microRNAs與神經(jīng)母細(xì)胞瘤

尹萌萌 劉愛國

神經(jīng)母細(xì)胞瘤(neuroblastoma,NB)是一種惡性胚胎性腫瘤,起源于周圍交感神經(jīng)節(jié),30%發(fā)生在腎上腺髓質(zhì)內(nèi),70%發(fā)生在脊髓、頸部、胸部、腹部或骨盆神經(jīng)組織內(nèi),常見于嬰兒和5歲以下兒童[1]。NB以血液轉(zhuǎn)移為特點(diǎn),預(yù)后欠佳,總體生存率僅有40%,高危型患兒5年生存率<10%,10年生存率<2%,占兒童癌癥總病死率的10%～15%[2]。NB具有高度異質(zhì)性,遺傳物質(zhì)在克隆中不斷獲得突變,從而導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展及耐藥等。

microRNAs(miRNAs)是一組長度為19～22個核苷酸的小非編碼RNA,可在轉(zhuǎn)錄水平上同時調(diào)控多個基因表達(dá)。研究已發(fā)現(xiàn)2000余種miRNAs的生物功能,可調(diào)控60%的人類蛋白質(zhì)編碼基因,影響細(xì)胞的分化、凋亡。miRNAs功能失調(diào)(上調(diào)/抑制)會導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移或耐藥等[3]。因此,miRNAs在腫瘤診斷、預(yù)后和治療方面具有巨大的影響力。

早期神經(jīng)嵴發(fā)育組織中富含多類miRNAs,在神經(jīng)嵴細(xì)胞(neural crest cells,NCCs)內(nèi)發(fā)揮其作用。在發(fā)育過程中,miRNAs微調(diào)蛋白水平,有助于調(diào)節(jié)NCCs的誘導(dǎo)、分化和遷移,以及交感腎上腺系上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化(epithelial to mesenchymal transition,EMT)。EMT失調(diào)在NCCs異常分化為NB的過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。NB的臨床特點(diǎn)與遺傳物質(zhì)改變密切相關(guān)。例如,研究發(fā)現(xiàn)一組腫瘤生長/抑制因子(LET-7、miRNA-101、miRNA-202、miRNA-9、miRNA-34a、miRNA-340、miRNA-184和miRNA-335)在NB的發(fā)生過程中會發(fā)生一系列表觀遺傳學(xué)改變(異常DNA甲基化或組蛋白修飾)[4]。根據(jù)miRNAs對NB的作用分為致癌性miRNAs(oncomiRNAs),轉(zhuǎn)移相關(guān)性miRNAs(metastamiRNAs)和抑癌性miRNAs(TSmiRNAs),詳見表1[5]。

一、miRNAs對NB發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移的促進(jìn)作用

oncomiRNAs和metastamiRNAs在NB發(fā)生、進(jìn)展及轉(zhuǎn)移方面起到重要的驅(qū)動作用。例如,oncomiRNA-558可以通過促進(jìn)乙酰肝素酶、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)基因的反式激活和蛋白翻譯,刺激AGO2和eIF4E蛋白依賴的HIF-2α表達(dá),促進(jìn)NB生長、侵襲和轉(zhuǎn)移。同樣,miRNA-451也通過抑制巨噬細(xì)胞分泌抑制因子,促進(jìn)NB的生長和浸潤[6]。miRNA-1303通過靶向作用糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)和SFRP1蛋白,影響cyclinD1的磷酸化過程,抑制WNT/β-catenin信號通路,增強(qiáng)NB細(xì)胞的增殖能力。此外,oncomiR-380-3p可通過抑制p53促進(jìn)腫瘤生長。miRNA-92a-3p則通過靶向抑制PTEN mRNA表達(dá)降低PTEN蛋白,促進(jìn)NB細(xì)胞增殖、侵襲和遷移。而miR-195是通過作用RET原癌基因調(diào)節(jié)NB細(xì)胞的侵襲[1]。

長鏈非編碼RNA腫瘤易感基因11(lncRNA CASC11)過度表達(dá)在各種腫瘤中,其高水平表達(dá)與NB患兒的生存率呈負(fù)相關(guān),對NB細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用與miRNA-676-3p和NOL4L(nucleolar protein 4 like)有關(guān)。三者通過相互促進(jìn)及拮抗的作用,最終促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲性[7]。miRNA- 29a/b和miRNA-10b在轉(zhuǎn)移性NB組織中的水平明顯高于非轉(zhuǎn)移性組織,證明其對腫瘤遷移的促進(jìn)作用。

二、miRNAs對NB的抑制作用

miRNA-34a作為首個被發(fā)現(xiàn)對NB具有抑制功能的miRNA,位于染色體1p36區(qū)域,受抑癌基因TP53調(diào)控,特異性作用于HNF4α,并誘導(dǎo)半胱氨酸蛋白酶參與NB細(xì)胞的凋亡過程[8]。有研究報(bào)道,miRNA-337-3p和miRNA-338-3p可分別通過抑制MMP-14(matrix metalloproteinase-14)和MMP-2轉(zhuǎn)錄,誘導(dǎo)NB細(xì)胞凋亡[9]。在NB小鼠模型中,miRNA-542-5p和miRNA-497的過度表達(dá)可抑制腫瘤生長,而miRNA-709通過與H3K27me3和AGO1(argonaute-1)結(jié)合形成復(fù)合物,抑制NB相關(guān)蛋白轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后的表觀遺傳學(xué)改變。HOXA7活躍在多種腫瘤細(xì)胞內(nèi),包括NB。而將HOXA7作為作用靶點(diǎn)的miRNA-144-3p,可直接抑制NB細(xì)胞[10]。在TSKU蛋白的調(diào)節(jié)下,miRNA-2110可誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞生長,對NB細(xì)胞具有誘導(dǎo)分化及抑制的作用[11]。

miRNA-449a對多種腫瘤都具有抑制功能,包括NB,其通過靶向作用PKP4、MDM4、TSEN15和MFAP4,誘導(dǎo)NB細(xì)胞分化,同時下調(diào)CDK6癌基因表達(dá)和淋巴增強(qiáng)因子1水平,阻滯細(xì)胞周期,加速腫瘤細(xì)胞凋亡[12, 13]。與miRNA-449a相似,miRNA-323-5p和miRNA-342-5p可通過直接作用CCND1、CHAF1A、INCENP和Bcl-Xl基因,抑制NB細(xì)胞生長。其他miRNAs,如miRNA-145、miRNA -27b、miRNA-1247、miRNA-146a、miRNA-542-3p和5p也是通過影響原癌基因、細(xì)胞因子或蛋白,抑制腫瘤生成[14,15]。

轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子LMO1已被證明有促癌作用,并經(jīng)過全基因組關(guān)聯(lián)檢測確定為NB易感基因。至少有18種具有抑癌作用的miRNAs受LMO1抑制,包括Let7家族(7a-5p、7b-5p、7c、7e-5p、7f-5p、7g-5p和7i-5p)[16]。某些特殊的miRNAs,如miRNA-138,在正常情況下對腫瘤無影響,但與黃酮類化合物如芹菜素結(jié)合后,會對NB細(xì)胞發(fā)揮明顯的抑制功能[17]。

三、MYCN與miRNAs的相互作用

NB的發(fā)生和發(fā)展與交感神經(jīng)元和腎上腺髓質(zhì)發(fā)育機(jī)制的破壞密切相關(guān),MYCN和Trk家族基因的改變已被證明與NB的發(fā)生進(jìn)展密切相關(guān),間變性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase,ALK)則與家族性NB相關(guān)。其中,MYCN擴(kuò)增是NB最常見及最重要的遺傳物質(zhì)改變,是NB最關(guān)鍵的基因,其高水平表達(dá)與細(xì)胞的異常增殖及侵襲性有關(guān)。MYCN作為一種轉(zhuǎn)錄因子及表觀遺傳調(diào)控因子,對發(fā)育中組織的基因表達(dá)調(diào)控及正常的神經(jīng)發(fā)育至關(guān)重要,可維持細(xì)胞的多能性,促進(jìn)細(xì)胞增殖或細(xì)胞周期進(jìn)程[18]。

MYCN與miRNAs在生物學(xué)功能上相互影響,miRNAs可調(diào)控N-Myc表達(dá),而MYCN也可上調(diào)或下調(diào)miRNAs的表達(dá),前者包括miRNA-1206、miRNA-548a-5p、miRNA-548f、miRNA-639、miRNA-640、miRNA-641、miRNA-647、miRNA-662、miRNA-886-3p、miRNA-887、miRNA-576-5p和miRNA-600,后者包括miRNA-513a-5p、miRNA-198、miRNA-1280、miRNA-1308、miRNA-1908、miRNA-513b、miRNA-548f、miRNA-1261、miRNA-1268、miRNA-363和miRNA-183。此類miRNAs可預(yù)測NB患兒的預(yù)后。比如, miRNA-363和miRNA-183被MYCN抑制后,ROCK、LRGR1和MAPK1會增強(qiáng)癌細(xì)胞的遷移,若兩者過度表達(dá),則預(yù)示預(yù)后良好[19]。

與無MYCN擴(kuò)增的NB比較,擴(kuò)增組織中有多種miRNAs的水平存在明顯差異。比如,可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的miRNA-323a-5p和miRNA-342-5p在有MYCN擴(kuò)增的NB中,表達(dá)水平明顯下降[15]。同樣,通過抑制MYCN、AURKA、TGFBR1和TGFBR2,阻止腫瘤遷移的miRNA-186,以及可降低原癌基因水平的miRNA-15a-5p、miRNA-15b-5p、miRNA-16-5p,在MYCN高度表達(dá)的NB細(xì)胞中,表達(dá)明顯降低[20]。

MYCN與miRNAs的相互作用也表現(xiàn)在信號通路上,比如PI3K/Akt/mTOR信號通路可刺激NB細(xì)胞增殖、耐藥等,而miRNA-184通過結(jié)合Akt mRNA的3′UTR,抑制Akt對MYCN的刺激作用,降低N-Myc水平和腫瘤生長速度。此外,miRNA-335通過抑制TGF-β信號通路活化蛋白激酶1和Rho相關(guān)螺旋蛋白,抑制NB細(xì)胞的侵襲和遷移潛能,但MYCN可通過直接下調(diào)miRNA-335來抵消這種作用。被N-Myc調(diào)控的miRNAs,大都與不良預(yù)后有關(guān),包括miRNA-25、miRNA-17、miRNA-18、miRNA-19、miRNA-20a、miRNA-143和miRNA-27等。其中,miRNA-181a/b可直接增強(qiáng)ABL1表達(dá),而ABL1的表達(dá)水平與MYCN拷貝數(shù)呈正相關(guān)[21]。

四、miRNAs對NB耐藥的作用

耐藥會導(dǎo)致90%以上的化療失敗。研究表明,N-MYC可直接或間接參與某些miRNAs的分化調(diào)節(jié)過程,包括miRNA-17-5p、miRNA-18a、miRNA-19a、miRNA-20a和miRNA-92,介導(dǎo)NB耐藥發(fā)生[1]。此外,miRNA-21結(jié)合PTEN后也會導(dǎo)致NB對順鉑耐藥[22]。miRNA-15a/16-1的獲得性丟失可誘導(dǎo)BMI1癌蛋白表達(dá)和谷胱甘肽依賴反應(yīng)激活,導(dǎo)致NB對依托泊苷耐受。在一項(xiàng)關(guān)于NB對順鉑、依托泊苷交叉耐藥的研究中發(fā)現(xiàn),染色體重排及miRNA-520f的丟失會增加細(xì)胞神經(jīng)凋亡抑制蛋白生成,導(dǎo)致腫瘤耐藥。在對阿霉素耐藥的NB細(xì)胞中,miRNA-137被選擇性下調(diào),而miRNA-137表達(dá)增強(qiáng)會抑制雄甾烷受體蛋白,促進(jìn)NB對阿霉素的敏感度。miRNA-497可針對性作用耐藥調(diào)節(jié)劑WEE1激酶,其丟失不僅明顯降低NB患兒的生存率,還會減弱NB對順鉑的敏感度。NB細(xì)胞與鄰近單核細(xì)胞之間的miRNAs旁分泌交換,如miRNA-16、miRNA-125b、miRNA-21、miRNA-23a、miRNA-24、miRNA-25、miRNA-27b、miRNA-218、miRNA-320a和miRNA-92a,可作用于NFKB、STAT3、p53、TLR8等基因,誘導(dǎo)NB細(xì)胞突變,抵抗化療藥物毒性[23]。

除耐藥外,miRNAs也可增強(qiáng)腫瘤對化療的敏感度。比如,加強(qiáng)miRNA-149對CDC42和Bcl-2表達(dá)的調(diào)節(jié),及miR-204靶向作用的Bcl-2和NTRK2獲得性丟失,可分別增加NB細(xì)胞對阿霉素和順鉑的敏感度[24]。MiRNA-34a不僅可以靶向作用MYCN,還可針對性作用耐藥過程中的關(guān)鍵參與者,包括E2F3、Bcl-2、CCND1和CDK6,有助于減弱NB的耐藥性。而miRNA-129,不僅可以通過下調(diào)MYO10抑制腫瘤,還能增強(qiáng)環(huán)磷酰胺對NB細(xì)胞的殺傷能力[25]。

五、miRNAs與NB治療

腫瘤切除并輔以化療是Ⅰ/Ⅱ期NB患兒的主要治療方法,Ⅲ/Ⅳ期患兒的治療則需要在手術(shù)和高強(qiáng)度化療后,再輔以放療和干細(xì)胞移植。治療效果欠佳的患兒后期甚至需要維甲酸類藥物或免疫抑制劑治療。雖然NB的治療方法有多種,但高危型患兒的整體生存率仍低。而且,傳統(tǒng)的化療藥物也存在一些不足,比如溶解度差、生物利用度低、半衰期短和特異性差等。化療藥物無法足量到達(dá)腫瘤組織,不僅會減弱治療效果,還會促使腫瘤耐藥[26]。

目前認(rèn)為化療聯(lián)合miRNAs的靶向治療,是對NB患兒更有效的一種治療策略,其作用機(jī)制是利用反義寡核苷酸阻斷oncomiRNAs的表達(dá),并增強(qiáng)TSmiRNAs表達(dá)?？贵w-抗原(配體-受體)原理允許納米顆粒與配體偶聯(lián),攜帶miRNAs與腫瘤細(xì)胞表面抗原靶向結(jié)合,提高治療的特異性。雙唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂GD2抗原在NB細(xì)胞表面表達(dá)較多,為miRNAs治療提供了治療靶點(diǎn)。使用GD2包覆的納米粒子將miRNA-34a、miRNA-429或miRNA-542-3p導(dǎo)入人體與NB細(xì)胞結(jié)合,可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[27]。其他TSmiRNAs,如miRNA-9、miRNA-27b、miRNA-34a、miRNA-145、miRNA-184等也可嘗試與納米顆粒結(jié)合,實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)治療[17]。

維甲酸(retinoic acid,RA)目前作為NB的治療藥物,在調(diào)節(jié)N-MYC的同時也會影響miRNAs的表達(dá)。受RA誘導(dǎo)而生長停滯的NB細(xì)胞中,已發(fā)現(xiàn)有14種miRNAs(miRNA-9、miRNA-124a、miRNA-125a、miRNA-125b、let-7a、let-7b、miRNA-7、miRNA-22a、miRNA-24、miRNA-26a、miRNA-30a-5p、miRNA-100和miRNA-103)的表達(dá)水平會明顯下降,而抑制腫瘤生長的miRNA-128和miRNA-340,表達(dá)水平會明顯上升[28]。

Semliki森林病毒(semliki forest virus,SFV)屬于RNA 病毒,具有較強(qiáng)的擴(kuò)增和腫瘤殺傷能力,是針對NB的一種強(qiáng)免疫治療劑。有研究發(fā)現(xiàn)在SFV-4病毒中插入miRNA-124、miRNA-125和miRNA-134,可提高腫瘤的溶解能力,并降低藥物的神經(jīng)毒性。同樣,腸道病毒EV71可通過刺激miRNA-LET-7b,對耐藥型NB具有較好的治療效果。而5-羥色胺抑制劑氟西汀,治療NB的機(jī)制是可持續(xù)上調(diào)NB細(xì)胞中miRNA-572和miRNA-663A的表達(dá),并抑制腫瘤相關(guān)癌基因及生長因子(CDKN1、TGF-β1、Dicer1、Wnt7a、PTEN、VEGFA)的功能[29]。

新化療藥物的開發(fā)也為NB的治療帶來福音。比如,研究發(fā)現(xiàn)蒽酰胺-吡唑啉1,5-α嘧啶可上調(diào)miRNA-34-a、miRNA-34-c、miRNA-200b、miRNA-107、miRNA-542-5p和miRNA-605的表達(dá),激活p21和Bax基因,促使NB細(xì)胞凋亡。而白藜蘆醇等天然植物黃素可通過誘導(dǎo)miRNA-137,抑制蛋白質(zhì)組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶,消滅NB細(xì)胞[1]。

miRNAs作為基因調(diào)控因子,不僅存在細(xì)胞內(nèi),在血清、血漿、唾液和尿液等體液中也可檢測到,而且體液中miRNAs的成分及水平變化與包括癌癥在內(nèi)的多種疾病密切相關(guān),臨床上可考慮將miRNAs 作為一種無創(chuàng)生物學(xué)標(biāo)志物,用于評估和監(jiān)測NB患兒的病情進(jìn)展[3]。

六、展 望

盡管在過去的20多年里,多學(xué)科綜合治療在臨床中做出了巨大努力,但高危型NB患兒的治療效果欠佳,5年生存率不到10%,主要原因是NB細(xì)胞遺傳物質(zhì)的持續(xù)改變,決定了腫瘤的進(jìn)展和耐藥性。因此,臨床急需發(fā)現(xiàn)新的治療策略。在過去的10年中,分子生物學(xué)研究得到了適當(dāng)?shù)年P(guān)注,提出了許多治療靶點(diǎn),包括miRNAs。miRNAs是一類新型基因調(diào)節(jié)因子,研究證明其在NB的發(fā)生和進(jìn)展中起到至關(guān)重要的作用,這些發(fā)現(xiàn)不僅為NB的分子發(fā)生機(jī)制提供新的見解,也提高了miRNAs在NB診斷、預(yù)后和治療中的應(yīng)用可能性。比如,臨床已嘗試針對TSmiRNAs和oncomiRNAs的靶向治療,雖然將這些研究數(shù)據(jù)應(yīng)用到臨床中尚處于起步階段,但這些發(fā)現(xiàn)將為NB的治療提供強(qiáng)有力的基礎(chǔ),并確定miRNAs在NB治療中的作用?？傊?大量的研究證據(jù)支持miRNAs在對抗NB進(jìn)展及化療耐藥性中的巨大臨床潛力,值得在該領(lǐng)域中開展進(jìn)一步研究。