頤腦解郁方對抑郁大鼠行為學和NLRP3相關炎性蛋白的影響*

張雙,李江林,趙瑞珍,張東樞,李驍群,唐啟盛

1.北京中醫(yī)藥大學,北京 100029; 2.北京中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院,北京 100029

抑郁癥發(fā)病機制復雜,近年來抑郁癥炎癥假說得到越來越多證據(jù)的支持,有望成為抑郁癥研究的突破點。研究表明,抑郁癥患者血液中白細胞介素-1β(interleukin 1β,IL-1β)、干擾素-γ(interferon γ,IFN-γ)等促炎因子水平明顯升高[1],而抗炎治療可以改善抑郁癥狀[2]。進一步研究發(fā)現(xiàn),NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3,NLRP3)是IL-1β成熟和釋放的誘導劑,同時是介導細胞焦亡的重要分子,NLRP3通過多種機制參與抑郁癥的發(fā)生[3]。研究發(fā)現(xiàn),NLRP3基因敲除的小鼠經4周慢性溫和應激(chronic mild stress,CMS)無抑郁樣表現(xiàn),IL-1β和細胞焦亡執(zhí)行蛋白gasdermin D(GSDMD)水平未見升高[4],據(jù)此推測NLRP3介導的免疫通路在抑郁癥的發(fā)病中發(fā)揮著重要作用。

頤腦解郁方是唐啟盛教授多年臨床經驗的總結,臨床研究表明,頤腦解郁方起效快、安全性好[5-6],但頤腦解郁方是否通過抑制NLRP3的激活而產生抗抑郁作用仍然未知。因此,本研究通過檢測大鼠血清中IL-1β、IFN-γ的表達情況以及腦組織中NLRP3mRNA、NLRP3蛋白、GSDMD蛋白水平探索頤腦解郁方益腎調氣的分子機制。

1 材料

1.1 實驗動物SPF級健康雄性Wistar大鼠32只,6周齡,體質量為190 ～ 210 g,由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供,動物許可證號:SYXK(京)2020-0036。將大鼠適應性喂養(yǎng)1周,自由攝食和飲水,保持室溫(23±1) ℃,相對濕度60%～70%,光照周期晝夜各12 h(7：00～19：00光照;19：00至次日7：00黑暗),室內安靜。本研究由北京中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會審核通過,涉及實驗動物的研究內容和過程均符合國家對醫(yī)學實驗動物的有關要求,倫理編號:BUCM-4-2021091308-3166。

1.2 藥物與試劑刺五加、梔子、五味子、郁金(配方顆粒劑,北京康仁堂藥業(yè)有限公司,批號:20033601、20036651、20034601、20016081);鹽酸氟西汀膠囊(規(guī)格:每粒20 mg,禮來蘇州制藥有限公司,國藥準字:J20170022)。全蛋白抽提試劑盒、BCA蛋白含量檢測試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、預染蛋白分子量、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液、Tris-甘氨酸蛋白電泳緩沖液、Western Blot檢測試劑盒、顯影定影試劑(江蘇凱基生物有限公司,批號:KGP250、KGA902、KGP113、KGP441、KGP101、KGP103X、KGP1201、KGP116);大鼠IL-1β ELISA試劑盒(美國Proteintech公司,批號:KE20005);大鼠IFN-γ ELISA試劑盒(美國Raybiotech公司,批號:ELR-IFNg-1)。

1.3 儀器高速冷凍離心機(美國Thermo Fisher Scientific公司,型號:Sorvall ST16R);熒光定量PCR循環(huán)儀(美國ABI公司,型號:Step one plus Real time-PCR system);微型電泳儀(美國Bio-Rad公司,型號:Power Supplies Basic);紫外分光光度計(日本SHIMADZU公司,型號:UV-2450);Trans-Blot Turbo全能型蛋白轉印系統(tǒng)(美國Bio-rad公司,型號:170-4150);凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-rad公司,型號:ChemiDoc MP Imaging System);臺式恒溫振蕩器(上海精宏實驗設備有限公司,型號:THZ-312);脫色搖床(江蘇金壇市正基儀器廠,型號:HY-4);多功能酶標儀(美國MD公司,型號:Spectramac M3);超凈工作臺(中國蘇州凈化公司,型號:SW-CJ-1FD);敞箱(自制,型號:80 cm×80 cm×40 cm)。

2 方法

2.1 動物分組與模型制備32只大鼠適應性喂養(yǎng)1周,按照隨機數(shù)字表法將大鼠分為正常組、模型組、頤腦解郁方組及鹽酸氟西汀組,每組8只。正常組不予干預,常規(guī)飼養(yǎng),其余3組大鼠采用慢性不可預知溫和應激(chronic unpredictable mild stress,CUMS)法連續(xù)刺激21 d同時聯(lián)合孤養(yǎng)建立抑郁模型[7],即CUMS刺激時隨機選取7種應激方法,包括:禁食24 h、禁水24 h、潮濕墊料24 h、夾尾1 min、4 ℃冰水游泳5 min,束縛2 h、晝夜顛倒,每種方法各應用3次。具體安排如下:

2.2 給藥方法造模結束次日于行為學測試后,正常組、模型組、頤腦解郁方組和鹽酸氟西汀組大鼠開始進行干預。參考課題組前期方法和劑量對頤腦解郁方和鹽酸氟西汀組大鼠進行灌胃[8],頤腦解郁方組大鼠每天給予6.2 g·kg-1頤腦解郁方溶液灌胃,鹽酸氟西汀組大鼠每天給予2.3 g·kg-1鹽酸氟西汀溶液灌胃,灌胃體積均為10 mL·kg-1,連續(xù)灌胃28 d,正常組與模型組灌胃給予等體積蒸餾水。

2.3 行為學測試

2.3.1 曠場實驗(open field test,OFT)曠場實驗采用自制黑色無蓋方箱,其底面用白線劃分為25個16 cm×16 cm方格。將大鼠置于箱子中央方格中,記錄大鼠3 min內的活動情況。觀察指標包括活動總路程、靜止時間、運動時間、水平運動得分及垂直運動得分,其中以大鼠穿越方格數(shù)(至少3爪進入方格)為水平運動得分,每格得1分;以大鼠前兩肢直立次數(shù)為垂直運動得分,每直立1次得1分。每只測定結束后清理尿便并使用酒精消毒擦拭箱子內部,避免氣味殘留。記錄造模前、造模后和干預28 d后各組大鼠的曠場得分情況。

2.3.2 糖水偏好實驗(sucrose preference test,SPT)實驗前3 d進行適應性訓練,即第1天放2瓶均裝有1%的蔗糖水;第2天1瓶裝有1%的蔗糖水和1瓶純凈水,訓練結束后禁食禁水12 h,再進行糖水偏好實驗。將1瓶100 mL的1%蔗糖水與1瓶100 mL純凈水置于鼠籠前,12 h后分別稱量瓶和水的質量,記錄糖水和純凈水消耗量,得出大鼠糖水偏好率。造模前、造模后和干預28 d后各進行1次,分別計算大鼠糖水偏好率。

糖水偏好率=糖水消耗量/(糖水消耗量+純凈水消耗量)×100%

根據(jù)曠場實驗結果和糖水偏好率篩選符合抑郁癥模型者進入下一步實驗測試,每組保證6只。

2.4 ELISA法檢測各組大鼠血清炎癥因子水平大鼠麻醉后,經腹主動脈取血,室溫下靜置30 min,3 000 r·min-1離心10 min(離心半徑8 cm),取上清待測。參照ELISA試劑盒操作說明書,依步驟處理后通過酶標儀檢測血清中IL-1β、IFN-γ的水平。

2.5 RT-PCR檢測各組大鼠海馬及前額葉皮質中NLRP3mRNA的水平按照Trizol試劑盒說明書提取腦組織總RNA,紫外分光光度計測定RNA濃度和純度;取2 μg RNA行反轉錄合成cDNA;參考試劑盒行RT-PCR,PCR反應體系為20 μL,反應條件為:95 ℃ 變性15 s、60 ℃退火 20 s、72 ℃ 延伸40 s,共 40個循環(huán)。以GAPDH作為內參,用2-ΔΔCt法計算NLRP3基因的相對表達量。引物序列見表1。

表1 大鼠21 d CUMS法安排表

2.6 Western Blot檢測各組大鼠海馬及前額葉皮質中NLRP3、GSDMD蛋白表達水平取出凍存的海馬及前額葉皮質組織,分別加入組織裂解液,4 ℃、12 000 r·min-1離心5 min后取上清液,BCA法檢測總蛋白濃度,沸水浴10 min使蛋白變性后分別取20 μg蛋白行SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白,NC膜置于5%脫脂奶粉溶液中室溫封閉2 h,滴加NLRP3(稀釋比例為1：1 000)、GSDMD(稀釋比例為1：2 000)、GAPDH(稀釋比例為 1：5 000)抗體后4 ℃孵育過夜,洗膜后滴加二抗(稀釋比例為1：5 000)室溫孵育2 h,洗膜后滴加ECL顯色,以目標蛋白(NLRP3、GSDMD)條帶灰度值與內參(GAPDH)條帶灰度值的比值計算目標蛋白相對表達量。

3 結果

3.1 各組大鼠糖水偏好率變化比較造模前,各組大鼠糖水偏好率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。造模后,與正常組比較,其余組大鼠糖水偏好率顯著降低(P<0.05)。干預后,與正常組比較,模型組大鼠糖水偏好率顯著降低(P<0.01);與模型組比較,頤腦解郁方組和鹽酸氟西汀組大鼠糖水偏好率均顯著增加(P<0.01)。見表3。

表3 頤腦解郁方對大鼠糖水偏好率的影響

3.2 各組大鼠曠場實驗結果比較造模前,各組大鼠曠場實驗結果差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。造模結束后,與正常組比較,其余組大鼠活動總路程顯著降低(P<0.05),運動時間顯著減少(P<0.05),靜止時間顯著延長(P<0.05),水平運動得分和垂直運動得分顯著降低(P<0.05)。干預后,與正常組比較,模型組大鼠活動總路程顯著降低(P<0.05),水平運動得分和垂直運動得分顯著降低(P<0.05);與模型組比較,頤腦解郁方組大鼠活動總路程顯著延長(P<0.01),運動時間顯著延長(P<0.05),靜止時間顯著減少(P<0.05),水平運動得分和垂直運動得分顯著升高(P<0.05);鹽酸氟西汀組大鼠活動總路程顯著延長(P<0.01),水平運動得分和垂直運動得分顯著升高(P<0.05)。見表4。

表4 頤腦解郁方對大鼠曠場實驗運動得分的影響

3.3 各組大鼠血清中IL-1β、IFN-γ水平比較與正常組比較,模型組大鼠血清中IL-1β、IFN-γ含量顯著升高(P<0.05);與模型組比較,頤腦解郁方組與鹽酸氟西汀組大鼠血清中IL-1β、IFN-γ水平顯著下降(P<0.05)。見表5。

表5 頤腦解郁方對大鼠血清炎癥因子的影響

3.4 各組大鼠海馬組織NLRP3mRNA以及NLRP3、GSDMD蛋白表達水平的比較與正常組比較,模型組大鼠海馬組織中NLRP3mRNA、NLRP3蛋白以及GSDMD蛋白表達量顯著升高(P<0.01);與模型組比較,頤腦解郁方組與鹽酸氟西汀組大鼠海馬組織中NLRP3mRNA、NLRP3蛋白以及GSDMD蛋白表達水平顯著下降(P<0.01)。見表6、圖1。

圖1 海馬中NLRP3、GSDMD蛋白表達條帶

表6 頤腦解郁方對大鼠海馬組織中NLRP3 mRNA以及NLRP3、GSDMD蛋白表達水平的影響

3.5 各組大鼠前額葉皮質組織中NLRP3mRNA以及NLRP3、GSDMD蛋白的比較與正常組比較,模型組大鼠前額葉皮質組織中NLRP3mRNA、NLRP3蛋白和GSDMD蛋白表達量顯著升高(P<0.05);與模型組比較,頤腦解郁方組與鹽酸氟西汀組大鼠前額葉皮質組織中NLRP3mRNA和NLRP3、GSDMD蛋白表達水平顯著下降(P<0.05)。見表7、圖2。

圖2 前額葉皮質中NLRP3、GSDMD蛋白表達條帶

表7 頤腦解郁方對大鼠前額葉皮質NLRP3 mRNA和NLRP3、GSDMD蛋白表達水平的影響

4 討論

抑郁癥在中醫(yī)古籍中無相應記載,根據(jù)其臨床表現(xiàn)特征,將其歸屬于中醫(yī)郁病、不寐、癲證、百合病、梅核氣等范疇[9]。課題組前期大樣本臨床研究發(fā)現(xiàn),腎虛肝郁證是抑郁癥中最常見的證候類型[10],在此基礎上唐啟盛教授提出益腎調氣法治療抑郁癥并總結出經驗方——頤腦解郁方,該方由刺五加20 g,梔子10 g,五味子10 g,郁金10 g組成。唐啟盛教授認為本病起于所愿不遂,致肝郁氣滯,肝失疏泄則胸脅脹滿、喜嘆息;病久及腎,耗損腎精腎氣,因腎主骨生髓,腎精腎氣耗損,則髓減腦消,腦之元神失養(yǎng),則出現(xiàn)情緒低落、思維遲緩、失眠、健忘等[11-12]。頤腦解郁方中重用刺五加以補腎安神;郁金疏肝解郁、行氣活血;五味子性溫味酸甘,可收斂固澀、補腎寧心;少佐梔子疏肝清郁熱以除煩[13]。現(xiàn)代藥理學研究發(fā)現(xiàn),頤腦解郁方的組成藥物中含有多種有效活性成分,可通過抗炎、神經保護機制產生抗抑郁作用[14-17]。

本研究采用CUMS抑郁模型模擬人類因長期、慢性壓力導致的抑郁狀態(tài),其病理生理機制與人類抑郁癥的發(fā)病機制相似[18]。OFT和SPT是抑郁模型常用的行為學檢測方法,OFT用于評價抑郁動物的自主活動和探索行為,抑郁動物的自主活動和探索行為減少;SPT用于評價動物的獎賞行為,糖水偏好降低是動物快感缺失的表現(xiàn)——抑郁癥的核心癥狀之一[19]。實驗結果顯示,21 d CUMS應激結束后,和正常組相比,曠場實驗顯示其他三組大鼠活動總路程、運動時間減少,靜止時間增加,水平運動得分、垂直運動得分降低,糖水偏好率偏低,提示模型制備成功。藥物干預28 d后,與模型組相比,頤腦解郁方組和鹽酸氟西汀組大鼠活動總路程增加,水平運動及垂直運動得分均上升,糖水偏好率上升,說明頤腦解郁方同鹽酸氟西汀一樣,可改善抑郁大鼠行為,提示頤腦解郁方具有抗抑郁作用。

細胞因子是一類多肽類物質,具有廣泛的生物學功能,尤其是IL-1β和IFN-γ等重要的促炎細胞因子,可通過調節(jié)HPA軸、干擾5-羥色胺(5-hydroxytryptamin,5-HT)的代謝通路、破壞血腦屏障的完整性等多種機制[20],影響神經元的結構和功能,參與抑郁的發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn),模型組大鼠血清中IL-1β和IFN-γ水平高于正常組,提示抑郁癥的發(fā)生與促炎細胞因子關系密切。鹽酸氟西汀為治療抑郁癥的一線藥物,可抑制5-HT再攝取,有研究認為其還可減少IL-1β、IFN-γ等促炎細胞因子的分泌和釋放[21]。本實驗結果顯示,頤腦解郁方組和鹽酸氟西汀組大鼠血清中IL-1β和IFN-γ水平均下降,說明頤腦解郁方對CUMS大鼠血清中促炎細胞因子的分泌、釋放起到抑制作用。

NLRP3炎性小體是調節(jié)促炎細胞因子的重要分子,它的激活也是導致抑郁癥的重要發(fā)病機制。NLRP3炎性小體由NLRP3、ASC和Caspase-1三部分組成,其組裝成功后促進GSDMD和 IL-1β成熟,其中GSDMD是細胞焦亡的執(zhí)行蛋白,GSDMD成熟后使細胞穿孔,釋放細胞質內的IL-1β,促進IFN-γ等炎癥因子產生,從而引發(fā)炎癥級聯(lián)反應,促進抑郁的發(fā)生[22]。海馬和前額葉皮質是邊緣系統(tǒng)的重要組成部分,參與情緒的調節(jié),是抑郁癥常累及的部位[23]。研究發(fā)現(xiàn),抑郁小鼠海馬中NLRP3、GSDMD和IL-1β表達水平明顯升高,而NLRP3基因敲除的小鼠未出現(xiàn)抑郁樣表現(xiàn),GSDMD、IL-1β蛋白表達水平沒有升高[4]。本研究結果顯示,抑郁大鼠海馬和前額葉皮質組織中NLRP3mRNA及NLRP3和GSDMD蛋白表達水平升高,與其他研究結果一致。呂霞等[24]的研究發(fā)現(xiàn),氟西汀可抑制CUMS大鼠腦內NLRP3炎性小體激活,提示頤腦解郁方組和鹽酸氟西汀組可逆轉CUMS應激導致的海馬和前額葉皮質組織中NLRP3mRNA及NLRP3和GSDMD蛋白表達的上調,表明頤腦解郁方可抑制NLRP3的激活,減少GSDMD的表達,進而減少促炎細胞因子IL-1β和IFN-γ的成熟和釋放,從而改善CUMS大鼠的抑郁樣行為。

綜上所述,頤腦解郁方可有效改善CUMS大鼠的抑郁樣行為,可能與抑制海馬和前額葉皮質組織中NLRP3的激活從而發(fā)揮抗細胞焦亡和抗炎作用有關。但是頤腦解郁方為中藥復方,具有多成分、多靶點和多通路的特性,本實驗僅初步探索其對NLRP3相關炎癥蛋白的影響,具體通路和機制仍有待進一步闡明。