黃芪甲苷調(diào)節(jié)PI3K/Akt/mTOR信號對慢性間歇性低氧大鼠頦舌肌損傷及自噬反應(yīng)的影響

宋瑋華 李 強(qiáng) 劉月華 關(guān) 超 謝 晶

慢性間歇性低氧(chronic intermittent hypoxia,CIH)是阻塞性睡眠呼吸暫停(obstructive sleep apnea,OSA)的主要病理特征,是OSA等相關(guān)心血管疾病的主要致病因素,其主要發(fā)生機(jī)制是氧化應(yīng)激發(fā)生、炎性細(xì)胞因子過表達(dá)以及細(xì)胞凋亡,導(dǎo)致肌肉代謝受阻,頦舌肌損傷[2]。目前對于OSA等疾病的治療,臨床上常采用持續(xù)正壓通氣,但對于預(yù)防以及治療重癥患者效果不佳,且具有噪音、密閉恐懼等缺點(diǎn)[3]。因此探究新的治療方法對于改善OSA來說至關(guān)重要。黃芪甲苷(astragaloside Ⅳ,ASⅣ)是中藥黃芪的主要有效成分,具有抗氧化、調(diào)節(jié)免疫炎癥等作用[4,5]。研究表明,ASⅣ能夠通過抑制纖維化和Ca2+超載以及減少細(xì)胞凋亡的病理過程發(fā)揮對心肌細(xì)胞的保護(hù)作用[6,7]。研究表明,ASⅣ能夠通過恢復(fù)自噬反應(yīng)的發(fā)生,提高自噬水平以逆轉(zhuǎn)心肌細(xì)胞肥大以及心肌損傷,但其對自噬反應(yīng)的作用機(jī)制尚不清晰[8]。磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信號通路是自噬調(diào)節(jié)中的重要通路[9]。本研究通過建立CIH大鼠模型,探究ASⅣ對PI3K/Akt/mTOR信號通路的調(diào)控作用以及對CIH大鼠頦舌肌損傷及自噬反應(yīng)的影響。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)動物:SPF級雄性SD大鼠96只,8周齡,體質(zhì)量為240±10g,購自上海市計(jì)劃生育科學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動物經(jīng)營部,實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(滬)2018-0006,實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周,實(shí)驗(yàn)室環(huán)境為23℃±2℃,濕度為40%±5%,晝夜時(shí)長12h∶12h。期間飼喂普通鼠糧,自由采食、飲水。

2.藥物、試劑與儀器:ASⅣ(批號:BP8625,原料藥,純度99%,將ASⅣ和0.9%氯化鈉溶液相溶制成濃度分別為2、4、8mg/ml的混懸液)購自北京康納瑞生物科技有限公司;PI3K抑制劑(LY294002,批號:HY-10108,將LY294002和0.9%氯化鈉溶液相溶制成濃度為0.03mg/ml的LY294002溶液)購自美國MCE公司;白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6,批號:SEKR-0005)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α,批號:SEKR-0009)酶聯(lián)免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒、蘇木精-伊紅(hematoxylin eosin,HE)染色試劑盒(批號:G1120)、RIPA高效蛋白裂解液(批號:R0010)、ECL發(fā)光液(批號:PE0010)、DAB顯色試劑盒(批號:DA1016)均購自北京索萊寶生物技術(shù)有限公司;BCA蛋白測定試劑盒(批號:ab20514)、自噬相關(guān)蛋白Beclin1(批號:ab207612)、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3B(microtubule associated protein 1 light chain 3B,LC3B,批號:ab63817)一抗均購自英國Abcam公司;PI3K(批號:4292S)、磷酸化Akt(phosphorylated Akt,p-Akt,批號:4060S)、Akt(批號:9272S)、磷酸化mTOR(phosphorylated mTOR,p-mTOR,批號:5536S)、mTOR(批號:2972S)一抗、羊抗鼠二抗(批號:7074S)均購自武漢市恒沃科技有限公司;Premier3500型全自動血?dú)夥治鰞x購自美國GEM公司;MR-96A型酶標(biāo)儀購自濟(jì)南童鑫生物科技有限公司;Contour Elite型三維光學(xué)顯微鏡購自美國布魯克公司;Tanon 4100型全自動數(shù)碼凝膠成像分析系統(tǒng)購自上海天能科技有限公司。

圖1 各組大鼠頦舌肌組織病理學(xué)變化(HE染色,×200)A.正常組;B.模型組;C.ASⅣ低劑量組;D.ASⅣ中劑量組;E.ASⅣ高劑量組;F.ASⅣ+LY294002組

圖2 各組大鼠頦舌肌組織中Beclin1蛋白表達(dá)(免疫組化染色,×200)A.正常組;B.模型組;C.ASⅣ低劑量組;D.ASⅣ中劑量組;E.ASⅣ高劑量組;F.ASⅣ+LY294002組

圖3 各組大鼠頦舌肌組織中LC3B蛋白表達(dá)(免疫組化染色,×200)A.正常組;B.模型組;C.ASⅣ低劑量組;D.ASⅣ中劑量組;E.ASⅣ高劑量組;F.ASⅣ+LY294002組

圖4 各組大鼠頦舌肌組織中PI3K、p-Akt、Akt、p-mTOR、mTOR、β-actin蛋白印跡圖A.正常組;B.模型組;C.ASⅣ低劑量組;D.ASⅣ中劑量組;E.ASⅣ高劑量組;F.ASⅣ+LY294002組

3.模型建立與分組給藥:96只SD大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、模型組、ASⅣ低、中、高劑量組、ASⅣ+LY294002組,每組16只。除正常組外,其余5組參照文獻(xiàn)建立CIH大鼠模型:將大鼠置于低氧艙中,向低氧艙中循環(huán)充入氮?dú)夂脱鯕?低氧和高氧濃度分別為5%和21%,氧濃度的下降時(shí)間為50s,低氧維持20s,氧濃度的上升時(shí)間為30s,高氧維持20s,總計(jì)120s是一個循環(huán),每天循環(huán)8h,持續(xù)5周[10]。建模期間ASⅣ低、中、高劑量組分別給予ASⅣ 20、40、80mg/kg灌胃給藥(濃度分別為2、4、8mg/ml的ASⅣ溶液,灌胃體積10ml/kg),同時(shí)腹腔注射0.9%氯化鈉溶液10ml/kg,每天1次[11];ASⅣ+LY294002組給予ASⅣ 80mg/kg灌胃以及LY294002 0.3mg/kg腹腔注射[12](濃度為8mg/ml的ASⅣ溶液,灌胃體積10ml/kg,濃度為0.03mg/ml的LY294002溶液,腹腔注射體積10ml/kg),每天1次;正常組和模型組灌胃、腹腔0.9%氯化鈉溶液各10ml/kg,每天1次;共持續(xù)5周。

4.動脈血?dú)庵笜?biāo)檢測:實(shí)驗(yàn)結(jié)束24h后,乙醚麻醉大鼠,第4、5肋間穿刺取左心室動脈血約2ml,取1ml采用全自動血?dú)夥治鰞x檢測各組大鼠動脈血氧分壓(arterial partial pressure of oxygen,PaO2)、二氧化碳分壓(partial pressure of carbon dioxide,PaCO2)以及血氧飽和度(saturation of blood oxygen,SaO2)。

5.血清中IL-6、TNF-α含量檢測:取1ml左心室動脈血,離心后分離血清,采用ELISA法檢測各組大鼠血清中IL-6、TNF-α含量。

6. HE染色觀察頦舌肌組織病理學(xué)變化:取血后處死大鼠,分離頦舌肌組織,清洗后取8只大鼠組織加入4%多聚甲醛固定,采用常規(guī)方法進(jìn)行酒精脫水、石蠟切片,HE染色后觀察頦舌肌組織病理變化情況。

7.免疫組化法檢測頦舌肌組織中自噬相關(guān)蛋白的表達(dá):取制備好的石蠟切片,進(jìn)行脫蠟、梯度乙醇復(fù)水后加2% H2O2溶液與枸櫞酸緩沖液修復(fù)抗原,清洗后加入正常山羊血清封閉,加入稀釋好的Beclin1、LC3B一抗,清洗后加入二抗,采用DAB法顯色,清洗后加入蘇木精復(fù)染,常規(guī)脫水、透明后封片,觀察頦舌肌組織中Beclin1、LC3B表達(dá)情況,運(yùn)用Image J圖像分析軟件,分析Beclin1、LC3B吸光度值,作為Beclin1、LC3B表達(dá)量。

8.蛋白印跡法檢測頦舌肌組織中PI3K/Akt/mTOR信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá):取剩余8只大鼠頦舌肌組織,加入RIPA高效蛋白裂解液進(jìn)行勻漿,采用BCA法檢測總蛋白濃度,取30μg蛋白上樣進(jìn)行電泳,轉(zhuǎn)膜后清洗,加入5%脫脂牛奶室溫封閉,再次清洗后加入稀釋好的PI3K(1∶300)、p-Akt(1∶200)、Akt(1∶200)、p-mTOR(1∶400)、mTOR(1∶400)一抗,4℃孵育后清洗,加入二抗(1∶1000)室溫孵育,清洗后采用ECL發(fā)光液顯色,以β-actin為內(nèi)參,運(yùn)用凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行灰度值分析。

結(jié) 果

1. ASⅣ對CIH大鼠動脈血?dú)庵笜?biāo)的影響:與正常組比較,模型組大鼠動脈血PaCO2顯著升高(P<0.05),PaO2、SaO2顯著降低(P<0.05);與模型組比較,ASⅣ低、中、高劑量組大鼠動脈血PaCO2依次降低(P<0.05),PaO2、SaO2依次升高(P<0.05);與ASⅣ高劑量組比較,ASⅣ+LY294002組大鼠動脈血PaCO2顯著降低(P<0.05),PaO2、SaO2顯著升高(P<0.05),詳見表1。

表1 各組大鼠動脈血PaCO2、PaO2、SaO2水平比較

2.ASⅣ對CIH大鼠血清中IL-6、TNF-α含量的影響:與正常組比較,模型組大鼠血清中IL-6、TNF-α含量顯著升高(P<0.05);與模型組比較,ASⅣ低、中、高劑量組大鼠血清中IL-6、TNF-α含量依次降低(P<0.05);與ASⅣ高劑量組比較,ASⅣ+LY294002組大鼠血清中IL-6、TNF-α含量顯著降低(P<0.05),詳見表2。

表2 各組大鼠血清中IL-6、TNF-α含量比較

3.ASⅣ對CIH大鼠頦舌肌組織病理學(xué)變化的影響:HE染色結(jié)果可以看到,正常組大鼠頦舌肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰,形態(tài)規(guī)則,呈鈍角多邊形,細(xì)胞排列有序;模型組大鼠頦舌肌組織細(xì)胞腫脹變形,邊界模糊,排列凌亂,細(xì)胞角度消失;ASⅣ低、中、高劑量組隨著劑量升高,細(xì)胞變形程度逐漸減小,排列逐漸整齊,細(xì)胞腫脹減輕;ASⅣ+LY294002組頦舌肌組織病變較ASⅣ高劑量組明顯減輕,詳見圖1。

4.ASⅣ對CIH大鼠頦舌肌組織中Beclin1、LC3B蛋白表達(dá)的影響:與正常組比較,模型組大鼠頦舌肌組織中Beclin1、LC3B蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05);與模型組比較,ASⅣ低、中、高劑量組大鼠頦舌肌組織中Beclin1、LC3B蛋白表達(dá)依次升高(P<0.05);與ASⅣ高劑量組比較,ASⅣ+LY294002組頦舌肌組織中Beclin1、LC3B蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05);詳見圖2、圖3和表3。

表3 各組大鼠頦舌肌組織中Beclin1、LC3B蛋白表達(dá)比較

5.ASⅣ對CIH大鼠頦舌肌組織中PI3K/Akt/mTOR信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響:與正常組比較,模型組大鼠頦舌肌組織中PI3K蛋白表達(dá)和p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR比值顯著升高(P<0.05);與模型組比較,ASⅣ低、中、高劑量組大鼠大鼠頦舌肌組織中PI3K蛋白表達(dá)和p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR比值依次降低(P<0.05);與ASⅣ高劑量組比較,ASⅣ+LY294002組大鼠頦舌肌組織中PI3K蛋白表達(dá)和p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR比值顯著降低(P<0.05),詳見圖4、表4。

表4 各組大鼠頦舌肌組織中PI3K蛋白表達(dá)、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR比值比較

討 論

CIH是OSA最主要的發(fā)病機(jī)制,OSA的主要特點(diǎn)是上呼吸道反復(fù)部分或完全阻塞,導(dǎo)致呼吸暫停和低通氣,并導(dǎo)致動脈氧氣減少和動脈二氧化碳水平升高,OSA的發(fā)生與發(fā)展誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生炎性反應(yīng)以及

活性氧過量釋放,引起全身性炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激,最終導(dǎo)致全身重要臟器的損傷,引起各種心血管疾病發(fā)生,威脅人們生命健康[13～15]。研究表明,自噬反應(yīng)與由于缺血缺氧造成的神經(jīng)元損傷有密切聯(lián)系[16]。自噬能夠通過一系列機(jī)制調(diào)控活性氧的產(chǎn)生,保護(hù)細(xì)胞。研究表明,在CIH發(fā)生的過程中,機(jī)體也能夠通過調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬反應(yīng)的發(fā)生保護(hù)血管內(nèi)皮不受損害[17]。LC3B和Beclin1蛋白是目前研究中檢測自噬反應(yīng)的常用指標(biāo)[18]。

本研究通過建立CIH大鼠模型,得出CIH大鼠頦舌肌組織病變嚴(yán)重,動脈血PaCO2升高,PaO2、SaO2降低,血清中IL-6、TNF-α含量升高,自噬相關(guān)蛋白Beclin1和LC3B的表達(dá)降低,提示CIH發(fā)生后,自噬反應(yīng)受到抑制,炎性反應(yīng)過度,導(dǎo)致頦舌肌受損。ASⅣ是中藥黃芪的有效生物成分,參與機(jī)體內(nèi)炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激以及免疫調(diào)節(jié)等生理病理過程[19]。研究表明,ASⅣ能夠改善由于缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞能量代謝反應(yīng),通過抑制自噬反應(yīng)預(yù)防心肌細(xì)胞損傷[20]。

本研究結(jié)果顯示,CIH大鼠經(jīng)ASⅣ治療后,頦舌肌組織病變減輕,動脈血PaCO2降低,PaO2、SaO2升高,血清中IL-6、TNF-α含量降低,Beclin1和LC3B蛋白表達(dá)升高,且ASⅣ劑量越高效果越好。表明ASⅣ能夠有效恢復(fù)CIH大鼠自噬反應(yīng),改善動脈血?dú)庵笜?biāo),減輕炎性反應(yīng)的發(fā)生,改善頦舌肌損傷。

PI3K/Akt/mTOR信號通路已被證實(shí)是自噬反應(yīng)最重要的調(diào)控通路之一[21]。PI3K受到外源病原刺激,誘導(dǎo)Akt磷酸化,進(jìn)而激活其下游mTOR磷酸化,mTOR是調(diào)節(jié)自噬的重要信號因子,磷酸化后的mTOR抑制自噬相關(guān)基因的表達(dá),抑制自噬反應(yīng)發(fā)生[22]。雷鑫等[23]研究發(fā)現(xiàn),抑制PI3K/Akt/mTOR通路表達(dá),可增強(qiáng)阿爾茨海默病大鼠海馬組織自噬能力,從而改善大鼠學(xué)習(xí)能力。本研究結(jié)果顯示,CIH發(fā)生后大鼠頦舌肌組織中PI3K及Akt、mTOR磷酸化蛋白表達(dá)升高,有效抑制自噬反應(yīng)發(fā)生,造成頦舌肌受損,而ASⅣ能夠抑制大鼠頦舌肌組織中PI3K及Akt、mTOR磷酸化蛋白表達(dá),促進(jìn)自噬反應(yīng)的發(fā)生,與雷鑫等[22]研究結(jié)果一致,同時(shí)在ASⅣ高劑量的干預(yù)下加入PI3K抑制劑LY294002,自噬反應(yīng)進(jìn)一步增強(qiáng),各指標(biāo)的改善效果均優(yōu)于ASⅣ高劑量組,因此,ASⅣ可能通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路,激活自噬反應(yīng),改善頦舌肌損傷。

綜上所述,ASⅣ能夠通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路的表達(dá),激活自噬反應(yīng),改善頦舌肌損傷。但由于自噬具有兩面性,既能夠清除體內(nèi)過量的活性氧、減少炎性細(xì)胞因子分泌,但自噬反應(yīng)過度發(fā)生也會導(dǎo)致細(xì)胞死亡。因此,對于ASⅣ調(diào)控CIH大鼠體內(nèi)自噬的具體機(jī)制還需要聯(lián)合多種自噬相關(guān)通路進(jìn)行深入探討,后續(xù)將通過體外細(xì)胞學(xué)干預(yù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證本研究結(jié)果。