自擬加味白頭翁湯通過調(diào)節(jié)Drp1/LC3改善急性UC小鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞線粒體功能的研究*

代汝偉 高志遠(yuǎn) 王 欣 鄭舒文 徐智廣△

（1.滄州醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，河北 滄州 061001；2.河北省滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，河北 滄州 061001；3.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250014）

潰瘍性結(jié)腸炎（UC）是以直腸和乙狀結(jié)腸的黏膜和黏膜下層為主要病變的炎癥性疾病，臨床表現(xiàn)為腹痛、腹瀉、黏液膿血便、里急后重，或伴有體質(zhì)量減輕、惡心、嘔吐等。近年來我國UC 發(fā)病率逐年上升［1-3］。但病因尚不明確，治療缺乏特異性。因此，尋求安全有效的治療手段，深入探討其作用機制仍是UC 研究的熱點。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為UC 屬本虛標(biāo)實，由感受外邪、飲食失節(jié)、情志內(nèi)傷等多種病因引起脾胃虛弱，中焦運化失司，濕熱內(nèi)壅致病［4］。白頭翁湯出自《傷寒論·辨厥陰病脈證并治》“熱利下重者，白頭翁湯主之”，具有清熱解毒的功效，是治熱毒血痢之主方。臨床醫(yī)家多在白頭翁湯原方上加味，通過調(diào)整腸道微生物、修復(fù)腸黏膜屏障、改善線粒體功能起到治療作用［5-7］。線粒體動力和自噬是維持線粒體功能的基本形式，研究表明線粒體動力和自噬在結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞的發(fā)育和活性中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，腸黏膜上皮細(xì)胞線粒體分裂融合不平衡及過度自噬會導(dǎo)致黏膜上皮細(xì)胞發(fā)育停滯，甚至凋亡［8-11］。在前期臨床研究基礎(chǔ)上，為進(jìn)一步揭示自擬加味白頭翁湯對UC 結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞線粒體動力和自噬的影響，本研究應(yīng)用DSS 構(gòu)建急性UC 模型，灌胃自擬加味白頭翁湯治療，探討加味白頭翁湯與黏膜上皮細(xì)胞線粒體動力、自噬的關(guān)系，從分子層面為加味白頭翁湯治療UC提供數(shù)據(jù)支持?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF 級雄性C57BL/6 小鼠48 只，體質(zhì)量18～20 g，購自北京維通利華實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（京）2016-0006，飼養(yǎng)于滄州醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)?？萍紝嶒瀯游镏行模銣兀?2±2）℃，相對濕度40%～70%，自由攝食飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d 開展后續(xù)相關(guān)實驗。本實驗通過滄州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校動物實驗倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 實驗藥物

加味白頭翁湯（白頭翁30 g，黃連6 g，黃柏10 g，三七10 g，秦皮9 g，槐花30 g，黃芪10 g，虎杖10 g，金銀花20 g，青蒿10 g，炙甘草9 g），生藥購自河北省滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，浸泡30 min，煮沸后微沸10 min，濾出頭煎藥渣加水再煮，沸后10 min，合并2 次煎液，加熱濃縮至100 mL，生藥濃度1.54 g/mL。美沙拉嗪腸溶片（葵花藥業(yè)集團(tuán)佳木斯鹿靈制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H19980148，規(guī)格：0.25 g×24片）。

1.3 試劑與儀器

蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒（碧云天生物科技有限公司，貨號C0105M），抗兔二抗（Servicebio，貨號GB23303），免疫組化試劑盒（博士德，貨號SA1023），聚氰基丙烯酸正丁酯（BCA）蛋白定量試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，貨號PC0050），HSP60 一抗（北京索萊寶科技有限公司，貨號K000489P），Drp1 一抗（proteintech 公司，貨號12957-1-AP）、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（LC3）一抗（proteintech 公司，貨號14600-1-AP），抗兔熒光二抗（Servicebio，貨號GB23303），甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）多克隆抗體（Servicebio，貨號GB12002），線粒體分離試劑盒（碧云天，貨號C3606），ATP 含量檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號BC0300），線粒體復(fù)合物Ⅰ/Ⅲ活性試劑盒（Abbkine 公司，貨號KTB1870），小鼠超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（ELISA KIT，貨號CB10221-Mu），小鼠白細(xì)胞介素-6（IL-6）試劑盒（ELISA KIT，貨號CB10187-Mu），Mdivi-1（Sigma，貨號338967-87-6），Rapamycin（MedChemExpress，貨號3123-88-9），RIPA 裂解液，增強化學(xué)發(fā)光法（ECL）超敏發(fā)光液（北京索萊寶科技有限公司，批號分別為R0010、PE0010）。FORMA700 型超低溫冰箱（美國Thermo 公司）；CR21G 型離心機（日本日立公司）；Direct-Q with pump 型超純水儀（美國Millipore 公司）；CKX31 型奧林巴斯倒置相差顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；紫外分光光度計（上海精密儀器有限公司，UV-2202PCST）；酶標(biāo)儀（賽默飛公司，K3）；酶標(biāo)檢測儀（Rayto，Rt2100c）；凝膠掃描儀（EPSON，V300）。

1.4 模型制備

48 只SPF 級C57BL/6 小鼠隨機分為空白組、模型組、美沙拉嗪組，加味白頭翁湯高、中、低劑量組，每組8 只，自由飲食。參考相關(guān)文獻(xiàn)，空白組小鼠自由飲用蒸餾水，其他組小鼠自由飲水3.5%葡聚糖硫酸鈉（DSS）7 d 復(fù)制急性UC 模型，以小鼠疾病活動指數(shù)（DAI 評分）較正常組顯著增高及結(jié)腸上皮黏膜不完整、炎癥細(xì)胞浸潤、腺體萎縮為模型成功建立依據(jù)［12-13］。

1.5 干預(yù)方法

模型建立后，每天16∶00 灌胃，連續(xù)7 d，根據(jù)“人與小鼠之間用藥劑量換算表”計算出灌胃量，其中空白組灌蒸餾水，美沙拉嗪組灌胃美沙拉嗪（100 mg/kg），加味白頭翁湯3 個劑量組分別按高劑量（108 g/kg）、中劑量（54 g/kg）、低劑量（27 g/kg）灌胃。

1.6 標(biāo)本采集與檢測

1.6.1 小鼠疾病活動指數(shù)評分（DAI 評分）觀察 觀察小鼠毛發(fā)、活動度整體狀態(tài)，隔天稱重，給藥后記錄各組小鼠體質(zhì)量、大便性狀及便血情況，并進(jìn)行評分。

1.6.2 結(jié)腸上皮SOD、IL-6 含量檢測 參照試劑盒說明書，組織勻漿制備樣本稀釋液，酶標(biāo)儀450 nm 波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度。

1.6.3 HE 染色觀察小鼠結(jié)腸上皮形態(tài) 治療結(jié)束后各組小鼠禁食不禁水，第2 天1%戊巴比妥鈉溶液腹腔注射麻醉（50 mg/kg），腹主動脈取血，分離血清置于-80 ℃冰箱待測。冰上分離出盲腸至肛管上3 mm處結(jié)腸，測量長度后生理鹽水沖洗，置4%多聚甲醛中固定72 h。經(jīng)脫水、石蠟包埋后切片（0.04 μm），HE 染色，光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)腸上皮細(xì)胞黏膜完整性，腺體結(jié)構(gòu)，炎性細(xì)胞數(shù)量。

1.6.4 線粒體復(fù)合物Ⅰ/Ⅲ、ATP 活性測定 參考索萊寶ATP含量檢測試劑盒說明，提取小鼠血清中ATP，于340 nm 波長處測紫外分光光度值，計算ATP含量［ATP含量（μmol/mL）=6.875×Δ 測定÷ΔA 標(biāo)準(zhǔn)］。參考Abbkine 試劑盒說明，應(yīng)用酶標(biāo)儀550 nm 檢測小鼠線粒體復(fù)合物Ⅰ/Ⅲ［線粒體復(fù)合物Ⅲ（U/g fresh weight）=1 243×ΔA÷W；線粒體復(fù)合物Ⅰ（U/g fresh weight）=3 654×ΔA÷W］。

1.6.5 透射電子顯微鏡觀察結(jié)腸上皮線粒體結(jié)構(gòu) 取下1 mm×1 mm×1 mm 結(jié)腸上皮組織，立即置于2.5%戊二醛固定液中固定，經(jīng)脫水、滲透、包埋聚合、切片及染色后，投射電鏡下觀察線粒體形態(tài)及自噬小體。

1.6.6 Drp1、LC3 蛋白的表達(dá) 1）免疫組織化學(xué)法（IHC）檢測：取未染色切片，用3%H2O2室溫封閉10 min，磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗3 次，置于0.01%枸櫞酸鹽緩沖液中，微波抗原修復(fù)，閉光孵育封閉，分別加入Drp1、LC3 一抗，4 ℃過夜后孵育二抗，DAB 顯色后封片，顯微鏡拍照測定吸光度。2）免疫熒光定位：在“1.6.5”項下方法基礎(chǔ)上，使用熒光二抗，熒光電子顯微鏡觀察Drp1、LC3 蛋白的定位表達(dá)情況。3）Western blotting 測定：提取并分離結(jié)腸上皮線粒體蛋白，PAGE凝膠電泳并轉(zhuǎn)膜，1%BSA 封閉，4 ℃一抗過夜，結(jié)合二抗，避光檢測。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

圖片分析采用Image Pro Plus 5 軟件分析，使用SPSS25.0 軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析和t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠一般情況及DAI評分比較

見表1。治療周期結(jié)束后，記錄各組小鼠第1～14日體質(zhì)量、便血情況和生存情況。與模型組相比，空白組小鼠一般情況良好，毛色明潤光澤，反應(yīng)靈敏，大便正常。模型組則懶動、反應(yīng)遲鈍、毛色灰暗、體質(zhì)量下降，并出現(xiàn)稀便甚至血便。給予加味白頭翁湯高劑量治療，情況改善，小鼠活動增多，大便明顯好轉(zhuǎn)，DAI分?jǐn)?shù)較模型組顯著降低（P＜0.05）。

表1 各組小鼠一般情況及DAI評分比較（分，±s）

表1 各組小鼠一般情況及DAI評分比較（分，±s）

注：與空白組比較，*P ＜0.05；與模型組比較，△P ＜0.05。下同。

組 別空白組模型組美沙拉嗪組加味白頭翁湯高劑量組加味白頭翁湯中劑量組加味白頭翁湯低劑量組n8 8 8 8 8 8體質(zhì)量下降—3.51±0.84 1.66±0.55△0.67±0.52△2.45±0.45 3.62±0.67大便性狀—3.31±0.82 2.47±0.55△2.33±0.82△2.91±0.56 3.17±0.64隱血—3.51±0.84 2.29±0.45△2.67±0.52△3.13±0.72 3.29±0.64 DAI—1.17±0.41 1.60±0.27△1.53±0.45 1.08±0.22 1.13±0.39

2.2 各組小鼠結(jié)腸長度比較

見圖1、表2。截取盲腸至肛管上3 mm 處結(jié)腸，測量其長度。結(jié)果顯示，模型組結(jié)腸顯著縮短，與模型組比較，美沙拉嗪組及加味白頭翁湯高劑量組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而加味白頭翁湯中劑量、低劑量對模型小鼠結(jié)腸長度無影響。

圖1 各組小鼠結(jié)腸長度

表2 各組小鼠結(jié)腸長度比較（cm，±s）

表2 各組小鼠結(jié)腸長度比較（cm，±s）

組 別空白組模型組美沙拉嗪組加味白頭翁湯高劑量組加味白頭翁湯中劑量組加味白頭翁湯低劑量組n8 8 8 8 8 8結(jié)腸長度9.86±0.51△2.01±0.47 5.36±0.25△4.55±0.38△3.45±0.35 3.27±0.22

2.3 各組小鼠結(jié)腸組織中SOD、IL-6含量比較

見表3。與空白組比較，UC 小鼠結(jié)腸組織中SOD顯著降低，而炎癥因子IL-6明顯高表達(dá)（P＜0.05）。與模型組比較，美沙拉嗪組與加味白頭翁湯高劑量組SOD 水平明顯上升，IL-6 水平則明顯降低（P＜0.05），且加味白頭翁湯高劑量組與美沙拉嗪組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；而加味白頭翁湯中劑量、低劑量組與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。提示加味高劑量白頭翁湯可以抑制DSS 誘導(dǎo)的急性UC 黏膜組織的炎癥反應(yīng)。

表3 各組小鼠SOD、IL-6含量比較（±s）

表3 各組小鼠SOD、IL-6含量比較（±s）

組 別空白組模型組美沙拉嗪組加味白頭翁湯高劑量組加味白頭翁湯中劑量組加味白頭翁湯低劑量組n8 8 8 8 8 8 SOD（U/mL）72.13±15.68 24.75±5.20*63.18±11.04△59.74±10.26△41.03±10.72 37.66±8.43 IL-6（pg/mL）132.71±29.02 427.69±73.77*215.12±48.35△238.20±44.76△366.37±72.01 396.17±51.63

2.4 各組小鼠結(jié)腸上皮組織病理學(xué)比較

與模型組相比，美沙拉嗪組及加味白頭翁湯高劑量組炎癥細(xì)胞浸潤顯著減少，但加味白頭翁高劑量組仍可見輕度的腺體萎縮。見圖2。

圖2 各組小鼠結(jié)腸黏膜損傷情況（HE染色，400倍）

2.5 各組小鼠結(jié)腸上皮線粒體ATP、線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ/Ⅲ比較

見表4。與模型組比較，空白組、美沙拉嗪組以及加味白頭翁湯高劑量組ATP、線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ/Ⅲ均呈現(xiàn)高表達(dá)（P＜0.05）。

表4 各組小鼠結(jié)腸上皮線粒體ATP、線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ/Ⅲ比較（±s）

表4 各組小鼠結(jié)腸上皮線粒體ATP、線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ/Ⅲ比較（±s）

組別空白組模型組美沙拉嗪組加味白頭翁湯高劑量組加味白頭翁湯中劑量組加味白頭翁湯低劑量組n8 8 8 8 8 8 ATP（μ/mol）66.31±10.24△38.19±4.74 56.26±9.59△49.63±7.52△40.85±8.29 43.12±4.07線粒體復(fù)合物Ⅲ（U/g）107.23±13.88△59.41±14.02 82.03±11.65△70.69±8.21△52.79±5.56 49.77±7.64線粒體復(fù)合物Ⅰ（U/g）144.80±39.51△53.45±9.34 88.29±10.05△79.66±13.35△60.13±8.99 63.29±7.12

2.6 各組小鼠結(jié)腸上皮線粒體動力和自噬比較

與空白組比較，模型組結(jié)腸上皮線粒體LC3 高表達(dá)（P＜0.05）；與模型組比較，加味白頭翁湯高劑量組以及美沙拉嗪組LC3 蛋白含量表達(dá)呈不同程度升高，但無顯著差異（P＞0.05）；與空白組比較，模型組結(jié)腸上皮Drp1表達(dá)明顯升高（P＜0.05），這種趨勢同樣出現(xiàn)在加味白頭翁湯中、低劑量組；與模型組比較，加味白頭翁湯高劑量組以及美沙拉嗪組Drp1 表達(dá)均有不同程度降低（P＜0.05）。見圖3、表5。美沙拉嗪組與加味白頭翁湯高劑量組Drp1、LC3 高表達(dá)，趨勢一致，且Drp1、LC3共定位，相互影響，見圖4。透射電子顯微鏡觀察結(jié)腸組織線粒體的分裂和自噬情況，結(jié)果顯示，較空白組，模型組線粒體明顯腫脹變形，分裂增多，且存在自噬激活狀態(tài)；而美沙拉嗪組和加味白頭翁湯高劑量組分裂減少，自噬激活明顯增多，見圖5。應(yīng)用了分裂抑制劑Mdivi-1 和自噬激活劑雷帕霉素（Rap），WB結(jié)果顯示，與模型組比較，美沙拉嗪組和加味白頭翁湯高劑量組LC3Ⅱ/Ⅰ顯著高表達(dá)（P＜0.05），然而使用Mdivi-1后，加味白頭翁湯高劑量+Mdivi-1組LC3Ⅱ/Ⅰ表達(dá)較加味白頭翁湯高劑量組顯著降低（P＜0.05），使用Rap 后，自噬明顯被激活（P＜0.05）；與空白組比較，模型組Drp1 表達(dá)顯著下降（P＜0.05），美沙拉嗪組和加味白頭翁湯組能夠改變這種趨勢，促進(jìn)Drp1高表達(dá)（P＜0.05），在加味白頭翁湯基礎(chǔ)上使用Mdivi-1，Drp1表達(dá)顯著降低（P＜0.05），并且施加Rap并未對Drp1表達(dá)造成影響（P＞0.05），見圖6、表6。

圖3 各組小鼠線結(jié)腸上皮線粒體Drp1、LC3表達(dá)的影響（IHC，400倍）

圖4 各組小鼠結(jié)腸上皮線粒體Drp1、LC3表達(dá)的影響（IHC，200倍）

圖5 各組小鼠結(jié)腸上皮線粒體分裂及自噬的影響（TEM，600倍）

圖6 各組大鼠結(jié)腸上皮線粒體Drp1及LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達(dá)的影響

表5 各組小鼠結(jié)腸上皮Drp1及LC3蛋白表達(dá)比較（±s）

表5 各組小鼠結(jié)腸上皮Drp1及LC3蛋白表達(dá)比較（±s）

組 別空白組模型組美沙拉嗪組加味白頭翁湯高劑量組加味白頭翁湯中劑量組加味白頭翁湯低劑量組n8 8 8 8 8 8 LC3 35.36±7.86△69.85±11.32*60.80±12.75*67.38±10.97*44.73±9.69 55.24±10.18 Drp1 22.46±5.31△44.94±9.37*29.49±6.09△18.06±4.52△51.84±9.91 40.91±9.58

表6 各組小鼠結(jié)腸上皮線粒體Drp1及LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達(dá)比較（±s）

表6 各組小鼠結(jié)腸上皮線粒體Drp1及LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達(dá)比較（±s）

注：與加味白頭翁湯高劑量組比較，▲P ＜0.05。下同。

組 別空白組模型組美沙拉嗪組加味白頭翁湯高劑量組加味白頭翁湯高劑量+Mdivi-1組加味白頭翁湯高劑量+Rap組n8 8 8 8 8 8 LC3Ⅱ/Ⅰ0.34±0.05△0.50±0.12*0.67±0.06△*0.73±0.10△*0.63±0.07*▲0.75±0.13△*Drp1 0.66±0.09△0.30±0.06*0.51±0.11△0.42±0.09△0.29±0.06*0.50±0.10△

3 討 論

中醫(yī)學(xué)將UC 歸屬為“泄瀉”“休息痢”“腸風(fēng)”等范疇，病機為本虛標(biāo)實，由多種病因引起脾胃虛弱，中焦運化失司，濕熱內(nèi)壅大腸致?。?-5，14］。白頭翁湯出自張仲景《傷寒論》，由白頭翁、黃連、黃柏、秦皮4味藥物組成。該方以白頭翁清熱解毒、涼血止痢為君；黃連、黃柏、秦皮清熱燥濕、瀉火解毒為臣。白頭翁湯是治療痢疾的經(jīng)方。有研究表明，白頭翁湯可修復(fù)UC小鼠結(jié)腸組織黏膜組織局部損傷，降低血清與結(jié)腸組織中IL-1β 與TNF-α 水平，抑制炎癥因子表達(dá)［6］?；诎最^翁湯具有抗菌、抗炎、修復(fù)潰瘍等作用［7，15］，借助現(xiàn)代整合藥理學(xué)平臺（TCMIP）、靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建等數(shù)據(jù)分析及《潰瘍性結(jié)腸炎中醫(yī)診療共識意見》，本研究在白頭翁湯基礎(chǔ)上進(jìn)行加味，應(yīng)用了清熱利濕、涼血通便的青蒿，有益消炎退熱降溫［16-17］；虎杖祛風(fēng)除濕，其有效成分白藜蘆醇能抗氧自由基［18-19］。加味白頭翁湯中青蒿、虎杖與金銀花、黃芪、槐花、炙甘草等同用，共奏益氣除濕、清熱解毒之效。

本研究采用3.5%DSS 7 d 建立急性UC 小鼠模型，與空白組小鼠比較，UC 小鼠結(jié)腸黏膜腺體受損嚴(yán)重，腺體萎縮，隱窩分支。組織病理學(xué)評分提示，模型組小鼠病理改變明顯升高，穩(wěn)定復(fù)制了急性UC模型。

有研究表示，地馬煎劑可干預(yù)UC 大鼠模型，通過激活HIF-1α/BNIP3/Beclin-1 線粒體自噬通路進(jìn)而對抗炎癥活動［20］。本研究同樣也證實，自擬加味白頭翁湯高劑量組可顯著改善急性期UC小鼠結(jié)腸上皮炎癥，組織中SOD 升高，而IL-6 明顯下降，病理組織切片炎癥細(xì)胞浸潤顯著減少；小鼠活動增多，大便明顯好轉(zhuǎn)，DAI分?jǐn)?shù)較模型組顯著降低。

氧化應(yīng)激和自噬異常與UC炎癥存在密切聯(lián)系，而線粒體是造成氧化應(yīng)激、自噬的基礎(chǔ)。線粒體自噬通過清除功能失調(diào)的細(xì)胞器來保持細(xì)胞活性，旨在限制ROS 等氧化因子，抑制炎癥的產(chǎn)生［8-10］。線粒體動力蛋白（OPA1/Drp1）維持著線粒體的動態(tài)活性；一旦線粒體融合和裂變失常，可能引發(fā)異常線粒體聚集，導(dǎo)致線粒體自噬受損［11］。所以，線粒體自噬受損也可能是UC 腸黏膜上皮細(xì)胞損傷的重要潛在因素。為了探討線粒體自噬對急性UC 腸黏膜上皮細(xì)胞損傷的影響及其是否參與加味白頭翁湯的藥效調(diào)節(jié)，我們首先應(yīng)用紫外分光光度儀和酶標(biāo)儀，分別檢測小鼠結(jié)腸上皮線粒體ATP、線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ/Ⅲ的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，與模型組比較，空白組、美沙拉嗪組以及加味白頭翁湯高劑量組的ATP、線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ/Ⅲ均呈現(xiàn)高表達(dá)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。免疫組化觀察到，模型組結(jié)腸上皮線粒體LC3 及Drp1 高表達(dá)，加味白頭翁湯高劑量組以及美沙拉嗪組Drp1 表達(dá)均有不同程度降低，證實加味白頭翁湯高劑量組能夠改善線粒體活性，激活線粒體自噬蛋白LC3，減少分裂蛋白Drp1 表達(dá)。免疫熒光和透射電子顯微鏡，觀察到加味白頭翁湯高劑量組LC3 與Drp1 共定位，表明其藥效的發(fā)揮是線粒體自噬與分裂的相互作用。

進(jìn)一步解析加味白頭翁湯治療UC的機制，在加味白頭翁湯基礎(chǔ)上，分別施加了自噬的激活工具藥物雷帕霉素Rapamycin，線粒體分裂的抑制劑Mdivi-1（具有選擇性和細(xì)胞穿膜性，抑制Drp1）。結(jié)果表明，加味白頭翁湯高劑量組自噬活性（LC3Ⅰ向Ⅱ轉(zhuǎn)化率）和分裂蛋白Drp1 明顯高于模型組，這也驗證了當(dāng)線粒體分裂開始時，胞質(zhì)中的Drp1 會被招募至線粒體外膜表面，與外膜表面上的線粒體分裂因子結(jié)合，并導(dǎo)致線粒體的內(nèi)外膜向內(nèi)凹陷Drp1聚集在凹陷部位，最終導(dǎo)致內(nèi)外膜的斷裂，使一個線粒體分裂成兩個子線粒體［21-22］，然后引發(fā)正常的自噬激活。施加Mdivi-1 后，Drp1 表達(dá)下降，同時自噬活性受到抑制，然而，加Rap后，僅加大了LC3Ⅱ/Ⅰ的表達(dá)，并沒有改變Drp1 的表達(dá)，該結(jié)果表明線粒體分裂處于自噬的上游，加味白頭翁湯通過增加線粒體外膜Drp1 的聚集而激活自噬，減輕UC 炎癥。IHC 和WB 檢測的LC3 及Drp1 結(jié)果呈現(xiàn)并不完全一致，正是因為胞質(zhì)和線粒體膜位置的不同。

綜上所述，本研究初步表明了加味白頭翁湯對急性UC小鼠結(jié)腸黏膜炎癥有一定的改善和修復(fù)作用，機制可能是通過增加線粒體分裂蛋白Drp1、激活自噬、減少IL-6 等炎癥因子，最終達(dá)到治療UC 的作用。這一發(fā)現(xiàn)為闡述中醫(yī)藥治療UC 機制提供了實驗依據(jù)。下一步本課題組將分析加味白頭翁湯與線粒體融合因子的相關(guān)性，并分析其對自噬的影響及其信號通路。