基于網(wǎng)絡藥理學探討加味通竅活血湯治療瘀血阻竅型后循環(huán)缺血的作用機制*

張道培,劉夢琳,張懷亮

河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院/河南省眩暈病診療中心/河南省中醫(yī)藥大學眩暈病研究所,河南 鄭州 450000

后循環(huán)缺血(posterior circulation ischemia,PCI)是缺血性腦血管病的常見類型,約占缺血性腦血管病的20%[1-2]。由于PCI常見臨床癥狀以頭暈/眩暈為主,故多參照中醫(yī)學“眩暈”病范疇進行辨病辨證[3]。歷代醫(yī)家對于眩暈的病因病機論述頗多,主要有因風、因痰、因虛、因火、因瘀5個流派,為后人從不同的角度認識和治療眩暈提供了豐富的經(jīng)驗[4]。后循環(huán)血管解剖結構復雜,行程較長且變異多,是中西醫(yī)結合從瘀論治PCI的病理生理基礎。

通竅活血湯出自王清任的著作《醫(yī)林改錯》,是活血化瘀的名方,全方由赤芍一錢、川芎一錢、桃仁三錢、紅花三錢、老蔥三根、鮮姜三錢、紅棗七個、麝香五厘(絹包)組成,用黃酒半斤煎煮服用,具有活血化瘀、通竅活絡的功效,現(xiàn)代臨床常用此方治療瘀血阻竅型腦血管病。本課題組在原方的基礎上加全蝎入絡,石菖蒲豁痰,葛根引藥上行組成加味通竅活血湯來治療瘀血阻竅型PCI取得了較好的臨床療效[5],但其作用機制有待進一步闡釋。此項研究旨在通過網(wǎng)絡藥理學的方法探討加味通竅活血湯治療瘀血阻竅型PCI的可能機制和潛在靶點,為PCI的中醫(yī)藥研究和治療提供依據(jù)與參考。

1 資料與方法

1.1 中藥活性成分和靶點的篩選通過中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP,http://tcmspw.com/tcmsp.php)檢索加味通竅活血湯組方中藥麝香、川芎、赤芍、桃仁、紅花、全蝎、石菖蒲,葛根、老蔥、生姜、大棗的化學成分,篩選出口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%,且類藥性指數(shù)(drug-likeness,DL)≥0.18的活性成分及其相關靶點?；赨niprot KB(http://www.uniprot.org/)數(shù)據(jù)庫,借助Perl軟件對中藥有效成分對應的靶點進行注釋。

1.2 疾病靶點的篩選利用Genecards(https://www.genecards.org/)數(shù)據(jù)庫及在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(online mendelian inheritance in man,OMIM,https://omim.org/)檢索“posterior circulation ischemia”,查找PCI相關靶點,并進行整合去重。

1.3 蛋白互作網(wǎng)絡構建通過VENNY2.1軟件對中藥有效成分相關靶點和疾病相關靶點取交集,將獲取的交集靶標導入String11.0(https://string-db.org/)中,構建蛋白質互作網(wǎng)絡(protein-protein interaction networks,PPI)。

1.4 篩選核心基因將獲得的交集基因導入String11.0中,下載PPI網(wǎng)絡的tsv文件,并導入到Cytoscape3.7.2軟件中,利用CytoHubba插件篩選核心靶點。

1.5 構建“中藥-成分-靶點”網(wǎng)絡將中藥名稱、藥物有效成分、基因靶標等相互之間的關系網(wǎng)絡信息導入到Cytoscape3.7.2軟件進行可視化分析,構建“中藥-成分-靶點”網(wǎng)絡圖并分析。

1.6 富集分析將核心靶點基因ID借助R軟件和Bioconductor(http://www.bioconductor.org)數(shù)據(jù)庫的工具包進行基因本體(gene ontology,GO)功能富集分析及京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)信號通路富集分析。GO功能富集分析選擇P<0.05的條目進行功能注釋,根據(jù)富集程度均篩選前20個條目繪制成柱狀圖;同樣選擇P<0.05為顯著性通路途徑進行聚類分析,根據(jù)富集程度篩選前20個條目繪制成氣泡圖。

1.7 分子對接從PubChem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下載核心成分的2D結構,通過ChemBio3D 2014軟件將其能量最小化,并把2D結構轉換為3D結構。從PDB數(shù)據(jù)庫(http://www.rcsb.org)下載關鍵靶蛋白3D結構。利用Pymol軟件對靶蛋白受體分子進行去水、去配體小分子等處理,再使用Autodock Tools 4.2.6軟件對靶蛋白受體分子進行加氫等處理,通過Autodock Vina進行分子對接,并用Pymol軟件進行3D展示。

2 結果

2.1 中藥活性成分及靶點通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索加味通竅活血湯組方中藥川芎、赤芍、桃仁、紅花、石菖蒲、葛根、老蔥、生姜、大棗的化學成分,篩選符合OB≥30%、DL≥0.18的中藥活性成分,其中川芎7個、赤芍29個、桃仁23個、石菖蒲4個、紅花22個、葛根4個、老蔥6個、生姜5個、大棗29個活性成分;通過文獻檢索補充麝香與全蝎的主要成分,其中麝香的主要有效成分麝香酮未能在TCMSP數(shù)據(jù)庫中檢索到,在PubChem數(shù)據(jù)庫中下載麝香酮的3D結構,利用ParmMapper數(shù)據(jù)庫基于麝香酮的藥效團模型預測其作用靶點。通過TCMSP數(shù)據(jù)庫獲取活性成分相關靶點并借助Uniprot KB數(shù)據(jù)庫和Perl軟件進行注釋后共獲得加味通竅活血湯相關靶點289個。加味通竅活血湯的部分有效成分信息如表1所示。

表1 加味通竅活血湯部分有效成分信息

2.2 疾病相關靶點在Genecards數(shù)據(jù)庫檢索“posterior circulation ischemia”查找到PCI相關靶點1 997個,計算相關性評分的中位數(shù),保留相關性評分≥中位數(shù)的疾病靶點;檢索OMIM數(shù)據(jù)庫獲得疾病靶點52個,整合去重后共得到疾病相關靶點 1 044 個。

2.3 PPI網(wǎng)絡通過VENNY2.1軟件對中藥活性成分靶點和疾病相關靶點取交集,共獲得了131個交集靶點。將獲取的交集靶點靶標導入String11.0(https://string-db.org/)中,選擇“multiple proteins”,物種選擇“homo sapiens”,中等置信度設為0.40,以構建相關PPI網(wǎng)絡。見圖1。

圖1 韋恩圖和PPI網(wǎng)絡

2.4 核心基因將131個交集靶點導入String11.0中預測PPI網(wǎng)絡后,剔除1個孤立節(jié)點,下載tsv文件導入Cytoscape3.7.2軟件中進行網(wǎng)絡分析,根據(jù)Degree值篩選出排名前20位的靶標,見圖2;利用CytoHubba插件,基于MCC算法篩選出10個核心基因,如圖3所示。

圖2 Degree值排名前20位的靶點

圖3 加味通竅活血湯治療PCI的核心靶點

2.5 “中藥-成分-靶點”網(wǎng)絡將中藥成分及靶點等相互作用關系的信息導入Cytoscape3.7.2軟件中進行可視化分析,構建“中藥-成分-靶點”網(wǎng)絡圖,如圖4所示;該網(wǎng)絡共包括207個節(jié)點(10個中藥名稱節(jié)點、64個化合物成分節(jié)點、131個基因靶標節(jié)點、1個方劑名稱節(jié)點、1個疾病名稱節(jié)點)和 669條邊,紅色菱形代表方劑名稱、紫色矩形代表中藥名稱、橢圓形代表有效成分(其中橘色橢圓形代表多種中藥共同含有的成分)、綠色矩形代表基因靶標、藍色矩形代表疾病名稱。網(wǎng)絡分析顯示,度值排名前10位的化合物分別為槲皮素(MOL000098)、17-β-雌二醇(MOL010919)、木犀草苷(MOL000006)、山柰酚(MOL00422)、β-谷甾醇(MOL000358)、黃芩素(MOL002714)、β-胡蘿卜素(MOL002773)、芒柄花黃素(MOL000392)、豆甾烯醇(MOL000449)、楊梅酮(MOL002135),見表2,其中槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、黃芩素、β-胡蘿卜素、豆甾烯醇均來自加味通竅活血湯中的多種中藥。

圖4 “中藥-成分-靶標”網(wǎng)絡圖

表2 度值排名前10位的活性成分

2.6 富集分析通過R軟件及Bioconductor數(shù)據(jù)庫中的clusterProfiler、enrichplot等工具包進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。GO富集分析是對基因和蛋白質功能進行限定和描述的,分為生物過程(biological process,BP)、分子功能(molecular function,MF)和細胞組成(cellular component,CC)3個部分,每一類從不同的層面進行基因解釋,顏色越深表示富集越顯著。GO分析結果顯示,BP主要與對氧氣水平下降的反應(response to decreased oxygen levels)、對缺氧的反應(response to hypoxia)及對氧化應激的反應(response to oxidative stress)等生物過程密切相關;MF主要與細胞因子受體結合(cytokine receptor binding)、磷酸酶結合(phosphatase binding)、RNA聚合酶Ⅱ轉錄因子結合(RNA polymerase Ⅱ transcription factor binding)等相關;CC主要涉及膜微區(qū)(membrane microdomain)、受體復合體(receptor complex)、囊泡腔(vesicle lumen)及轉錄因子復合體(transcription factor complex)等。如圖5所示。

圖5 GO功能富集分析

對獲得的靶標進行KEGG通路富集分析,選P值較小、富集程度高的20條通路進行可視化,見圖6氣泡圖。涉及的信號通路主要包括脂質與動脈粥樣硬化、流體剪切應力與動脈粥樣硬化、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、MAPK信號通路、IL-17 信號通路、TNF信號通路及細胞凋亡(apoptosis)和癌癥相關信號通路等。

圖6 KEGG 通路富集分析氣泡圖

2.7 分子對接通過對“中藥-成分-靶標”網(wǎng)絡的分析及文獻查閱,選擇槲皮素、木犀草苷、山柰酚、麝香酮、17-β-雌二醇、β-谷甾醇作為核心成分,分別與核心靶蛋白HIF-1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)、表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)、血管內皮生長因子A(vascular endothelial growth factor,VEGFA)、白細胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、基質金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)進行分子對接,見表3。結合能越低代表受體與配體的親和力越好,選取結合能≤-5.0 kJ·mol-1作為化合物與靶點有效結合的篩選依據(jù),將每個核心靶蛋白受體分子對接活性最強的化合物通過Pymol軟件進行展示,見圖7。

表3 核心成分與靶蛋白的結合能 (kJ·mol-1)

3 討論

PCI的主要病因是動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS),在AS病變過程中始終伴隨著血管重塑(vascular remodeling,VR)[6]。VR的機制可能與血流動力學刺激、細胞外基質(extracellular matrix,ECM)改變、血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)增殖、凋亡、遷移及炎性反應損傷等有關[7],其中VSMCs的增殖、遷移、表型轉化以及凋亡是VR的中心環(huán)節(jié)[8]。通竅活血湯是廣泛應用于預防和治療腦血管疾病的中藥經(jīng)典方劑,本課題組通過臨床觀察發(fā)現(xiàn),加味通竅活血湯可明顯改善瘀血阻竅型后循環(huán)缺血患者的臨床癥狀,改善患者的后循環(huán)血流動力學參數(shù)[7],提示加味通竅活血湯可能影響后循環(huán)的血管重塑,但加味通竅活血湯發(fā)揮臨床療效的確切分子途徑尚不清楚。

本研究檢索出加味通竅活血湯的主要活性成分是槲皮素、17-β-雌二醇、木犀草苷、山柰酚、β-谷甾醇、黃芩素、β-胡蘿卜素等。研究發(fā)現(xiàn),槲皮素可有效抑制VSMCs增殖,并抑制膠原的合成和分泌,其機制可能與槲皮素可激活磷脂酰肌醇 3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinases,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)/核轉錄因子-κB(nuclear transcription factor-κB,NF-κB)信號通路,上調磷酸化PI3K及Akt表達水平,進而抑制NF-κB向核內轉運有關[9];也有研究表明,槲皮素可抑制凝血酶誘導的大鼠VSMCs增殖和遷移,其機制可能與抑制ERK1/2和p38磷酸化有關[10]。實驗研究發(fā)現(xiàn),槲皮素能夠抑制ox-LDL誘導的VSMCs鈣化及細胞炎癥因子分泌[11],還可抑制ox-LDL誘導的人臍靜脈VSMCs分泌MMP-2和MMP-9,這可能是槲皮素參與抗動脈粥樣硬化的途徑之一[12]。研究發(fā)現(xiàn),17-β-雌二醇(17-β-estradiol,17-β-E2)可通過上調Bax蛋白表達而誘導VSMCs凋亡[13];17-β-E2能下調血管壁組織的NF-κB和細胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)的表達,抑制血管壁的炎癥反應[14-15];另外,17-β-E2可起到一定的促進血管內皮細胞(vascular endothelial cells,VECs)自噬的作用[16]。木犀草苷是一種黃酮類化合物,具有抗氧化和清除自由基的能力,可以保護VECs免受鐵過載損傷[17]。山柰酚-3-O-蕓香糖苷能抑制VSMCs的增殖和遷移[18];且山柰酚對炎癥狀態(tài)下的VECs具有顯著的保護作用[19]。β-谷甾醇可通過抑制表皮細胞、巨噬細胞中炎性小體NLRP3的激活來抑制絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號通路的活化,減少細胞中 NF-κB、IL-1β的生成,從而達到抗炎作用[20];還可通過影響巨噬細胞一氧化氮(nitric oxide,NO)、活性氧(reactive oxygen species,ROS)的產生及iNOS等炎癥介質的表達進而使VCAM-1的表達下調,阻止 THP-1 單核細胞與血管平滑肌細胞的黏附起到改善AS的作用[21-22]。麝香酮可通過穩(wěn)定線粒體膜電位,減少Ca2+內流,從而抑制過氧化氫誘導的人VECs的凋亡[23];還可通過抑制P-糖蛋白和MMP-9的表達改變體外血腦屏障模型的通透性[24]。黃芩素能明顯抑制高糖導致的VSMCs從收縮表型到合成表型轉化[25];還可抑制VSMCs的增殖并促進其凋亡[26]。β-胡蘿卜素對高糖誘導的內皮細胞損傷有保護作用[27]。綜上,加味通竅活血湯藥效成分可能通過抑制炎癥介質的表達保護血管內皮,抑制VSMCs的增殖和遷移,從而改善動脈硬化和血管重塑治療PCI。

從核心靶點的角度進行分析,HIF-1是缺氧條件下表達的最重要因子,包括功能亞基α和組成性表達的β亞基,HIF-1α僅在缺氧條件下穩(wěn)定表達,和EGF、血小板衍生生長因子(plateletderived growth factor,PDGF)等共同協(xié)調VEGF的表達[28-29];當腦血管出現(xiàn)血流動力學障礙,腦組織缺血缺氧可誘導HIF-1α表達,進而激活VEGFA/VEGFR2信號通路,該信號通路在缺血性腦血管病中參與AS和新生血管生成等病理生理過程。IL-1β 主要是由外周血單核細胞、巨噬細胞和腦小膠質細胞合成,作為促炎細胞因子在炎癥反應中發(fā)揮重要調控作用[30]。MMP-9屬于鋅依賴性蛋白水解酶家族,其來源于巨噬細胞、中性粒細胞、成纖維細胞和上皮細胞等多種細胞類型,TNF-α和白細胞介素等炎癥因子可以刺激MMPs的表達;反過來,MMPs降解ECM,促進炎癥細胞、細胞表面受體和其他非ECM分子等細胞的遷移和募集,介導參與細胞黏附、增殖和凋亡等炎癥過程;MMP-9的升高與多種疾病狀態(tài)有關,如在動脈粥樣硬化斑塊中,基底膜降解導致炎癥細胞募集和纖維帽破裂,進而導致斑塊不穩(wěn)定和破裂[31-32]。另外,剪切應力和動脈壓力等血流動力學的改變也可以調節(jié)MMP的表達,參與血管重構,低流體剪切應力誘導的MMP-9表達與MAPK或ERK1/2/NF-κb信號通路有關[33]。

本研究KEGG通路分析發(fā)現(xiàn),靶點主要富集在脂質與動脈粥樣硬化、流體剪切應力與動脈粥樣硬化、MAPK信號通路、IL-17信號傳導途徑、TNF信號傳導途徑及細胞凋亡等信號通路。低流體剪切力可下調VSMCs的機械敏感性陽離子通道Piezo1而激活IL-1β介導的炎癥反應,誘導VSMCs的增殖和遷移[34]。MAPK是一類重要的細胞內信號轉導物質,能將細胞外信號轉導至細胞核,以應對各種不同的刺激(包括細胞增殖、炎癥反應及應激反應等),MAPK信號傳導級聯(lián)包括ERK1/2(細胞外信號調節(jié)激酶)、JNK(c-jun N末端激酶)和p38(p38蛋白)3種不同的途徑。有研究已證明,MAPK在缺血性腦血管病的各階段均可被激活,表達水平發(fā)生改變,并可能產生神經(jīng)保護作用[35];ERK1/2的激活常保護神經(jīng)元減少凋亡,p38和JNK的升高可導致神經(jīng)細胞死亡[36]。MAPK通路和NF-κB的激活與VSMCs中VCAM-1的表達有關[37],可通過腦血管內皮細胞中的p38和JNK激活刺激VCAM-1的表達[38]。因此本研究推測,VEGFA/VEGFR2信號通路、MAPK信號通路、MMPs信號通路以及VSMCs介導的血管重塑是加味通竅活血湯治療PCI的重要通路。

為了進一步驗證加味通竅活血湯治療PCI的藥效物質基礎,本研究對加味通竅活血湯的主要成分與核心靶蛋白進行了分子對接。分子對接結果顯示,槲皮素和木犀草苷與VEGFA、MMP-9、HIF-1α、IL-1β 結合性較高,山柰酚與VEGFA、MMP-9、HIF-1α的結合性較高,17-β-雌二醇與VEGFA和MMP-9的結合能性較高;結合以上對藥效成分的分析,說明加味通竅活血湯中通過調節(jié)VEGFA、MMP-9、HIF-1α、IL-1β等靶點發(fā)揮藥效作用的主要成分為槲皮素、木犀草苷、山柰酚和17-β-雌二醇。另外,值得注意的是,作為受體蛋白的 MMP-9 與槲皮素、木犀草苷、山柰酚的結合性均較高,提示加味通竅活血湯對MMP-9的調節(jié)可能在瘀血阻竅型PCI的治療中發(fā)揮重要作用。

綜上所述,加味通竅活血湯中的槲皮素、17-β-雌二醇、木犀草苷、麝香酮、黃芩素等有效成分可能通過作用于VEGFA、EGF、HIF-1α、MMP-9、IL-1β 等核心靶點調節(jié)血管壁的炎癥反應、VSMCs的增殖、遷移及VECs的損傷和凋亡等,延緩血管重塑,促進血管新生,從而對瘀血阻竅型PCI患者起到改善循環(huán)和神經(jīng)保護的作用。本研究只是從理論上對其進行探討,其結果有待于進一步基礎實驗驗證。