基于NOD2/NF-κB通路研究雷公藤多苷對糖尿病腎病大鼠的影響*

陳晨晨,宋丹,宋純東,,郭婷,段風陽,王寧麗,張博,楊濛,王耀獻

1.河南中醫(yī)藥大學,河南 鄭州 450046; 2.河南中醫(yī)藥大學兒科醫(yī)學院,河南 鄭州 450000;3.河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院,河南 鄭州 450000

糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病患者中最常見的微血管并發(fā)癥,也是導致終末期腎病(end-stage renal disease,ESRD)的主要原因[1]。DN病理變化復雜,主要包括腎小球肥大伴進行性系膜擴張和腎小管間質纖維化[2]。DN的發(fā)病機制尚未完全明確,目前認為是糖代謝異常、炎癥反應、免疫反應、氧化應激、自噬、遺傳易感等多種因素共同作用的結果[3-5]。研究發(fā)現(xiàn),炎癥信號通路核苷酸結合寡聚化結構域蛋白2(nucleotide-binding oligomerization domain 2,NOD2)/核轉錄因子-κB(nuclear transcription factor-κB,NF-κB)通路異?？蓪е履I組織受損,在DN的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[6-7]。臨床上對DN的治療主要是控制飲食,降低血壓、血糖、血脂及抗感染,抑制腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)等[8]。雷公藤多苷(tripterygium wilfordii polyglycoside,TWP)是衛(wèi)矛科植物雷公藤的主要活性成分,具有抗炎、免疫抑制等作用,臨床上雷公藤多苷被廣泛應用于DN的治療[9]。本研究基于NOD2/NF-κB通路研究雷公藤多苷對糖尿病腎病大鼠的影響,以期進一步探討其作用機制。

1 材料

1.1 動物42只SPF級雄性SD大鼠,體質量(190±10 g),購自鄭州市惠濟區(qū)華興實驗動物養(yǎng)殖場,許可證號:SCXK(豫)2019-0002,飼養(yǎng)于河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院中心實驗室動物房,動物實驗環(huán)境:SPF級屏障(IVC)環(huán)境,相對濕度(50±10)%,25 ℃恒溫,12 h/12 h晝夜明暗交替。本實驗由河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院倫理審查委員會批準,動物實驗倫理審查批準編號:YFYDW2021013。

1.2 藥物與試劑雷公藤多苷片(江蘇美通制藥有限公司,國藥準字:Z32021007,規(guī)格:10 mg);纈沙坦(代文)膠囊(北京諾華制藥公司,國藥準字:H20040217,規(guī)格:80 mg);鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ,美國Sigma公司,貨號:S1030)。檸檬酸鈉緩沖液(北京索萊寶科技有限公司,貨號:C1013);NOD2抗體、NF-κB抗體、HRP-山羊抗小鼠二抗、HRP-山羊抗兔二抗、β-actin抗體、RIPA裂解液、RNA提取液(武漢賽維爾生物科技有限公司,貨號:GB31488、GB11997、GB25301、GB23303、GB15001、G2002、G3013);大鼠NOD2、NF-κB ELISA試劑盒(江蘇酶免實業(yè)有限公司,貨號:MM-0799R2、MM-0699R2);三氯甲烷、異丙醇、無水乙醇(國藥集團化學試劑有限公司,貨號:10006818、80109218、10009218);PCR引物由武漢賽維爾生物科技有限公司合成。

1.3 儀器AU5800型全自動生化分析儀(美國Beckman公司);DESK/MIDI/250/1000型全景切片掃描儀(匈牙利3DHISTECH公司);CFX型熒光定量PCR儀(美國Bio-rad公司);D3024R型臺式高速冷凍型微量離心機[大龍興創(chuàng)實驗儀器(北京)有限公司,最大轉速15 000 r·min-1,步長:10 r·min-1];NanoDrop2000型超微量分光光度計(美國Thermo Fisher Scientific公司);RT-6100型酶標檢測儀(深圳雷杜生命科學股份有限公司);Neofuge 23R型冷凍離心機(力康生物醫(yī)療科技股份有限公司);ADW-1002-M型純水儀(重慶艾科浦公司);DS-2S100型脫色搖床(武漢賽維爾生物科技有限公司);SVE-2型電泳儀(北京六一儀器廠)。

2 方法

2.1 動物分組、造模及給藥42只大鼠適應性飼養(yǎng)1周后,隨機選出8只作為空白組,給予標準飼料喂養(yǎng);其余大鼠作為造模組,采用高脂高糖飼料喂養(yǎng),并給予1% STZ(55 mg·kg-1)溶液一次性腹腔注射造模,造模3 d后連續(xù)監(jiān)測血糖,當大鼠血糖≥16.7 mmol·L-1為糖尿病造模成功,繼續(xù)高脂高糖飼料喂養(yǎng),2周后測得大鼠尿蛋白呈陽性,為DN模型建立成功。24只造模成功大鼠采用隨機數(shù)字表法分為模型組、纈沙坦組和雷公藤多苷組,每組8只。纈沙坦組和雷公藤多苷組大鼠分別給予纈沙坦(代文)膠囊(8.33 mg·kg-1·d-1)及雷公藤多苷片(5 mg·kg-1·d-1)溶液灌胃,空白組和模型組大鼠灌服等體積生理鹽水,灌胃體積為10 mL·kg-1,每日1次,連續(xù)給藥6周。

2.2 24 h尿蛋白定量檢測灌胃結束后,禁食不禁水24 h,代謝籠收集大鼠24 h 尿液,離心后留取上清液檢測24 h尿蛋白定量(24 hour urinary protein,24hUTP)。

2.3 全自動生化分析儀測定血糖(blood glucose,GLU)、血清肌酐(serum creatinine,SCr)、血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)水平10%水合氯醛腹腔注射麻醉后腹主動脈取血,3 500 r·min-1(離心半徑:10 cm)離心10 min,留取血清,全自動生化分析儀檢測GLU、SCr、BUN水平。

2.4 HE染色觀察大鼠腎臟組織病理變化取血后迅速剝離腎臟,右腎腎門冠狀面切下1 cm×1 cm×1 cm大小樣本置于4%多聚甲醛中。將固定后的腎臟組織進行梯度酒精脫水、二甲苯透明,石蠟包埋、冷卻后切片、蘇木精-伊紅染色,光鏡下觀察腎臟組織病理形態(tài)改變。

2.5 ELISA法檢測血清NOD2、NF-κB水平具體操作步驟嚴格按照ELISA試劑盒說明書進行。將血清樣品加于酶標板孔底部,除空白孔外,每孔加入酶標試劑100 μL,封板膜封板后37 ℃孵育1 h,配液、洗滌,加入顯色劑,37 ℃避光顯色15 min,采用酶標儀于450 nm波長處測量各孔的吸光度值。

2.6 Western Blot法檢測腎組織NOD2、NF-κB蛋白表達水平凍存管中的腎組織以PBS洗滌3次,剪碎后加裂解液勻漿,勻漿后12 000 r·min-1,4 ℃ 離心10 min,收集上清,即為總蛋白溶液,BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測蛋白濃度,沸水浴變性 15 min,-20 ℃保存?zhèn)溆?蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳,300 mA恒流轉膜30 min,室溫封閉 30 min,加入一抗(稀釋比例為1：1 000)4 ℃搖床孵育過夜,加入二抗(稀釋比例為1：5 000)室溫孵育30 min;壓膠片、顯影、定影,膠片掃描存檔,Photoshop整理去色,Alpha軟件處理系統(tǒng)分析目標條帶的光密度值,蛋白相對表達量為目的蛋白條帶灰度值與內參蛋白條帶灰度值的比值。

2.7 熒光定量PCR法檢測腎組織NOD2、NF-κBmRNA表達水平總RNA抽提后逆轉錄合成 cDNA,PCR擴增條件:95 ℃預變性10 min;95 ℃變性15 s、60 ℃退火/延伸30 s(40個循環(huán)),65 ℃→95 ℃ 每升溫0.5 ℃采集一次熒光信號。采用2-△△CT法進行計算分析。引物序列見表1。

表1 PCR擴增引物序列

3 結果

3.1 各組大鼠GLU、SCr、BUN、24 hUTP結果比較與空白組比較,模型組大鼠GLU、SCr、BUN、24 hUTP 水平明顯升高(P<0.05);與模型組比較,給藥組大鼠GLU、SCr、BUN、24 hUTP水平明顯降低(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠GLU、SCr、BUN、24hUTP結果比較

3.2 各組大鼠腎臟病理結果比較光鏡觀察發(fā)現(xiàn),與空白組比較,模型組大鼠腎小球肥大,腎小管上皮細胞氣球樣變性,胞質空泡化,腎血管淤血、擴張,基底膜增厚;與模型組比較,兩個治療組大鼠腎臟組織病理改變較輕,腎小球未見明顯病理改變,表現(xiàn)為腎小管輕度增厚、擴張。見圖1。

注:A:空白組;B:模型組;C:纈沙坦對照組;D:雷公藤多苷組。圖1 各組大鼠腎臟病理變化(HE染色,×400)

3.3 各組大鼠血清NOD2和NF-κB 水平比較與空白組比較,模型組大鼠血清NOD2、NF-κB水平明顯升高(P<0.05);與模型組比較,給藥組大鼠血清NOD2、NF-κB水平均明顯降低(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠血清NOD2和NF-κB水平比較

3.4 各組大鼠腎組織NOD2和NF-κB蛋白表達水平比較與空白組比較,模型組大鼠腎組織NOD2、NF-κB 蛋白表達水平明顯升高(P<0.05);與模型組比較,給藥組大鼠腎組織NOD2、NF-κB蛋白表達水平均明顯降低(P<0.05)。見圖2、表4。

注:A:空白組 B:模型組 C:纈沙坦對照組 D:雷公藤多苷組。圖2 各組大鼠腎組織NOD2、NF-κB蛋白電泳條帶

表4 各組大鼠腎組織NOD2、NF-κB蛋白表達水平比較

3.5 各組大鼠腎組織NOD2和NF-κBmRNA表達水平比較與空白組比較,模型組大鼠腎組織NOD2、NF-κBmRNA表達水平明顯升高(P<0.05);與模型組比較,兩治療組大鼠腎組織NOD2、NF-κBmRNA表達水平均明顯降低(P<0.05)。見表5。

表5 各組大鼠腎組織NOD2、NF-κB mRNA表達水平比較

4 討論

雷公藤始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,屬衛(wèi)矛科植物,其化學成分復雜,主要包括二萜類、三萜類、生物堿類、糖類、倍半萜類等[10]。雷公藤制劑作為免疫抑制劑類藥物,廣泛應用于多種原發(fā)及繼發(fā)性腎臟疾病,可有效減少尿蛋白,延緩腎損傷[11-13]。雷公藤多苷是雷公藤的主要活性成分,可通過抗炎、降低氧化應激、降低胰島素抵抗、保護足細胞、修復腎小管間質損傷等途徑治療DN,且具有多組分、多靶點、多系統(tǒng)的特點[14]。既往研究發(fā)現(xiàn),雷公藤多苷治療DN效果明顯,其機制可能與下調DN大鼠腎組織Ras同源基因家族成員A(Ras homolog gene family,member A,RhoA)、Rho相關的卷曲螺旋激酶1(Rho associated coiled coil-forming kinase 1,ROCK1)有關[15]。此外多項研究結果也表明,雷公藤多苷在治療DN上有很好的應用價值[16-18]。本研究結果同樣表明,雷公藤多苷可抑制NOD2/NF-κB通路,改善腎臟功能,發(fā)揮治療作用。

DN在糖尿病患者中的發(fā)病率超過40%,且在我國的發(fā)病率呈逐年上升趨勢,已成為ESRD的主要病因,嚴重影響了患者的生活質量[19]。DN的發(fā)病機制尚未完全闡明,目前認為免疫反應及炎癥反應在其發(fā)病過程中作用重大。天然免疫模式識別受體(pattemrecognition receptors,PRRs)是先天免疫系統(tǒng)中的重要成分,NOD樣受體是其主要的亞家族之一,可影響自身免疫、炎癥疾病的轉歸等[20-23]。NOD的亞型NOD2于炎癥細胞和腎臟中高表達,是DN中連接腎損傷、炎癥和足細胞胰島素抵抗的信號轉導通路的關鍵成分之一[24]。NF-κB蛋白是Rel蛋白家族的核轉錄因子,NF-κB通路激活能促進多種炎性細胞因子的表達[25-26],使腎臟炎癥反應進一步增強,在DN的發(fā)病中發(fā)揮重要作用[27-28]。王露等[29]通過臨床觀察發(fā)現(xiàn),DN患者血清NF-κB水平明顯升高,且與患者腎功能指標均存在相關性,可能是NF-κB引起的炎癥反應加重腎臟負擔從而引起一系列腎功能指標發(fā)生變化。NOD2與 NF-κB 關系密切,NOD2能夠誘導NF-κB的激活,并觸發(fā)細胞信號級聯(lián),促使細胞因子和趨化因子表達,導致DN患者腎臟細胞損傷和進行性纖維化[30]。研究也證實,調節(jié)NOD2/NF-κB通路可以改善DN腎臟損傷,因此,抑制NOD2/NF-κB的表達可能是治療DN的新靶標[31]。本研究發(fā)現(xiàn),雷公藤多苷可通過抑制此通路改善DN大鼠腎功能,進一步明確了雷公藤多苷對DN的治療作用及作用機制。

通過對比發(fā)現(xiàn),模型組大鼠腎臟病理損傷嚴重,表現(xiàn)為腎小球肥大、基底膜增厚、腎小管上皮細胞及腎血管多處損傷,雷公藤多苷組腎臟病理損害程度較輕,腎小球未見明顯病理改變,表現(xiàn)為腎小管輕度增厚、擴張。此外,兩治療組GLU、SCr、BUN及 24 hUTP 水平降低,且雷公藤多苷組降蛋白作用相對優(yōu)于纈沙坦對照組,提示雷公藤多苷可有效降低大鼠血糖及蛋白尿水平,改善腎功能,延緩腎損傷。

綜上所述,雷公藤多苷可通過抑制NOD2/NF-κB通路活性減輕腎損傷,從而發(fā)揮對DN大鼠的治療作用。本研究對臨床應用雷公藤多苷治療DN提供了參考,考慮到臨床應用雷公藤多苷時存在一定的毒副作用,其臨床應用劑量需要通過進一步研究確定。