麻杏解毒合劑通過p38MAPK/AP-1通路對冠狀病毒肺炎模型小鼠炎性因子的調(diào)控作用研究*

邱 敏 劉 莉 江飛龍 朱 青 陳 歡

（1.重慶市中醫(yī)院，重慶 400021；2.重慶醫(yī)科大學(xué)，重慶 401331；3.重慶中醫(yī)藥學(xué)院，重慶 402760）

病毒性肺炎是由病毒感染并蔓延引起肺實質(zhì)炎癥的呼吸道傳染病。近20年來，由SARS冠狀病毒、中東呼吸綜合征冠狀病毒、新型冠狀病毒感染引發(fā)的病毒性肺炎在世界范圍內(nèi)多次暴發(fā)流行，給人們的生命安全帶來了極大的威脅與傷害［1-2］。在新發(fā)突發(fā)呼吸道傳染病的救治過程中，中醫(yī)藥發(fā)揮了重要作用。作者所在中醫(yī)專家組擬定麻杏宣肺解毒湯治療COVID-19患者，對快速改善患者發(fā)熱、咳嗽、胸悶癥狀，減少重癥轉(zhuǎn)化取得較好臨床療效［3］。該協(xié)定處方經(jīng)重慶市藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)制成院內(nèi)制劑——麻杏解毒合劑［4］，用于COVID-19 患者的臨床治療。為進一步闡明麻杏宣肺合劑治療冠狀病毒肺炎，有效防治重癥化轉(zhuǎn)化的療效機制，本實驗建立了基于人血管緊張素-2（hACE2）轉(zhuǎn)導(dǎo)的SARS-CoV-2 spike 假病毒感染病證結(jié)合小鼠肺炎模型，基于p38MAPK/AP-1 信號通路觀察麻杏宣肺合劑對小鼠冠狀病毒肺炎炎性因子調(diào)控的影響。

1 材料與方法

1.1 動物

雄性昆明種（KM）小鼠，60 只，體重（20±2）g，購于重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，動物許可證號：SCXK（渝）2022-0016。小鼠均飼養(yǎng)于IVC 動物房中，12 h/12 h 光暗循環(huán)，溫度20～25 ℃，濕度（50±5）%，標(biāo)準(zhǔn)固體飼料喂養(yǎng)，自由飲水。動物實驗倫理審查編號：IACUC-CQMU-2023-0048。

1.2 實驗藥物

麻杏解毒合劑（生麻黃、杏仁、石膏、浙貝母、蟬蛻、僵蠶、姜黃、桔梗、枳殼、草果、白豆蔻，批號：20220921），由重慶市中醫(yī)院制劑室提供。

1.3 試劑與儀器

重組腺相關(guān)病毒（H16749 pAAV-CMV-hACE2-P2A-TMPRSS2-FLAG，pAAV-hACE2，標(biāo)注滴度＞1×1012vg/mL）（批號：HYKY-211124013-YAAV）、SARSCoV-2 spike 假病毒（pSLenti-CMV-EGFP-3xFLAGEF1-Luc-WPRE，標(biāo)注滴度＞1×107vg/mL）（批號：HYKY-211124001-YSSP），上海和元生物技術(shù)股份有限公司，80 ℃冰箱貯存。p38MAPK抑制劑（SB203580），Sigma 公司（批號：TLB0298）；兔p38MAPK 抗體（批號：8690）、兔Phospho-p38 抗體（批號：4511）、兔c-Jun 抗體（批號：9165）、兔c-Fos 抗體（批號：2250），美國CST公司；β-actin（批號：211051028），北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；RNAiso Plus（批號9019）、M-MLV RTase cDNA 合成試劑盒（批號：RR047A）、SYBR?Premix Ex Taq Ⅱ試劑（批號：AL51023A），TAKARA 公司。小鼠腫瘤壞死因子-α（TNF-α）（批號：A28230874）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）（批號：A20541671）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）（批號：A20921102）、IL-8（批號：A20438213）ELISA試劑盒，海聯(lián)生物科技有限公司；cjun 引物（F：5′-AAGATGGAAACGACCTTCTACG-3′；R：5′-CTTAGGGTTACTGTAGCCGTAG-3′）、c-fos 引物（F：5′-TCTCTAGTGCCAACTTTATCCC-3′；R：5′-GAGATAGCTGCTCTACTTTGCC-3′）、p38MAPK 引物（F：5′-AGGAATTCAATGACGTGTACCT-3′ ；R：5′-AGGTCCCTGTGAATTATGTCAG-3′）和β-actin 引物（F：5′- CTACCTCATGAAGATCCTGACC-3′ ；R：5′-CACAGCTTCTCTTTGATGTCAC-3′），北京擎科生物科技有限公司。PowerpacTM Basic 垂直電泳裝置（美國BIO-RAD 公司）；CFX96 Touch RT-PCR 儀（美國BIORAD 公司）；Syneyy HTX 全自動酶標(biāo)儀（基因有限公司），BBX24B 高通量組織細(xì)胞勻漿機（基因有限公司）；icEN-24R 高速冷凍離心機（杭州奧盛儀器有限公司）；Odyssey Fc 雙色紅外熒光成像系統(tǒng)（美國LI-COR公司）。

1.4 模型制備

60 只KM 小鼠隨機分為6 組，即空白對照組、模型組、p38MAPK 抑制劑組、麻杏解毒合劑高劑量組、麻杏解毒合劑中劑量組、麻杏解毒合劑低劑量組，每組10只。除空白對照組以外，其余5 組均置于（90±3）%相對濕度、無風(fēng)、溫度（4±2）℃的人工氣候箱中，每天持續(xù)4 h后取出，每日1次。寒濕環(huán)境造模第1天，取重組腺相關(guān)病毒（pAAV-hACE2），每50 μL 加入450 μL PBS 渦旋混勻備用；麻醉機異氟烷氣化后麻醉小鼠，采用改良懸掛法，每只小鼠氣管內(nèi)滴注配制好的重組腺病毒液50 μL，給藥完成后放入鼠籠中自然蘇醒。寒濕環(huán)境造模第5 天，取SARS-CoV-2 spike 假病毒，每50 μL 加入250 μL PBS 渦旋混勻備用，各組均采用上述方法，每只小鼠氣管內(nèi)滴注配制好SARS-CoV-2 spike假病毒50 μL，造模結(jié)束，當(dāng)天記為0 d。

1.5 給藥方法

造模后第1 天開始給藥：p38MAPK 抑制劑組小鼠腹腔注射0.2 mL（1 mg/kg 體質(zhì)量）p38MAPK 抑制劑，麻杏高劑量組予0.32 mL/10 g 體質(zhì)量的麻杏解毒合劑灌胃，麻杏中劑量組予0.16 mL/10 g，麻杏低劑量組予0.08 mL/10 g，每日1 次，連續(xù)給藥4 d。麻杏中劑量組每日給藥量的等效劑量為麻杏解毒合劑成人1 d最大量。

1.6 標(biāo)本采集與檢測

1.6.1 血清炎癥因子檢測 實驗結(jié)束后，各組小鼠眼球取血并分離血清，參照ELISA 試劑盒說明書分別檢測血清中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）和白細(xì)胞介素-8（IL-8）的含量水平。

1.6.2 肺組織病理學(xué)分析 小鼠眼球取血死亡后，打開胸腔取小鼠右側(cè)肺部，剪取上部兩葉于4%多聚甲醛中固定。流水沖洗，組織修塊后進行乙醇梯度脫水，二甲苯脫酒精，石蠟包埋，切片（5 μm），60 ℃烘烤切片；切片二甲苯脫蠟，蘇木素-伊紅染色，樹脂封片，顯微鏡下觀察肺組織病理變化。

1.6.3 肺組織p38MAPK、c-jun、c-fos 基因表達(dá) 精確稱取30～40 mg 小鼠肺組織，勻漿后，12 000×g4 ℃離心，取上清液，按照RNAiso Plus 試劑盒說明書提取肺組織總RNA。按照M-MLV RTase cDNA 合成試劑盒說明書，去除基因中DNA 并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。接著，采用SYBR?Premix Ex Taq Ⅱ試劑將上述cDNA進行Real Time PCR 反應(yīng)，檢測p38MAPK、c-jun、c-fos 的mRNA表達(dá)水平，并設(shè)置β-actin 為內(nèi)參對照。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性1 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，72 ℃延伸5 min，共38 個循環(huán)。數(shù)據(jù)處理采用2-ΔΔCt法對目的基因進行相對定量分析。

1.6.4 肺組織p38MAPK、p-p38MAPK、c-jun、c-fos 蛋白表達(dá) 精確稱取50 mg小鼠肺組織，加入裂解液（RIPA∶蛋白酶抑制劑∶磷酸酶抑制劑=100∶1∶1）200 μL 進行勻漿，離心取上清液備用。根據(jù)BCA 蛋白濃度測定試劑盒說明書檢測樣本總蛋白濃度。采用8%SDS-PAGE膠，每孔蛋白上樣量60 μg，隨后以恒壓70 V，30 min后換100 V，50 min 進行電泳，切膠，以250 mA 恒流進行轉(zhuǎn)膜。PVDF 膜浸泡于5%脫脂牛奶中，常溫孵育2 h進行封閉，隨后于4 ℃搖床輕搖16 h，充分孵育一抗（p38MAPK、p-p38MAPK、c-jun 和c-fos 一抗稀釋比例均為1∶1 000），TBST緩沖液洗膜6次后，于室溫孵育二抗2 h。ECL 顯影液后于成像儀上成像，Image-Pro Plus 6.0（IPP 6.0）軟件定量分析光密度值。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6 及IL-8 水平比較

見表1。與空白對照組比較，模型組小鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6 及IL-8 含量均明顯增加（P＜0.01）。與模型組比較，p38 MAPK 抑制劑組小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8 的含量水平均明顯降低（P＜0.01），提示阻斷p38MAPK 通路可以明顯降低病毒性肺炎小鼠血清炎性因子水平。麻杏高劑量組與麻杏中劑量組小鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-8的含量水平較模型組均明顯降低（P＜0.01），麻杏低劑量組小鼠血清IL-6 和IL-8 的含量水平較模型組亦明顯降低（P＜0.01或P＜0.05）。

表1 各組小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-8水平比較（pg/mL，±s）

表1 各組小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-8水平比較（pg/mL，±s）

注：與模型組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01；與空白對照組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01。下同。

組 別空白對照組模型組p38 MAPK抑制劑組麻杏高劑量組麻杏中劑量組麻杏低劑量組n 10 10 10 10 10 10 TNF-α 7.45±2.24 35.63±9.25△△13.54±2.85**17.44±3.93**24.34±3.91*27.22±5.24 IL-1β 25.91±2.58 50.17±0.85△△25.91±2.95**31.13±2.14**32.87±1.70**36.63±1.54*IL-6 21.23±2.77 48.10±4.11△△28.28±3.32**30.32±3.88**36.96±2.68**38.89±3.47**IL-8 11.13±3.06 78.02±8.21△△52.05±7.69**42.62±4.61***54.84±6.02**60.08±8.13*

2.2 各組小鼠肺組織病理學(xué)比較

見圖1?？瞻讓φ战M小鼠肺泡結(jié)構(gòu)清晰，間隔無水腫，肺間質(zhì)無炎性細(xì)胞浸潤，細(xì)胞結(jié)構(gòu)顯示正常。模型組小鼠肺組織肺泡壁、肺間質(zhì)（血管周圍）炎性細(xì)胞呈彌漫性浸潤，肺泡壁明顯增厚，細(xì)胞碎片較多，部分小氣道腔內(nèi)見黏液滲出，部分肺泡結(jié)構(gòu)形態(tài)改變。p38 MAPK抑制劑組小鼠肺部組織可見炎性細(xì)胞浸潤，肺泡及肺間質(zhì)可見輕度充血、肺泡壁可見輕度增厚。麻杏低劑量組、麻杏中劑量組和麻杏高劑量組小鼠肺組織亦可見炎性細(xì)胞浸潤，肺泡間隔不同程度增厚。隨著給藥劑量由低到高，小鼠肺組織肺泡壁、肺間質(zhì)（血管周圍）炎性細(xì)胞浸潤由多到少，肺泡壁厚度由厚到薄，而麻杏高劑量組小鼠肺組織與空白對照組小鼠比較，僅見少量炎性細(xì)胞浸潤，肺泡及肺間質(zhì)無明顯充血、肺泡壁無明顯增厚，接近正常水平。

圖1 各組小鼠肺組織病理學(xué)改變比較（HE染色）

2.3 各組小鼠肺組織p38MAPK、c-jun、c-fos 基因表達(dá)水平比較

見表2。與空白對照組比較，模型組小鼠肺組織中c-fos 基因表達(dá)明顯增加（P＜0.05），c-jun 基因表達(dá)明顯下降（P＜0.01），p38 基因表達(dá)無明顯變化（P＞0.05）；與模型組比較，p38 MAPK 抑制劑組和麻杏高劑量組c-fos 基因表達(dá)明顯降低（P＜0.01 或P＜0.05），p38基因表達(dá)無明顯變化（P＞0.05）。

表2 各組小鼠肺組織p38MAPK、c-jun、c-fos基因表達(dá)水平比較（±s）

表2 各組小鼠肺組織p38MAPK、c-jun、c-fos基因表達(dá)水平比較（±s）

組 別空白對照組模型組p38 MAPK抑制劑組麻杏高劑量組麻杏中劑量組麻杏低劑量組n 10 10 10 10 10 10 p38MAPK 1.000±0.542 1.001±0.643 1.198±0.613 1.719±0.805 1.289±0.644 1.584±0.713 c-jun 0.214±0.071 0.049±0.019△△0.183±0.101*0.052±0.014 0.214±0.153 0.097±0.023*c-fos 0.720±0.187 2.593±0.939△1.131±0.617**2.211±0.562*1.776±0.834 2.293±0.698

2.4 各組小鼠肺組織p38MAPK、p-p38MAPK、c-jun、c-fos蛋白表達(dá)比較

見表3、圖2。與空白對照組比較，模型組小鼠肺組織中c-fos、c-jun、p-p38 蛋白表達(dá)均顯著增加（P＜0.05）；與模型組比較，p38 MAPK 抑制劑組、麻杏高劑量組和麻杏低劑量組c-fos 蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.05），麻杏中劑量組c-jun 蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.01）；p38 MAPK 抑制劑組、麻杏高劑量組、麻杏中劑量組和麻杏低劑量組小鼠肺組織中p-38 的總蛋白表達(dá)水平無明顯變化（P＞0.05），而p38 MAPK 抑制劑組及麻杏解毒合劑高、中、低劑量組小鼠肺組織中磷酸化p-38的蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）。

圖2 各組小鼠肺組織p38MAPK、p-p38MAPK、c-jun、c-fos蛋白表達(dá)

表3 各組小鼠肺組織p38MAPK、p-p38MAPK、c-jun、c-fos蛋白表達(dá)比較（±s）

表3 各組小鼠肺組織p38MAPK、p-p38MAPK、c-jun、c-fos蛋白表達(dá)比較（±s）

組 別空白對照組模型組p38 MAPK抑制劑組麻杏高劑量組麻杏中劑量組麻杏低劑量組n 10 10 10 10 10 10 p-p38MAPK 0.424±0.091 0.771±0.116△0.399±0.055*0.418±0.075*0.338±0.138*0.376±0.155*p38MAPK 0.926±0.278 0.940±0.254 0.959±0.263 0.867±0.148 1.029±0.363 1.032±0.266 c-jun 0.407±0.091 0.742±0.086△0.365±0.062*0.757±0.136 0.168±0.043**0.426±0.160 c-fos 0.408±0.131 0.786±0.118△0.319±0.139*0.386±0.124*0.458±0.143 0.422±0.104*

3 討 論

臨床報道表明，COVID-19 主要癥狀包括發(fā)熱、咳嗽、全身肌肉酸痛或疲乏，雖然大多數(shù)患者病情輕微，但少數(shù)患者（高齡或罹患慢性基礎(chǔ)疾病）會出現(xiàn)呼吸困難、嚴(yán)重缺氧，并發(fā)急性呼吸窘迫綜合征，需要住院和機械通氣［5］。而這些重癥患者血清C 反應(yīng)蛋白、血乳酸、乳酸脫氫酶、IL-1β、IL-6 等水平明顯高于輕癥患者，提示由干擾素、IL、TNF-α 和趨化因子過量釋放引起不受控制的全身炎癥反應(yīng)和細(xì)胞因子風(fēng)暴是ARDS的主要機制［6-7］。而體內(nèi)失控的炎癥反應(yīng)已被證實與病毒性肺炎的重癥化密切相關(guān)［8］。本研究表明經(jīng)重組腺相關(guān)病毒（pAAV-hACE2）轉(zhuǎn)導(dǎo)的模型組小鼠在寒濕環(huán)境下，氣管內(nèi)給予SARS-CoV-2 Spike 假病毒感染后，血清炎性因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α 顯著增加（P＜0.01），肺部組織病理切片顯示肺間質(zhì)、肺泡壁炎性細(xì)胞浸潤明顯，肺泡壁充血、水腫，明顯增厚，小氣管中黏液滲出增加，與新冠病毒感染患者臨床病理生理特點吻合［9-10］。而麻杏解毒合劑（高、中劑量組）能明顯降低實驗小鼠血清炎性因子升高水平（P＜0.01 或P＜0.05），顯著減少實驗小鼠肺組織炎性細(xì)胞浸潤，減輕肺泡及肺間質(zhì)充血、水腫，維持肺泡壁細(xì)胞形態(tài)穩(wěn)定及肺泡壁有效換氣的生理厚度，是麻杏解毒合劑能有效改善COVID-19 患者發(fā)熱、咳嗽、喘促臨床癥狀，減少重癥化發(fā)展的藥效學(xué)基礎(chǔ)。

絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）是細(xì)胞內(nèi)重要的信號傳遞者，包含4 個亞家族：C-2Jun N 末端激酶/應(yīng)激活化蛋白激酶（JNKs/SAPKs）、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERKs），ERK5/大絲裂素活化蛋白激酶1（BMK1）以及p38MAPK。其中p38MAPK 信號途徑是MAPK 家族中最重要組成部分，p38MAPK 的激活不僅能促進單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8 等炎性因子，還可介導(dǎo)中性粒細(xì)胞的活化，促進其炎性聚集和呼吸爆發(fā)［11］。研究發(fā)現(xiàn)SARS-CoV-2 感染導(dǎo)致p38MAPK 通路的異常活化，在參與促炎細(xì)胞因子合成和釋放，血管收縮、通透性增高，血栓形成中起關(guān)鍵作用，并與急性肺損傷和心肌功能障礙密切相關(guān)［12］，這也是COVID-19 患者重癥化的重要原因［13］。本研究顯示模型組小鼠肺組織內(nèi)p-p38 蛋白表達(dá)均顯著增加（P＜0.05），而p38 基因表達(dá)和p38 總蛋白水平無明顯變化（P＞0.05），與現(xiàn)有研究報道［14］結(jié)果相似，提示SARS-CoV-2 等病毒感染可能直接導(dǎo)致p38MAPK 蛋白磷酸化，從而介導(dǎo)p38MAPK 通路的異?；罨?。本研究還顯示麻杏解毒合劑能使實驗小鼠肺組織中磷酸化p-38的蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05），揭示其療效靶點在于抑制p38MAPK 蛋白的磷酸化激活，從而中斷由p-p38導(dǎo)致的炎性因子不可控釋放的正反饋回路。

激活蛋白-1（AP-1）是一種由Fos、Jun、激活轉(zhuǎn)錄因子（ATF）亞基的同源二聚體和異二聚體組成，與許多基因的啟動子結(jié)合的中心轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物，是調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化和凋亡的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子［15］。本研究顯示模型組小鼠肺組織中c-fos 基因表達(dá)明顯增加（P＜0.05），c-fos、c-jun 蛋白表達(dá)也顯著增加（P＜0.05），與p-p38 蛋白表達(dá)增加導(dǎo)致AP-1 基因活化有關(guān)；與模型組比較，麻杏高、低劑量組c-fos 蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.05），麻杏中劑量組c-jun 蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.01），顯示麻杏解毒合劑能抑制上游p38MAPK蛋白的磷酸化激活，下調(diào)下游AP-1 基因及蛋白表達(dá)。而相較于本研究結(jié)果中血清炎性因子和p-p38 表達(dá)呈現(xiàn)一致性降低，麻杏解毒合劑對AP-1基因及蛋白表達(dá)未顯示出一致的劑量依賴性降低，我們考慮與AP-1作為基因轉(zhuǎn)錄的分子開關(guān)，受到細(xì)胞因子、生長因子、氧化應(yīng)激、病毒和細(xì)菌感染等多種內(nèi)在和外在的刺激和環(huán)境損傷所誘導(dǎo)活化［16］，受除p38MAPK以外的MAPKs信號通路中JNKs、ERKs、BMK1 和NF-κB 通路等多種信號通路調(diào)節(jié)有關(guān)。

本研究證明麻杏解毒合劑能明顯降低病毒性肺炎小鼠血清炎性因子水平，顯著減輕炎性滲出，其療效機制與麻杏解毒合劑能抑制p38MAPK 蛋白的磷酸化激活，下調(diào)AP-1 基因及蛋白表達(dá)，從而減少炎性因子的合成和釋放，降低冠狀病毒感染導(dǎo)致炎性因子釋放引發(fā)的肺組織損傷有關(guān)。病毒感染導(dǎo)致的炎性反應(yīng)涉及多通路、多靶點的病理生理過程，而復(fù)方中藥在體內(nèi)作用機制也表現(xiàn)多靶點調(diào)節(jié)。本研究僅明確了麻杏解毒合劑對于p38MAPK/AP-1 通路的作用，尚待進行與體內(nèi)炎癥反應(yīng)相關(guān)其他通路的進一步研究。