益氣活血生肌方對肛瘺術(shù)后急性感染性創(chuàng)面模型大鼠Vimentin、TNF-α和IL-4表達水平的影響*

張飛功 李猶龍 嚴(yán) 樺

（上海市靜安區(qū)閘北中心醫(yī)院，上海 200070）

肛瘺是因細菌感染肛門腺體及肛隱窩所導(dǎo)致的肛門部疾病，在臨床上屬于常見病、多發(fā)?。?］。肛瘺由于發(fā)病部位特殊，不易保持創(chuàng)面的清潔干燥，加之術(shù)后對肛緣皮膚黏膜的損傷，且伴隨著局部組織的壞死和滲出，使創(chuàng)面易于感染，導(dǎo)致病程較長［2-3］。中醫(yī)學(xué)中肛瘺術(shù)后創(chuàng)面感染屬“潰瘍”范疇，其病機為瘀血阻絡(luò)，氣血不通，失于濡養(yǎng)，導(dǎo)致創(chuàng)面水腫等，創(chuàng)面愈合緩慢，以益氣活血生肌為治法［4］。益氣活血生肌方具有清熱解毒、活血止痛、斂瘡生肌的作用，可達到緩解術(shù)后疼痛、水腫等并發(fā)癥，促進創(chuàng)面向愈的目的［5］。皮形蛋白（Vimentin）屬中間絲蛋白類，在中胚層起源的細胞中表達，如成纖維細胞、內(nèi)皮細胞和白細胞等，其高表達可促進疾病的發(fā)展［6］。腫瘤壞死因子-α（TNF-α）可提高中性粒細胞的吞噬能力，促進中性粒細胞黏附到內(nèi)皮細胞，刺激機體局部炎癥反應(yīng)［7］。白細胞介素-4（IL-4）是一種重要的炎癥因子，具有活化B 細胞、刺激T 細胞增殖并參與炎癥反應(yīng)等功能，從而加重肛瘺創(chuàng)面，延緩愈合［8］。為此，本研究探討益氣活血生肌方對肛瘺術(shù)后急性感染性創(chuàng)面模型大鼠Vimentin、TNF-α、IL-4表達水平的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級雄性SD大鼠112只購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（湘）2020-0005，飼養(yǎng)于醫(yī)院實驗中心，體重280～340 g。于清潔動物實驗室飼養(yǎng)，操作過程符合動物倫理要求，動物飼養(yǎng)溫度20～28 ℃，相對濕度50%～60%，通風(fēng)良好，環(huán)境安靜，實驗期間自由進食飲水，每日黑暗和光照各12 h。

1.2 試藥與儀器

益氣活血生肌方（黃芪20 g，太子參15 g，白術(shù)15 g，淮山藥15 g，當(dāng)歸20 g，熟地黃10 g，丹參25 g，川芎15 g，薏苡仁20 g，茯苓10 g，甘草6 g）由醫(yī)院制劑室制備，水煎煮，合并2次濾液，定容至20 mL，每毫升相當(dāng)于0.4 g生藥。濕潤燒傷膏，汕頭市美寶制藥公司；1%戊巴比妥鈉，上海上藥新亞藥業(yè)公司。酶標(biāo)儀，日本Bio-Rad公司；臺式離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠；酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，上海酶聯(lián)科研公司；隔水式恒溫培養(yǎng)箱，山東博科公司。Vimentin 蛋白單抗由上海易利生物科技公司，貨號：BLL101178E，批號：201911016。TNF-α檢測試劑盒，南京建成生物公司，貨號：ml002859，批號：201909023。IL-4 檢測試劑盒，信裕生物公司，貨號：xy-E10165，批號：201907028。

1.3 模型制備［9］

大鼠造模前禁水、禁食6 h，術(shù)前在脊柱兩側(cè)手術(shù)部位備皮，1%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉。術(shù)區(qū)常規(guī)備皮、消毒，大鼠脊柱尾部的一側(cè)剪1 個約為2.0 cm×2.0 cm 大小的全層皮膚創(chuàng)面，切除皮膚全層深達肌層，并充分止血?？瞻捉M大鼠創(chuàng)面滴加0.2 mL 的生理鹽水，然后用油紗輔料覆蓋。實驗組、對照組大鼠皮膚創(chuàng)面分別滴加制備好的糞便混懸液1.0 mL，再加蓋醫(yī)用紗布包扎處理，之后把大鼠放回籠中等待麻醉蘇醒。每天兩組按同樣的步驟操作1 次，約5 d 后，如果有膿性分泌物，則表示傷口已發(fā)生急性感染。造模成功后，為防止相互舔舐及撕咬影響創(chuàng)面，每只大鼠單獨飼養(yǎng)。

1.4 分組與治療

將造模后的112 只大鼠按照隨機數(shù)字表法均分為4 組，分別為空白組、模型組、濕潤燒傷膏組和益氣活血生肌方組，每組28 只。各組大鼠均采用創(chuàng)面絡(luò)合碘消毒，生理鹽水沖洗創(chuàng)面?？瞻捉M：早晚用生理鹽水棉球清創(chuàng)后以無菌紗布覆蓋固定，并涂抹0.2 g 的凡士林膏。模型組：每日早晚用生理鹽水棉球清創(chuàng)并予以無菌紗布覆蓋固定。濕潤燒傷膏組：用濕潤燒傷膏油紗條覆蓋創(chuàng)面，再蓋無菌紗布固定，每日早晚換藥各1次，治療2 周。益氣活血生肌方組：用濕潤燒傷膏油紗條覆蓋創(chuàng)面，再蓋無菌紗布固定。按照成人體重70 kg為標(biāo)準(zhǔn)，換為大鼠所需劑量（g/kg）=成人所需藥量（g/kg）×6.3，再根據(jù)每100 g灌胃1 mL的標(biāo)準(zhǔn)計算，每只大鼠每天以3 mL 益氣活血生肌方湯藥灌胃治療，每日早晚換藥及灌胃各1次。各組均連續(xù)治療兩周。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 創(chuàng)面愈合率 治療3、7、14 d后對創(chuàng)面面積進行測定：固定大鼠，創(chuàng)面周圍毛發(fā)進行修剪，將保鮮膜平鋪于充分暴露的創(chuàng)面上，用細中性記號筆在保鮮膜上畫創(chuàng)面標(biāo)記，再將標(biāo)記好的保鮮膜平鋪在心電圖紙張上，并對創(chuàng)面進行面積計算，最終算出愈合率。創(chuàng)面愈合率=（原創(chuàng)面面積-未愈合創(chuàng)面面積）÷原創(chuàng)面面積×100%。

1.5.2 肛瘺創(chuàng)面分泌物及水腫評分 治療后3、7、14 d對大鼠的肛瘺創(chuàng)面水腫評分進行測定：0 分為創(chuàng)面無水腫；1 分為創(chuàng)面少量分泌物，輕度水腫；2 分為創(chuàng)面中度水腫；3 分為創(chuàng)面分泌物較多，重度水腫。分值數(shù)越高表示創(chuàng)面分泌物與創(chuàng)面水腫越嚴(yán)重。

1.5.3 肛瘺創(chuàng)面肉芽生長評分 治療后3、7、14 d，對大鼠的肛瘺創(chuàng)面肉芽生長情況測定：0 分指肉芽紅潤顆粒狀，輕擦出血；1 分指肉芽色淡紅均勻，輕擦出血；2 分指肉芽色蒼白凹凸，擦之不出血；3 分指肉芽色晦暗，局部無肉芽，擦之不出血。分值數(shù)越高表示創(chuàng)面肉芽生長越差。

1.5.4 創(chuàng)面組織IL-4、TNF-α 表達水平 采用無菌刮勺于大鼠肛瘺創(chuàng)面上刮取1 g 的新鮮全層組織，-60 ℃保存。使用低溫勻漿器中放入0.3 g 組織，制成組織勻漿液，加入裂解液（PIRA）950 μL，再向勻漿液中加苯甲基硫酰氟溶液35 μL進行搖勻，20 min后4 ℃、12 000 r/min離心10 min后留取上清液。應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）進行檢測，對IL-4、TNF-α 表達水平測定，并嚴(yán)格遵守試劑盒（默賽飛公司）說明書操作。

1.5.5 Vimentin 蛋白檢測 采用蛋白免疫印跡法（WB）檢測Vimentin蛋白表達，分別在給藥后3、7、14 d，無菌條件下取創(chuàng)面中心至創(chuàng)緣間刮取新生肉芽組織，加入1 mL 的細胞裂解液，抽提各組組織中的總蛋白，并采用BCA 法測定蛋白濃度，取蛋白樣品SDS-PAGE凝膠電泳，然后全部轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，加入5%脫脂奶粉封閉液，室溫封閉1～2 h。吸棄封閉液，TBST 洗膜3 次，加入用5%脫脂奶粉配制好的一抗工作液兔抗人Vimentin（1∶500），搖床上孵育1 h，4 ℃孵育過夜?；厥找豢梗肨BST 洗膜3 次，加入羊抗兔二抗工作液（1∶5 000），室溫孵育1～2 h。洗膜，放入自動顯影儀中曝光顯影，用Image J 軟件測出各組Vimentin 蛋白灰度值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠肛瘺創(chuàng)面愈合率比較

見表1。治療3 d 后，各組的創(chuàng)面愈合率對比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），治療7、14 d 后，濕潤燒傷膏組和益氣活血生肌方組的創(chuàng)面愈合率明顯高于空白組（P＜0.05），益氣活血生肌方組的創(chuàng)面愈合率明顯高于濕潤燒傷膏組（P＜0.05）。

表1 各組大鼠肛瘺創(chuàng)面治療愈合率比較（%，±s）

表1 各組大鼠肛瘺創(chuàng)面治療愈合率比較（%，±s）

注：與空白組比較，*P ＜0.05；與模型組比較，#P ＜0.05；與濕潤燒傷膏組比較，△P ＜0.05。下同。

組 別空白組模型組濕潤燒傷膏組益氣活血生肌方組n7 7 7 7治療3 d 9.18±2.94 8.94±2.97 10.24±2.53 10.67±2.83治療7 d 37.53±4.61 24.39±6.78*54.29±5.29*#65.73±5.47*#△治療14 d 67.39±4.15 42.57±4.87*74.61±4.76*#97.9±5.43*#△

2.2 各組大鼠肛瘺創(chuàng)面分泌物及水腫評分、創(chuàng)面肉芽生長評分比較

見表2、表3。治療3 d 后，各組的大鼠肛瘺創(chuàng)面分泌物及水腫評分、創(chuàng)面肉芽評分對比無明顯差異（P＞0.05），治療7、14 d 后，濕潤燒傷膏組和益氣活血生肌方組的大鼠肛瘺創(chuàng)面分泌物及水腫評分、創(chuàng)面肉芽評分明顯低于空白組（P＜0.05），益氣活血生肌方組的大鼠肛瘺創(chuàng)面分泌物及水腫評分、創(chuàng)面肉芽評分明顯低于濕潤燒傷膏組（P＜0.05）。

表2 各組大鼠肛瘺創(chuàng)面分泌物及水腫評分比較（分，±s）

表2 各組大鼠肛瘺創(chuàng)面分泌物及水腫評分比較（分，±s）

組 別空白組模型組濕潤燒傷膏組益氣活血生肌方組n7 7 7 7治療3 d 2.61±0.18 2.63±0.22 2.57±0.18 2.46±0.20治療7 d 2.03±0.26 2.35±0.37*1.98±0.26*#1.17±0.18*#△治療14 d 1.62±0.23 1.97±0.29*1.28±0.32*#0.70±0.12*#△

表3 各組大鼠肛瘺創(chuàng)面肉芽生長評分比較（分，±s）

表3 各組大鼠肛瘺創(chuàng)面肉芽生長評分比較（分，±s）

組 別空白組模型組濕潤燒傷膏組益氣活血生肌方組n7 7 7 7治療3 d 2.41±0.40 2.43±0.43 2.39±0.45 2.31±0.44治療7 d 1.75±0.36 2.03±0.44*1.41±0.28*#1.15±0.19*#△治療14 d 1.46±0.31 1.64±0.38*0.98±0.45*#0.57±0.16*#△

2.3 各組大鼠肛瘺創(chuàng)面血清炎性因子水平比較

見表4。治療3 d 后，各組大鼠創(chuàng)面TNF-α、IL-4水平對比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），治療7、14 d后，濕潤燒傷膏組和益氣活血生肌方組創(chuàng)面TNF-α、IL-4水平明顯低于空白組與模型組（P＜0.05），益氣活血生肌方組的創(chuàng)面TNF-α、IL-4 水平顯著低于濕潤燒傷膏組（P＜0.05）。

表4 各組大鼠肛瘺創(chuàng)面TNF-α、IL-4水平比較（ng/L，±s）

表4 各組大鼠肛瘺創(chuàng)面TNF-α、IL-4水平比較（ng/L，±s）

IL-4 TNF-α組別空白組模型組濕潤燒傷膏組益氣活血生肌方組n7 7 7 7治療3 d 77.63±12.41 79.29±12.70*75.26±10.42*#74.96±11.23*#△治療7 d 72.61±8.12 76.84±7.49*63.19±6.42*#50.64±5.61*#△治療14 d 51.34±4.08 52.18±5.41*47.52±3.35*#38.24±3.12*#△治療3 d 59.28±8.07 60.13±8.11*56.12±6.75*#55.98±7.24*#△治療7 d 52.40±6.88 50.78±7.27*48.17±5.30*#39.22±4.51*#△治療14 d 44.62±5.03 46.28±5.17*37.26±4.22*#25.38±3.18*#△

2.4 各組肛瘺創(chuàng)面Vimentin蛋白表達水平比較

見表5。治療3 d后，各組的大鼠肛瘺創(chuàng)面Vimentin蛋白表達對比無明顯差異（P＞0.05），治療后7、14 d，濕潤燒傷膏組和益氣活血生肌方組的大鼠肛瘺創(chuàng)面Vimentin 蛋白表達明顯低于空白組（P＜0.05），益氣活血生肌方組的大鼠肛瘺創(chuàng)面Vimentin蛋白表達顯著低于濕潤燒傷膏組（P＜0.05）。

表5 各組大鼠肛瘺創(chuàng)面Vimentin蛋白表達水平比較（±s）

表5 各組大鼠肛瘺創(chuàng)面Vimentin蛋白表達水平比較（±s）

組 別空白組模型組濕潤燒傷膏組益氣活血生肌方組n7 7 7 7治療3 d 1.96±0.23 2.03±0.24 1.98±0.21 1.91±0.31治療7 d 1.69±0.21 1.86±0.27*1.44±0.19*#1.19±0.15*#△治療14 d 1.39±0.17 1.57±0.22*1.21±0.11*#0.78±0.09*#△

3 討 論

肛瘺是結(jié)直腸肛門外科的常見疾病，其主要治療手段為手術(shù)根治，可徹底排凈病灶膿液、減低疾病復(fù)發(fā)率，但為保證病灶的清除，往往造成創(chuàng)緣皮膚缺損，是肛瘺創(chuàng)面難愈合的重要原因［10］。此外，病灶位于消化道末端，糞便反復(fù)排出，且局部潮濕，得不到及時的處理，易致大量細菌聚集，誘發(fā)Vimentin 蛋白表達升高，引起炎癥等反應(yīng)［11］。肛瘺術(shù)后創(chuàng)面受炎癥和外界因素的影響，易導(dǎo)致肉芽水腫、腐肉滋生、愈合時間延長等情況，此時，創(chuàng)面損傷區(qū)浸潤大量炎性細胞（IL-4、TNF-α）反應(yīng)，也是造成肛瘺術(shù)后康復(fù)緩慢的重要原因［12］。術(shù)后早期干預(yù)創(chuàng)面的生長環(huán)境，減少組織壞死、減輕炎癥反應(yīng)、加快腐肉脫落是有效促進肉芽組織重塑、肛瘺創(chuàng)面愈合的途徑［13］。因此，尋找有效促進肛瘺術(shù)后創(chuàng)面愈合的藥物，成為縮短肛瘺病程、減輕痛苦的有效辦法［14］。濕潤燒傷膏是一種油性藥膏，可在創(chuàng)面形成保護膜，避免神經(jīng)末梢受到外界因素刺激，其不足之處在于揭去藥膏紗布時，可牽扯創(chuàng)面使剛剛愈合的創(chuàng)面再度撕裂，延長愈合過程。鑒于上述不足，本研究中加用益氣活血生肌方，以促進創(chuàng)面濕潤、有效改善創(chuàng)面微循環(huán)、加快創(chuàng)面恢復(fù)［15］。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為肛瘺術(shù)后創(chuàng)面屬于金刃所傷的范疇，在肛瘺手術(shù)過程中，雖然去除了病灶的病變組織，但同時也會損傷到部分正常組織，從而使得機體氣血經(jīng)絡(luò)受阻，血液瘀滯，創(chuàng)面局部的營養(yǎng)血供受到影響，因而也導(dǎo)致了創(chuàng)面愈合緩慢［16］。由此可知，肛瘺術(shù)后創(chuàng)面長期不愈合，可以辨證為氣滯血瘀、氣血虧虛證，因此我們制定了益氣活血生肌方［17］。本方采用益氣活血法為原則，健脾益氣、活血養(yǎng)血，使整個機體和局部的氣血及脈道調(diào)和通暢，即所謂“通則不痛”“榮則不痛”，從而緩解創(chuàng)面分泌物及水腫等并發(fā)癥，使肛瘺創(chuàng)面加快愈合［18］。本研究結(jié)果顯示，各組大鼠肛瘺創(chuàng)面治療7、14 d 后，益氣活血生肌方組的大鼠創(chuàng)面愈合率、創(chuàng)面分泌物及水腫評分均優(yōu)于其他組，治療效果較好。說明益氣活血生肌方中藥治療具有增加創(chuàng)面微循環(huán)、加大毛細血管擴張、有效降低創(chuàng)面水腫、保持創(chuàng)面濕潤的作用。

現(xiàn)代藥理研究表明，益氣活血生肌方可使創(chuàng)面的微血管循環(huán)加快，進而使得肛瘺術(shù)后創(chuàng)面上的新生肉芽組織加快生長，有利于促進創(chuàng)面恢復(fù)［19］。其方中黃芪可抑制體內(nèi)的自由基，可提高黏膜的免疫能力，對細菌起到抑制作用；太子參具有抗炎、抗菌的作用；白術(shù)可清除機體內(nèi)自由基、調(diào)節(jié)免疫力，還可抑制炎癥、有抑菌的能力；山藥中的山藥多糖能增強免疫力，具有鎮(zhèn)痛、抗炎、抗刺激的作用；當(dāng)歸可增加創(chuàng)面造血微環(huán)境的刺激，加速創(chuàng)面造血細胞的產(chǎn)生；熟地黃能夠抗炎、改善局部微循環(huán)；丹參能夠改善機體的微循環(huán)，具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛的功效；川芎可增加創(chuàng)面組織的周圍血管血流量，起到活血的作用；薏苡仁、茯苓可利水滲濕、排膿；甘草中和藥性，增強鎮(zhèn)痛、抗炎的作用［20］。本研究結(jié)果顯示，各組大鼠肛瘺創(chuàng)面治療7、14 d后，益氣活血生肌方組的大鼠創(chuàng)面中IL-4、TNF-α 表達水平低于其他組，其治療效果較優(yōu)。說明治療肛瘺急性感染創(chuàng)面采用益氣活血生肌方治療，可抑制病原微生物生長，減輕炎癥反應(yīng)，使生長因子聚集，促進創(chuàng)面愈合。

綜上所述，益氣活血生肌方治療肛瘺急性感染效果確切，可促進肛瘺術(shù)后創(chuàng)面愈合，減輕創(chuàng)面分泌物及水腫情況，改善創(chuàng)面Vimentin蛋白含量，降低創(chuàng)面組織中炎癥因子TNF-α、IL-4 水平表達，提高機體抗肛瘺感染的能力。