,并且對非小細(xì)胞肺癌有一定的治療效果[10]。本研究發(fā)現(xiàn),過表達(dá)ANKRD13A可顯著抑制肝癌細(xì)胞中MEK1/2的磷酸化水平,從而影響其下游的ERK1/2的磷酸化以及細(xì)胞核中轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá),但是有關(guān)ANKRD13A抑制MEK1/2磷酸化的分子機(jī)制有待于進(jìn)一步探究。

圖4 在肝癌細(xì)胞中ANKRD13A可能通過抑制MEK1/2磷酸化發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)A.Western blot法檢測p-MEK1/2、MRK1/2、p-ERK1/2、ERK1/2的表達(dá)水平;B.RT-qPCR檢測ERK1/2下游轉(zhuǎn)錄因子c-Myc、Elk-1、ETS等的表達(dá)水平變化。GAPDH為內(nèi)參,*P<0.001

討 論

肝癌是一種高度惡性腫瘤,其發(fā)病機(jī)制一直是臨床研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)[11]。肝癌的高度侵襲性與肝癌細(xì)胞的增殖和遷移能力密切相關(guān)[12]。因此尋找一個早期的診斷指標(biāo)和新的治療靶點(diǎn)尤為重要。

ANKRD13A是表皮生長因子受體相互作用蛋白,其可通過自身分子結(jié)構(gòu)域C端的3個錨蛋白重復(fù)序列與相關(guān)細(xì)胞膜上配體激活的泛素化EGF受體部分結(jié)合來調(diào)節(jié)細(xì)胞表面物質(zhì)的內(nèi)吞反應(yīng),從而進(jìn)一步介導(dǎo)相關(guān)蛋白質(zhì)之間的相互作用[13]。同時ANKRD13A可以誘導(dǎo)束狀肌動蛋白的分解,微管的徑向分布和脂肪酸分布以及細(xì)胞黏附性的增加,其在細(xì)胞骨架和脂肪組織中起著關(guān)鍵作用[7]。腫瘤細(xì)胞的形成與細(xì)胞遷移和增殖有著密不可分的關(guān)系,而ANKRD13A在一定程度上可以調(diào)控相關(guān)細(xì)胞的遷移。研究發(fā)現(xiàn),ANKRD13A參與了急性白血病的發(fā)生、發(fā)展,其在該類腫瘤的形成過程中發(fā)揮重要作用[14]。但ANKRD13A在肝癌中的發(fā)生機(jī)制尚不明確,因此本文對ANKRD13A的相關(guān)分子機(jī)制進(jìn)行研究。

Ras-MEK通路是癌細(xì)胞生物學(xué)中特征最為明顯的激酶級聯(lián)反應(yīng)之一,它是由生長因子中的致癌激酶的激活突變觸發(fā)的,在幾種癌癥的發(fā)生、發(fā)展和維持中發(fā)揮著核心作用,包括黑色素瘤、胰腺癌、肺癌、結(jié)腸直腸癌和乳腺癌。既往還有研究報道,該通路在肝癌中特異性上調(diào),并且通過細(xì)胞表面受體和細(xì)胞質(zhì)信號產(chǎn)生的增殖信號傳遞到細(xì)胞核,從而驅(qū)動癌細(xì)胞增殖和進(jìn)展[15]。

本研究發(fā)現(xiàn),過表達(dá)ANKRD13A可顯著降低MEK1/2的磷酸化水平,并且抑制其下游轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平。因此,筆者猜測在肝癌細(xì)胞中,ANKRD13A可能通過抑制MEK1/2的磷酸化,進(jìn)而抑制細(xì)胞的增殖與遷移能力。本研究通過比較30例肝癌患者的癌組織和癌旁組織中ANKRD13A的mRNA水平,發(fā)現(xiàn)ANKRD13A在癌旁組織中的表達(dá)水平顯著高于癌組織。并且發(fā)現(xiàn)在癌組織中,其蛋白水平也顯著降低。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),過表達(dá)ANKRD13A可顯著抑制肝癌細(xì)胞的增殖與遷移能力。以上結(jié)果提示,ANKER13A在肝癌的發(fā)生、發(fā)展過程中具有重要的抑制作用。然而本實(shí)驗存在一定的不足,僅初步發(fā)現(xiàn)ANKRD13A可以調(diào)控MEK1/2的磷酸化,并影響其下游分子,但是否存在與之相互作用分子共同調(diào)節(jié)該通道的具體機(jī)制仍值得深入探討。

綜上所述,本研究表明,ANKRD13A可能通過抑制MEK1/2的磷酸化,進(jìn)而抑制肝癌細(xì)胞的增殖與遷移能力,在肝癌的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮了重要的抑制作用。本研究有望為肝癌發(fā)病機(jī)制的研究及肝癌治療靶點(diǎn)的研發(fā)提供新思路。