三七總皂苷通過(guò)抑制檳榔堿誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞鐵死亡減輕口腔黏膜下纖維化*

鄒紅， 孫宇婕， 趙晨曦， 張馨月， 胡亮， 謝璐， 文禮湘， 唐群， 胡立娟

三七總皂苷通過(guò)抑制檳榔堿誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞鐵死亡減輕口腔黏膜下纖維化*

鄒紅， 孫宇婕， 趙晨曦， 張馨月， 胡亮， 謝璐， 文禮湘， 唐群△， 胡立娟△

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410208）

探討三七總皂苷（PNS）是否通過(guò)調(diào)控鐵死亡減輕檳榔堿（ANE）誘導(dǎo)的口腔黏膜下纖維化（OSF），并初步研究其機(jī)制。采用ANE作用于人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞系HaCaT構(gòu)建OSF模型，設(shè)置空白組，模型組（50 mg/L ANE），低、中、高劑量（12.5、25和50 mg/L）PNS組，以及l(fā)iproxstatin-1（鐵死亡抑制劑）組，共計(jì)6組。光鏡觀察HaCaT細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化；CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力；Western blot檢測(cè)細(xì)胞中I型膠原（Col-I）、溶質(zhì)載體家族7成員11（SLC7A11）和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶4（GPX4）的蛋白表達(dá)水平；透射電鏡觀察細(xì)胞線粒體形態(tài)學(xué)變化；FerroOrange熒光探針檢測(cè)細(xì)胞Fe2+水平；DCFH-DA熒光探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）含量；比色法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽（GSH）含量。與空白組比較，模型組HaCaT細(xì)胞多數(shù)呈長(zhǎng)梭形，纖維化樣外觀，貼壁不牢靠，形態(tài)學(xué)改變顯著，電鏡下線粒體雙層膜密度增加，嵴顯著減少，呈典型的鐵死亡表現(xiàn)，Col-I蛋白表達(dá)增加，GPX4和SLC7A11蛋白表達(dá)降低，F(xiàn)e2+和ROS水平升高，GSH含量降低（均<0.05）；與模型組相比，低、中、高劑量PNS組細(xì)胞多數(shù)恢復(fù)圓潤(rùn)，呈上皮細(xì)胞樣，線粒體膜密度減小，嵴數(shù)目增加，形態(tài)趨于正常，Col-I蛋白表達(dá)減少，ROS水平下降，GSH含量升高（均<0.05）；與模型組相比，中、高劑量PNS組GPX4和SLC7A11蛋白表達(dá)顯著上升，F(xiàn)e2+含量顯著降低（均<0.05）；liproxstatin-1組細(xì)胞和線粒體形態(tài)及各指標(biāo)水平與高劑量PNS組相比無(wú)顯著差異（均>0.05）。PNS可通過(guò)抑制ANE誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞鐵死亡減輕OSF。

口腔黏膜下纖維化；鐵死亡；三七總皂苷

口腔黏膜下纖維化（oral submucous fibrosis， OSF）是以黏膜下組織炎癥，膠原代謝異常與慢性的進(jìn)行性纖維化為特征的口腔黏膜疾?。?］，OSF癌變率為7%～13%［2］。OSF發(fā)病具有顯著的地域性，多見于咀嚼檳榔流行的亞洲東部與東南部［3］，有數(shù)據(jù)表明，超過(guò)90%的OSF患者顯示是檳榔咀嚼者［4］，提示咀嚼檳榔與OSF有關(guān)，而檳榔主要活性物質(zhì)是檳榔堿（arecoline， ANE）［5］。隨著咀嚼檳榔人群的擴(kuò)大，其對(duì)公共衛(wèi)生提出了一定挑戰(zhàn)。

鐵死亡（ferroptosis）是一種公認(rèn)的細(xì)胞死亡方式，以游離鐵的蓄積和毒性脂質(zhì)過(guò)氧化物的積累為重要標(biāo)志。許多器官纖維化損傷與鐵死亡有關(guān)。研究表明，鐵死亡與心、肝、肺、腎的纖維化關(guān)聯(lián)密切；纖維化是大多慢性炎癥的最終結(jié)局，表現(xiàn)為組織內(nèi)實(shí)質(zhì)細(xì)胞減少，但細(xì)胞外基質(zhì)卻異常增多并沉積；鐵死亡主要造成上皮細(xì)胞損傷，并且隨后釋放促纖維化介質(zhì)誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞增生和間質(zhì)結(jié)締組織沉積［6］。

三七總皂苷（saponins， PNS）是三七的主要活性成分，具有豐富的藥理活性和潛在的藥用前景，具有緩解炎癥、抗氧化應(yīng)激和抗纖維化等作用［7］。研究顯示，PNS可通過(guò)抑制鐵死亡而產(chǎn)生減輕缺血再灌注損傷的效果［8］，其主要成分可通過(guò)抑制HK-2細(xì)胞鐵死亡緩解器官損傷［9］，還可用于抗肝、腎纖維化，維持肝臟與腎臟的正常功能［10］，但對(duì)于PNS是否通過(guò)調(diào)節(jié)鐵死亡參與OSF的發(fā)生發(fā)展目前尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。因此，本研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)，旨在觀察PNS是否可通過(guò)調(diào)控HaCaT細(xì)胞鐵死亡減輕ANE誘導(dǎo)的OSF，以期為OSF提供參考資料。

材料和方法

1　材料

1.1細(xì)胞人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞系HaCaT（批號(hào)CL-0090）購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.2藥品與主要試劑PNS（批號(hào)DST200706-054）和氫溴酸ANE（批號(hào)DST220613-092）購(gòu)自成都德思特生物技術(shù)有限公司；鐵死亡抑制劑liproxstatin-1（批號(hào)S769907）購(gòu)自Selleck；Fe2+檢測(cè)探針（批號(hào)VC601）和活性氧（reactive oxygen species， ROS）熒光法測(cè)試盒（批號(hào)UX10J0227457）購(gòu)自東仁化學(xué)科技（上海）有限公司；I型膠原（collagen type I， Col-I）抗體（批號(hào)10025607）、溶質(zhì)載體家族7成員11（solute carrier family 7 member 11， SLC7A11）抗體（批號(hào)00115587）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶4（glutathione peroxidase 4， GPX4）抗體（批號(hào)10020795）和GAPDH抗體（批號(hào)00098455）購(gòu)自Proteintech。

1.3儀器Vert.A1型倒置顯微鏡（Carl Zeiss）；Spark 20M型多功能酶標(biāo)儀（Tecan）；JEM-1400PLUS型電子透射電子顯微鏡（JEOL）；ChemiDoc XRS+化學(xué)發(fā)光成像分析儀（Bio-Rad）。

2　主要方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)HaCaT細(xì)胞是來(lái)源于皮膚的一種永生化角質(zhì)形成細(xì)胞，其與黏膜角質(zhì)上皮細(xì)胞的來(lái)源、性質(zhì)、功能相似度高，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于ANE造模致OSF等口腔黏膜研究中［11］。本實(shí)驗(yàn)使用15% FBS、1%雙抗與MEM混合配成完全培養(yǎng)液來(lái)培養(yǎng)HaCaT細(xì)胞。胰酶消化，當(dāng)細(xì)胞貼壁密度合適時(shí)傳代1次，在細(xì)胞狀態(tài)良好時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2ANE、PNS和liproxstatin-1干預(yù)濃度和時(shí)間的篩選使用電子天平稱取ANE和PNS各0.02 g，分別加入4 mL的培養(yǎng)液，過(guò)濾除菌，配制成的原液濃度為5 g/L，4 ℃保存。使用電子天平稱取1 mg liproxstatin-1，溶于20 μL DMSO中，向試管內(nèi)加入培養(yǎng)液至58.68 mL，過(guò)濾除菌，配制成的原液濃度為50 μmol/L，于-80 ℃內(nèi)保存。細(xì)胞消化離心后，按照每孔7×103的密度接種于96孔板，等到細(xì)胞貼壁，用MEM饑餓細(xì)胞16 h后每孔分別加入含PNS終濃度為0、12.5、25、50、100和200 mg/L培養(yǎng)液，培養(yǎng)24和48 h；ANE用CCK-8法篩選操作及濃度梯度設(shè)置同PNS［12］。liproxstatin-1組加入liproxstatin-1終濃度為0、1、2、4和8 μmol/L的培養(yǎng)液［13］，其余CCK-8法操作同上。最后，計(jì)算得出細(xì)胞活力。

2.3細(xì)胞模型建立、分組及形態(tài)觀察將體外培養(yǎng)的HaCaT細(xì)胞隨機(jī)分為空白組、模型組、低劑量PNS組、中劑量PNS組、高劑量PNS組和liproxstatin-1組，共計(jì)6組?？瞻捉M使用完全培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h；模型組加入含50 mg/L ANE的完全培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h；對(duì)低、中、高劑量PNS組，先分別加入相應(yīng)劑量PNS預(yù)先干預(yù)2 h后吸棄培養(yǎng)液，隨后分別替換成含12.5 mg/L PNS+50 mg/L ANE、25 mg/L PNS+50 mg/L ANE和50 mg/L PNS+50 mg/L ANE的完全培養(yǎng)液繼續(xù)給藥培養(yǎng)24 h；對(duì)liproxstatin-1組加入含2 μmol/L liproxstatin-1+50 mg/L ANE的完全培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h。在倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)的變化，并拍照記錄。

2.4透射電鏡觀察細(xì)胞線粒體形態(tài)學(xué)變化將處于對(duì)數(shù)期的HaCaT細(xì)胞以每孔2×105的密度接種于6孔板，細(xì)胞分組與處理同2.3，培養(yǎng)24 h后，將其消化、離心并收集于1.5 mL EP管中。隨后用2.5%細(xì)胞電鏡固定液戊二醛對(duì)其常溫避光固定0.5 h后轉(zhuǎn)入4 ℃過(guò)夜，用PBS潤(rùn)洗，于1%四氧化鋨中固定。乙醇梯度脫水后，樹脂包埋，制作超薄切片，染色，于透射電鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu)改變，尋找線粒體形態(tài)的改變并拍照［14］。

2.5Western blot法檢測(cè)Col-I、GPX4和SLC7A11的蛋白表達(dá)在6孔板中，以每孔2×105個(gè)HaCaT細(xì)胞的密度接種，細(xì)胞的分組和處理方法與2.3相同。將各組細(xì)胞培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱24 h后，加入PBS洗滌3次。在冰上，將RIPA∶PMSF=99∶1的細(xì)胞裂解液按每孔100 μL加入6孔板讓細(xì)胞在30 min內(nèi)裂解，提取總蛋白，并使用BCA蛋白定量法測(cè)定蛋白濃度。配制上樣體系，在100 ℃的干浴鍋中對(duì)上樣體系進(jìn)行干浴10 min，使用15 μg蛋白進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，將其轉(zhuǎn)移到0.45 μm的PVDF膜上。在室溫下使用5%的脫脂奶粉進(jìn)行封閉，持續(xù)3 h。TBST洗膜3次，每次5 min。使用Col-I抗體（1∶6 000）、GPX4抗體（1∶3 000）和SLC7A11抗體（1∶2 000）孵育12 h后，洗膜；用Ⅱ抗（1∶15 000）在室溫下孵育2 h，洗膜。使用靈敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑和ChemiDoc XRS+系統(tǒng)分析條帶，ImageJ軟件進(jìn)行灰度值分析。

2.6FerroOrange熒光探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Fe2+含量細(xì)胞分組與處理同2.3，按照Fe2+熒光探針說(shuō)明書操作，每孔加入的熒光探針工作液濃度為1 μmol/L，孵育20 min。倒置熒光顯微鏡下觀察各組熒光強(qiáng)度，并使用ImageJ軟件對(duì)平均熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量。

2.7DCFH-DA熒光探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS含量細(xì)胞分組與處理同2.3，按照說(shuō)明書操作，其中DCFH-DA工作液配制成10 μmol/L的濃度，孵育20 min，將探針清洗后在倒置熒光顯微鏡下查看熒光強(qiáng)度，并使用Image J軟件對(duì)平均熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量。

2.8比色法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽（glutathione， GSH）含量將HaCaT細(xì)胞接種于細(xì)胞瓶，細(xì)胞分組與處理同2.3，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，收集各組HaCaT細(xì)胞，冰浴超聲破碎細(xì)胞，4 ℃離心后取上清液參照GSH試劑盒說(shuō)明書測(cè)定412 nm處吸光度，獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，最終計(jì)算GSH含量。

3　統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用GraphPad Prism 9.0和SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。兩組間數(shù)據(jù)分布的正態(tài)性和方差齊性分別以Kolmogorov-Smirnov和Levene檢驗(yàn)確定。兩組間均數(shù)比較采用檢驗(yàn)；多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間有差異進(jìn)一步采用SNK-檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較。以<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1　PNS、ANE和liproxstatin-1干預(yù)濃度和時(shí)間的篩選結(jié)果

CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著ANE濃度的升高，處理時(shí)間的延長(zhǎng)（24和48 h），HaCaT細(xì)胞活力呈顯著下降趨勢(shì)（均<0.05），見圖1A。計(jì)算得出ANE處理HaCaT細(xì)胞24 h時(shí)的IC50為50 mg/L，故選取50 mg/L作為造模藥物濃度。檢測(cè)不同濃度PNS作用24和48 h后的HaCaT細(xì)胞活力，與空白組比較，細(xì)胞活力隨著PNS的濃度增大逐漸降低，呈現(xiàn)劑量依賴性，當(dāng)使用≤50 mg/L的PNS干預(yù)24 h時(shí)，HaCaT細(xì)胞的活力不受影響（0.05），且細(xì)胞形態(tài)無(wú)改變，生長(zhǎng)狀態(tài)好，最終篩選出3個(gè)給藥梯度濃度為12.5、25和50 mg/L，給藥時(shí)間為24 h，見圖1B。不同濃度的liproxstatin-1處理HaCaT細(xì)胞24 h后，結(jié)果表明，隨著liproxstatin-1濃度的升高，細(xì)胞活力呈現(xiàn)出顯著下降的趨勢(shì)（均<0.01），見圖1C。經(jīng)過(guò)計(jì)算可知liproxstatin-1處理HaCaT細(xì)胞的IC50為2 μmol/L，故選用2 μmol/L作為給藥濃度。

Figure 1.　Results for cell viability. A： effects of arecoline （ANE） on the viability of HaCaT cells； B： effects of Panax notoginseng saponins （PNS） on the viability of HaCaT cells； C： effects of liproxstatin-1 （for 24 h） on the viability of HaCaT cells. Mean±SD. n=3. *P<0.05，**P<0.01 vs 0 mg/L or 0 μmol/L at 24 h；#P<0.05，##P<0.01 vs 0 mg/L at 48 h.

2　各組細(xì)胞給藥干預(yù)后形態(tài)的變化

倒置顯微鏡下HaCaT細(xì)胞形態(tài)顯示，空白組細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)好，單個(gè)為多角形，群體為鋪路石樣，細(xì)胞連接緊密成團(tuán)生長(zhǎng)，數(shù)量多，貼壁牢靠，呈典型上皮細(xì)胞樣；模型組幾乎大部分細(xì)胞改變?cè)行螒B(tài)，呈長(zhǎng)梭形，失去細(xì)胞原本容易成團(tuán)特性，細(xì)胞間隙大，貼壁不牢靠，呈纖維化樣外觀；低、中、高劑量PNS組細(xì)胞恢復(fù)為短梭形或多角形，死亡細(xì)胞數(shù)較模型組減少，且濃度越高，恢復(fù)效果越顯著；liproxstatin-1組細(xì)胞恢復(fù)為正常形態(tài)學(xué)表現(xiàn)，見圖2。

Figure 2.　Effect of Panax notoginseng saponins （PNS） on the morphology of HaCaT cells （scale bar=100 μm）. A： blank group （the cells were in good growth state， paving stone-like， tightly connected and firmly attached to the wall， showing typical epithelial cells）； B： model group （most of the cells changed their original shape， showing a long spindle shape， a large gap， an unstable adherence to the wall， and a fibrotic appearance）； C， D and E： low-， medium- and high-dose PNS groups （the cells restored to short spindle or polygon， and the number of dead cells decreased）； F： liproxstatin-1 group （the cells returned to normal morphology）.

3　透射電鏡觀察各組細(xì)胞線粒體超微結(jié)構(gòu)

空白組細(xì)胞線粒體完整，形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰；模型組細(xì)胞線粒體萎縮，膜內(nèi)結(jié)構(gòu)模糊，雙層膜密度顯著增加，嵴斷裂，損傷嚴(yán)重，呈典型的鐵死亡表現(xiàn)；低、中、高劑量PNS組細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)僅呈輕度損傷，膜密度減小，嵴數(shù)目增加，形態(tài)趨于正常（改善程度：低<中<高）；liproxstatin-1組線粒體結(jié)構(gòu)改善程度與高劑量PNS組相近，線粒體形態(tài)趨于正常，見圖3。

Figure 3.　Effects of Panax notoginseng saponins （PNS） on mitochondria in HaCaT cells （scale bar=500 μm）. A： blank group （the mitochondria were intact， and their morphology and structure were clear）； B： model group （the mitochondrial structure was blurred， and the density of the bilayer membrane increased significantly， showing typical ferroptosis）； C， D and E： low-， medium- and high-dose PNS groups （the mitochondrial structure was slightly damaged， and the morphology tended to be normal， showing a significant improvement： low

4　各組細(xì)胞Col-I、GPX4和SLC7A11的蛋白表達(dá)

與空白組相比，模型組細(xì)胞GPX4和SLC7A11蛋白表達(dá)減少，Col-I表達(dá)增加（均<0.01）；與模型組相比，低、中、高劑量PNS組細(xì)胞Col-I表達(dá)減少（<0.01），均呈濃度依賴性；與模型組相比，中、高劑量PNS組細(xì)胞GPX4和SLC7A11蛋白表達(dá)增加（<0.01），低劑量PNS組細(xì)胞GPX4和SLC7A11蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（0.05）；與模型組相比，liproxstatin-1組細(xì)胞GPX4和SLC7A11蛋白表達(dá)增加，Col-I表達(dá)減少（<0.01），見圖4。

Figure 4.　Effects of Panax notoginseng saponins （PNS） on the protein expression of collagen type I （Col-I）， solute carrier family 7 member 11 （SLC7A11） and glutathione peroxidase 4 （GPX4） in HaCaT cells were detected by Western blot. A： blank group； B： model group； C： low-dose PNS group； D： medium-dose PNS group； E： high-dose PNS group； F： liproxstatin-1 group. Mean±SD. n=3. ##P<0.01 vs blank group；**P<0.01 vs model group.

5　各組細(xì)胞Fe2+水平比較

Fe2+熒光強(qiáng)度比較，模型組顯著高于空白組（<0.01）；低劑量PNS組與模型組相比無(wú)顯著差異（>0.05），中、高劑量PNS組的Fe2+熒光強(qiáng)度顯著低于模型組（均<0.05），且隨PNS濃度升高Fe2+熒光強(qiáng)度改變更顯著；liproxstatin-1組細(xì)胞內(nèi)Fe2+熒光強(qiáng)度比模型組顯著降低（<0.05），見圖5。

Figure 5.　Effect of Panax notoginseng saponins （PNS） on Fe2+ content in HaCaT cells was detected by FerroOrange fluorescent probe （scale bar=50 μm）. A： blank group； B： model group； C： low-dose PNS group； D： medium-dose PNS group； E： high-dose PNS group； F： liproxstatin-1 group. Mean±SD. n=3. ##P<0.01 vs blank group；*P<0.05，**P<0.01 vs model group.

6　各組細(xì)胞ROS水平比較

經(jīng)倒置熒光顯微鏡檢測(cè)與定量分析熒光強(qiáng)度后提示，相較于空白組，ROS在模型組中的含量顯著增多（<0.01）；低、中、高劑量PNS組與模型組比較熒光強(qiáng)度顯著降低（均<0.05）；liproxstatin-1組ROS與模型組相比顯著減少（<0.05），見圖6。

Figure 6.　Effect of Panax notoginseng saponins （PNS） on reactive oxygen species （ROS） content in HaCaT cells （scale bar=50 μm） was detected by DCFH-DA fluorescent probe. A： blank group； B： model group； C： low-dose PNS group； D： medium-dose PNS group； E： high-dose PNS group； F： liproxstatin-1 group. Mean±SD. n=3. ##P<0.01 vs blank group；*P<0.05，**P<0.01 vs model group.

7　各組細(xì)胞GSH水平比較

與空白組相比，模型組細(xì)胞內(nèi)GSH水平顯著降低（<0.01）；與模型組相比，低、中、高劑量PNS組細(xì)胞內(nèi)GSH水平呈梯度顯著增加（<0.05），liproxstatin-1組細(xì)胞內(nèi)GSH水平亦顯著增加（<0.01），見圖7。

Figure 7.　Effect of Panax notoginseng saponins （PNS） on glutathione （GSH） content in HaCaT cells. A： blank group； B： model group； C： low-dose PNS group； D： medium-dose PNS group； E： high-dose PNS group； F： liproxstatin-1 group. Mean±SD. n=3. ##P<0.01 vs blank group；*P<0.05，**P<0.01 vs model group.

討論

ANE作用于HaCaT細(xì)胞加劇氧化應(yīng)激反應(yīng)是OSF的主要發(fā)病機(jī)制之一［15］。同時(shí)，在OSF進(jìn)一步惡化引起的口腔癌疾病中可觀察到與鐵死亡相關(guān)的表現(xiàn)［16-17］。而PNS作為中藥三七主要有效成分，具有緩解腎、肺、肝纖維化的高效作用［18］，且可通過(guò)抑制細(xì)胞鐵死亡延緩疾病進(jìn)程［9］，但在OSF鮮有研究。因此，本研究以鐵死亡為切入點(diǎn)，探討PNS在ANE誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞OSF中的作用及機(jī)制。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ANE處理HaCaT細(xì)胞后的模型組，光鏡下觀察到細(xì)胞間連接松散，形態(tài)呈梭形改變，纖維化因子Col-I表達(dá)較空白組顯著增多，且鐵死亡標(biāo)志物GSH、SLC7A11和GPX4含量顯著降低，F(xiàn)e2+和ROS含量顯著增高，線粒體形態(tài)呈鐵死亡特征損傷樣。鐵超載會(huì)促進(jìn)脂質(zhì)過(guò)氧化和ROS的聚集，線粒體損傷，誘導(dǎo)鐵死亡［19］。GSH是GPX4清除脂質(zhì)ROS的必需輔助因子，SLC7A11表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致GSH減少和GPX4活性降低均會(huì)促進(jìn)鐵死亡進(jìn)程［20］。以上結(jié)果顯示，在ANE誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞OSF中存在鐵死亡。鐵死亡抑制劑liproxstatin-1是一種選擇性抑制鐵死亡的有效藥物［21］。本研究中，liproxstatin-1干預(yù)經(jīng)ANE處理的HaCat細(xì)胞后，鐵死亡被抑制，且纖維化因子表達(dá)水平顯著下調(diào)，說(shuō)明抑制鐵死亡能減輕ANE誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞OSF中的纖維化程度。

PNS是具有抗纖維化和抗氧化應(yīng)激作用的中藥三七的主要提取成分［22］。已有報(bào)道顯示PNS可調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞對(duì)鐵死亡的敏感性［9］。在本研究中，低、中、高劑量PNS可以使經(jīng)ANE處理的HaCaT細(xì)胞GSH、SLC7A11和GPX4含量較模型組顯著增加，F(xiàn)e2+和ROS含量顯著降低，線粒體形態(tài)逐步恢復(fù)正常；且高劑量PNS與liproxstatin-1干預(yù)效果相近，均可顯著抑制鐵死亡；但低劑量PNS組SLC7A11、GPX4和Fe2+含量變化與模型組相比無(wú)顯著差異，可能與PNS作用濃度較低有關(guān)。同時(shí)，低、中、高劑量PNS組纖維化因子Col-I表達(dá)顯著下調(diào)，進(jìn)一步驗(yàn)證了PNS通過(guò)抑制鐵死亡可減緩ANE誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞OSF進(jìn)程。上述結(jié)果表明，在HaCaT細(xì)胞中，PNS可通過(guò)抑制HaCaT細(xì)胞鐵死亡而減輕ANE誘導(dǎo)的OSF。

綜上所述，在ANE誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞OSF中存在鐵死亡，且PNS可以通過(guò)抑制HaCaT細(xì)胞鐵死亡緩解OSF。本研究為OSF的臨床治療提供了參考資料，但具體機(jī)制還有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究驗(yàn)證。

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saponins attenuate oral submucous fibrosis by preventing arecaline-induced ferroptosis of HaCaT cells

ZOU Hong， SUN Yujie， ZHAO Chenxi， ZHANG Xinyue， HU Liang， XIE Lu， WEN Lixiang， TANG Qun△， HU Lijuan△

（，，410208，）

To investigate whethersaponins （PNS） attenuate arecoline （ANE）-induced human oral submucous fibrosis （OSF） by regulating ferroptosis， and to study its mechanism.The OSF model was established by treating human immortalized keratinocyte cell line HaCaT with ANE. There were 6 groups created： blank group， model group （50 mg/L ANE）， low-， medium- and high-dose （12.5， 25 and 50 mg/L） PNS groups， and liproxstatin-1 （ferroptosis inhibitor） group. The morphological changes of the cells were observed under a light microscope. Cell viabilty was detected by CCK-8 assay. Collagen type I （Col-I）， solute carrier family 7 member 11 （SLC7A11） and glutathione peroxidase 4 （GPX4） protein expression levels were detected by Western blot. The morphological changes of mitochondria were observed by transmission electron microscopy. The Fe2+level was detected by FerroOrange fluorescent probe. The intracellular reactive oxygen species （ROS） content was detected by DCFH-DA fluorescent probe. The content of glutathione （GSH） was determined by colorimetry.Compared with blank group， the majority of the cells in model group displayed long spindle shape， fibrotic appearance， unstable adhesion， and obvious morphological changes. Under electron microscope， mitochondrial double membrane density increased， and cristae decreased significantly， presenting typical ferroptosis. The expression of Col-I increased， GPX4 and SLC7A11 protein expression decreased， Fe2+and ROS levels increased， and GSH content decreased （all<0.05）. Compared with model group， most of the cells in low-， medium- and high-dose PNS groups were round and epitheloid， with decreased mitochondrial membrane density， increased ridge number and normal morphology， decreased Col-I expression and ROS level， and increased GSH content （all<0.05）. Compared with model group， the protein expression levels of GPX4 and SLC7A11 in medium- and high-dose PNS groups were significantly increased， while the content of Fe2+was significantly decreased （all<0.05）. There were no significant differences in cell and mitochondrial morphology and indicator levels between liproxstatin-1 group and high-dose PNS group （all>0.05）.saponins can alleviate OSF by preventing the ferroptosis of HaCaT cells induced by ANE.

oral submucous fibrosis； ferroptosis；saponins

R781.5； R363.2

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2023.09.004

1000-4718（2023）09-1563-07

2023-06-05

2023-08-01

湖南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（No. 2021JJ30506）；湖南省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目（No. 21A0242）；湖南省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項(xiàng)目（No. S202210541130）

唐群 Tel： 13467536701； E-mail： tangqun460@126.com；胡立娟 Tel： 13875932601； E-mail： hulijuan@hnucm.edu.cn

（責(zé)任編輯：盧萍，羅森）