超聲-酶輔助雙水相提取枳殼黃烷酮工藝的建立與優(yōu)化

陳珊珊,韓冷,程玉嬌,李貴節(jié)*,馮瑞章,劉雯雯,孫志高*

1(西南大學(xué),柑桔研究所,重慶,400712)2(國家柑桔工程技術(shù)研究中心,重慶,400712)3(宜賓學(xué)院,香料植物資源開發(fā)與利用四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,宜賓 四川,644000)

枳殼(Fructusaurantii)為蕓香科植物酸橙(CitrusaurantiumL.)及其栽培變種的干燥未成熟果實(shí),具有治療胸脅氣滯、脹滿疼痛、食積不化等功效[1],不僅可作為原料添加到功能性食品中,也能直接作為中藥材。不同柑橘品種黃烷酮種類和含量也不一樣,如枳殼中主要黃烷酮成分新橙皮苷和柚皮苷分別為5.6%和 4.11%[2],其含量的高低直接影響枳殼的藥理作用,因此分析、提取和研究枳殼中這兩種功能成分,將對(duì)枳殼的中藥現(xiàn)代化及藥食同源開發(fā)及應(yīng)用具有重要意義。新橙皮苷具有減肥[3]、抑制股骨頭壞死[4]、減輕肺纖維化[5]、保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)[6]、抗癌[7]等藥理作用。柚皮苷具有抗骨質(zhì)疏松[8]、動(dòng)脈粥樣硬化[9]、過敏[10]、促進(jìn)細(xì)胞凋亡[11]、調(diào)節(jié)微生物活性[12]等作用。此外,新橙皮苷和柚皮苷在調(diào)味品中也都有很大的應(yīng)用價(jià)值,其對(duì)應(yīng)的二氫查爾酮(新橙皮苷二氫查爾酮和柚皮苷二氫查爾酮)相對(duì)蔗糖甜度值分別為1 000和300[13],是優(yōu)良的零熱量新型甜味劑。

傳統(tǒng)提取類黃酮化合物的方法主要有水浴回流提取、索氏提取、醇提酸析、堿提酸析等[14],但這些提取技術(shù)普遍存在工藝耗時(shí)長、有機(jī)溶劑成本高、萃取率低、生物活性成分易降解等缺陷。因此,為了克服傳統(tǒng)提取技術(shù)的缺陷,國內(nèi)外已開發(fā)出新的提取技術(shù),如雙水相(aqueous two-phase,ATP)提取技術(shù)、半仿生-酶法提取技術(shù)[15]、閃式提取技術(shù)[16]等。其中,雙水相提取技術(shù)是一種利用目標(biāo)化合物在兩種互不相溶的兩水相間選擇性的分配,而實(shí)現(xiàn)分離的技術(shù),可一步實(shí)現(xiàn)目標(biāo)化合物的提取和初步純化[17],別具優(yōu)勢(shì)。近年來,有機(jī)溶劑-鹽系統(tǒng)具有價(jià)格低廉、綠色環(huán)保、傳質(zhì)與平衡反應(yīng)迅速、回收效率高等特點(diǎn),在提取和分離植物中的天然活性物質(zhì)方面得到了廣泛應(yīng)用?；陔p水相提取技術(shù)獨(dú)特的分離優(yōu)勢(shì),已經(jīng)將其與其他提取技術(shù)結(jié)合起來[18],從而實(shí)現(xiàn)更高的提取分離效果。超聲輔助提取是目前應(yīng)用最廣泛的一種提取技術(shù),不僅能增加產(chǎn)品的得率、縮短提取時(shí)間,還能降低理化傷害[19]。酶輔助提取因具有高效、環(huán)境友好、易于操作等優(yōu)點(diǎn)在食品工業(yè)中被廣泛應(yīng)用[20]。本文結(jié)合雙水相提取、超聲輔助提取及酶輔助提取技術(shù)三者獨(dú)特的優(yōu)勢(shì),擬開發(fā)一種更高效和綠色環(huán)保的提取方法,它被定義為超聲-酶輔助雙水相提取技術(shù)(ultrasonic-enzyme assisted aqueous two-phase extraction,UEA-ATPE)。

本文以重慶銅梁枳殼為原料,將黃烷酮新橙皮苷和柚皮苷的得率作為考察指標(biāo),篩選最適的雙水相體系作為提取劑,將超聲輔助提取與酶輔助提取應(yīng)用于黃烷酮的提取,并通過制備型液相色譜、核磁共振(nuclear magnetic resonance,NMR)、傅里葉紅外光譜(Fourier transform infrared spectroscopy,FT-IR)、高分辨質(zhì)譜(high-resolution mass spectrometry,HR MS)等方法對(duì)提取物做分離、純化和鑒定,以期為枳殼功能成分的高效提取利用提供基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)和方法支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枳殼,產(chǎn)自重慶銅梁(40目篩);乙醇(分析純)、新橙皮苷(分析對(duì)照品,≥98%)、柚皮苷(分析對(duì)照品,≥98%)(色譜級(jí)),ACMEC公司;Na2SO4、Na2CO3、(NH4)2SO4、K2CO3、Na2HPO4、KH2PO4、NaCl(均為分析純)、磷酸、乙腈(色譜級(jí)),麥克林Macklin公司;酸性果膠酶(300 000 U/g)、酸性纖維素酶(500 000 U/g)、中性蛋白酶(150 000 U/g),山東隆科特酶制劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DF101S集熱式恒溫磁力攪拌器,鄭州長城科工貿(mào)有限公司;DP-800超聲波清洗器,上海生析超聲儀器有限公司;L-550臺(tái)式低速大容量離心機(jī),長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司;RE52CS-2旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,上海亞榮生化儀器廠;LC-1260高效液相色譜儀,德國安捷倫科技有限公司;AS20005半制備液相色譜儀,江蘇漢邦科技有限公司;600 MHz核磁共振波譜儀、BRUKER TENSOR 27傅里葉變換紅外光譜儀FT-IR、impact II高分辨率質(zhì)譜儀,德國布魯克儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 超聲輔助雙水相提取枳殼黃烷酮的工藝研究

1.3.1.1 雙水相體系的確定

采用濁點(diǎn)滴定法[21]分別考察Na2SO4、Na2CO3、(NH4)2SO4、K2CO3、Na2HPO4、KH2PO4、NaCl/乙醇的成相能力,根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果選擇合適的無機(jī)鹽繪制相圖。稱取無機(jī)鹽3.6 g于50 mL具塞試管中,分別加入12.4 g去離子水溶解,再將乙醇滴加于鹽溶液中,以澄清液剛好變?yōu)槿闈嵋簽榈渭咏K點(diǎn),記下對(duì)應(yīng)的乙醇質(zhì)量(m1);體系再滴加去離子水,以乳濁液剛好變?yōu)槌吻逡簽榈渭咏K點(diǎn),記下對(duì)應(yīng)的去離子水質(zhì)量(m2)。以無機(jī)鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)(%)為橫坐標(biāo)、乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)(%)為縱坐標(biāo),繪制雙水相圖。

1.3.1.2 單因素試驗(yàn)

枳殼粉碎后取0.5 g置于50 mL離心管中,加入20 g雙水相溶劑,磁力攪拌器混合均勻后于50 ℃超聲處理30 min,真空泵抽濾后于分液漏斗中靜置1 h,待體系平衡后取出上相提取液,低溫貯存過夜除去部分鹽,4 200 r/min離心10 min后,再經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾,備用。通過單因素試驗(yàn)分別研究乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)(23%、25%、27%、29%、31%、33%)、(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)(15%、17%、19%、21%、23%、25%)和超聲功率(40、70、100、130、160、190 W)對(duì)新橙皮苷和柚皮苷得率的影響。

1.3.1.3 響應(yīng)面設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,以乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)(A)、(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)(B)、超聲功率(C)為自變量,新橙皮苷和柚皮苷得率為響應(yīng)值,按照Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn),篩選出超聲輔助雙水相提取枳殼黃烷酮的最佳工藝參數(shù),因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面分析與因素水平Table 1 Response surface analysis factors and levels

1.3.2 新橙皮苷、柚皮苷的含量測(cè)定

采用《中國藥典》[1]枳殼中新橙皮苷、柚皮苷的含量測(cè)定方法:Eclipse-XD8-C18色譜柱(4.6 mm×150 mm,5 μm),V(乙腈)：V(水)=20：80(pH用冰醋酸調(diào)整為3),檢測(cè)波長為283 nm。分別吸取新橙皮苷(390 μg/mL)和柚皮苷(385 μg/mL)對(duì)照品儲(chǔ)備液1.0、3.0、5.0、7.0、9.0 mL,分別置于10 mL容量瓶中,用甲醇定容。以對(duì)照品質(zhì)量濃度梯度(μg/mL)為橫坐標(biāo),峰面積(mUA)為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,新橙皮苷:y=10.59x-42.77(R2=0.999 7,線性范圍39～351 μg/mL);柚皮苷:y=7.977 4x-6.91(R2=0.999 6,線性范圍38.5～346.5 μg/mL)。

1.3.3 UEA-ATPE提取枳殼黃烷酮的工藝研究

枳殼粉末取0.5 g置于50 mL離心管中,分別加入4.2 g (NH4)2SO4和10.4 g水使其充分溶解,然后加入5.4 g乙醇和0.05 g酶,用磁力攪拌器混合均勻,于50 ℃下水浴2 h后,在137 W下超聲30 min,后續(xù)處理同1.3.1.2節(jié)。本試驗(yàn)先考察酶種類(纖維素酶、果膠酶、中性蛋白酶以及質(zhì)量比1：1的復(fù)合酶,包括纖維素酶/果膠酶、纖維素酶/中性蛋白酶、中性蛋白酶/果膠酶),再根據(jù)酶種類試驗(yàn)結(jié)果篩選復(fù)合酶比例(1：1、1：2、1：3、2：1、2：3、3：1、3：2)(質(zhì)量比),酶總量為0.05 g,后續(xù)處理同1.3.1.2節(jié)。

1.3.4 不同提取方法比較

為研究本試驗(yàn)新建立的提取方法與傳統(tǒng)和新型單一提取方法在提取枳殼黃烷酮方面的差異,試驗(yàn)比較了超聲輔助雙水相、50%(體積分?jǐn)?shù))乙醇浸漬、水煎法、90%(體積分?jǐn)?shù))乙醇超聲輔助。實(shí)驗(yàn)參數(shù)見表2。

表2 不同提取方法試驗(yàn)參數(shù)Table 2 Experimental parameters of different extraction methods

1.3.5 UEA-ATPE提取物的分離、純化和鑒定

采用制備型液相色譜對(duì)UEA-ATPE上相提取液做進(jìn)一步的分離純化。選擇色譜柱:C18(250 mm×9.4 mm,5 μm);以V(甲醇)：V(水)=45：55 (pH用冰醋酸調(diào)整為3)為流動(dòng)相;流量3.5 mL/min;室溫;波長283 nm;樣品量為0.5 mL,于11.3～11.9 min內(nèi)人工采集餾分。

將制備型液相色譜收集的餾分經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后,獲得一種淡黃色粉末,取其中一部分溶解于甲醇后經(jīng)分析型液相色譜測(cè)定,方法同1.3.2節(jié),并用峰面積歸一化法計(jì)算純度,剩余部分來做定性分析。采用NMR、FT-IR和HR MS等方法解析其結(jié)構(gòu),從而進(jìn)一步對(duì)純化物質(zhì)作定性確認(rèn)。

a)NMR:稱取20 mg純化物質(zhì)于核磁管中,加入0.6 mL DMSO-d6充分溶解,進(jìn)行核磁共振碳譜和氫譜測(cè)定。通過分析各個(gè)峰的化學(xué)位移及裂分情況,初步確定其結(jié)構(gòu)。

b)FT-IR:取適量純化物質(zhì)與溴化鉀以質(zhì)量比1：200混合壓片,壓片后在傅里葉紅外光譜儀上進(jìn)行400～4 000 cm-1波長范圍掃描,分析圖譜主要特征吸收峰。

c)HR MS:取適量純化物溶于甲醇,在高分辨質(zhì)譜正離子模式下全掃分析,取樣范圍(m/z)為50～1 300。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析處理

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與數(shù)據(jù)處理、繪圖采用Origin 2021、Excel 2019、SPSS 26.0、Design-Expert 8.0和ChemDraw17.0等軟件;所有樣品平行試驗(yàn)3次,結(jié)果為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲輔助雙水相提取枳殼黃烷酮條件的確定

2.1.1 雙水相體系的確立

2.1.1.1 乙醇與無機(jī)鹽構(gòu)成雙水相體系的成相結(jié)果

表3顯示乙醇與多種無機(jī)鹽(Na2SO4、Na2CO3、(NH4)2SO4、K2CO3、Na2HPO4、KH2PO4、NaCl)構(gòu)建雙水相體系的成相結(jié)果。Na2SO4、Na2CO3、(NH4)2SO4、K2CO3均能和乙醇形成雙水相,其中,Na2SO4迅速分層,靜置一會(huì)后下相出現(xiàn)沉淀;Na2CO3迅速分層后,上相渾濁;Na2HPO4、KH2PO4、NaCl均不能與乙醇形成雙水相。因此選擇(NH4)2SO4和K2CO3進(jìn)一步考察相圖繪制。

表3 各雙水相體系的成相結(jié)果Table 3 Phase formation of various ATPS

2.1.1.2 K2CO3/(NH4)2SO4與乙醇相圖

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果選擇成相能力較好的(NH4)2SO4和K2CO3并分別繪制與乙醇的相平衡圖,結(jié)果如圖1所示。曲線將體系劃分成兩個(gè)區(qū)域,曲線上方是一個(gè)兩相區(qū)域,上相主要含乙醇,下相主要含無機(jī)鹽;曲線下方是單相區(qū)域,表示不可形成雙水相。本試驗(yàn)應(yīng)從曲線上方選擇合適的無機(jī)鹽/乙醇組成,由圖1可知,(NH4)2SO4/乙醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)上下限均大于K2CO3/乙醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù),結(jié)合表3各雙水相體系的成相結(jié)果,對(duì)比兩種雙水相體系成相特點(diǎn),(NH4)2SO4/乙醇的成相能力強(qiáng),所以在接下來的試驗(yàn)中選擇(NH4)2SO4。

圖1 乙醇與不同無機(jī)鹽構(gòu)成體系的相圖Fig.1 Phase diagrams of ATPS built by ethanol and different inorganic salts

2.1.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.2.1 乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)的確定

固定(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)19%、功率100 W、50 ℃超聲輔助提取30 min等條件下,試驗(yàn)結(jié)果如圖2-a所示。隨著乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加,新橙皮苷和柚皮苷得率先增大后下降,當(dāng)乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為27%時(shí),兩者的得率都為最大值。這是因?yàn)殡S著乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加,使得雙水相體系的極性更接近于兩者的極性,根據(jù)相似相溶原理[22],從而提高了兩者在雙水相體系中的溶解度,而當(dāng)繼續(xù)增大乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)時(shí),雙水相體系提高了溶解其他有機(jī)物的能力,進(jìn)而抑制了目標(biāo)化合物的溶解[23]。因此,本試驗(yàn)選擇乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為27%。

a-乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%;b-(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%;c-超聲功率/W圖2 新橙皮苷和柚皮苷得率的單因素分析Fig.2 Analyses of single factors effecting on the yield of neohesperidin and naringin注:不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)。

2.1.2.2 (NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)的確定

固定乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)27%,其他參數(shù)不變,試驗(yàn)結(jié)果如圖2-b所示。(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加,兩者得率先是逐漸上升,當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過21%時(shí)則呈下降趨勢(shì)。這是因?yàn)?NH4)2SO4濃度的增加會(huì)促進(jìn)雙水相體系上相中的疏水相向上相分配,從而提高了兩者得率,這與WANG等[24]在乙醇/鹽水溶液兩相系統(tǒng)-超聲法從橄欖葉中提取多酚有關(guān)(NH4)2SO4的趨勢(shì)變化結(jié)果相似。因此,本試驗(yàn)選擇(NH4)2SO4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)21%。

2.1.2.3 超聲功率的確定

固定乙醇、(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為27%和21%,其他參數(shù)不變,試驗(yàn)結(jié)果如圖2-c所示。功率在40～130 W時(shí),隨著超聲功率的增加兩者得率持續(xù)增加,這是因?yàn)榭栈?yīng)產(chǎn)生的能量,在一定程度上破壞了枳殼粉末組織和細(xì)胞壁,而導(dǎo)致兩者得率增加,但超過130 W因強(qiáng)烈的空化效應(yīng)會(huì)導(dǎo)致兩者得率下降;同時(shí)超聲波作用時(shí)因高速振蕩也將枳殼粉末分散得更均勻[25],從而增加了兩者得率。故本試驗(yàn)選擇超聲功率130 W。

2.1.3 響應(yīng)面優(yōu)化超聲輔助雙水相提取黃烷酮的試驗(yàn)結(jié)果

2.1.3.1 響應(yīng)面結(jié)果及回歸模型

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,設(shè)計(jì)3因素(A、B、C)3水平共17組響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn),得到二次回歸模型:新橙皮苷得率Y1=72.54+0.67A+4.63B+3.22C-5.42AB-3.64AC-3.97BC-6.27A2-5.64B2-4.81C2;柚皮苷得率Y2=59.85+0.033A+3.40B+2.62C-4.39AB-2.41AC-2.88BC-6.40A2-6.14B2-4.66C2。

a、d-乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)和(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù);b、e-乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)和功率;c、f-(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)和功率圖3 新橙皮苷得率的響應(yīng)面和等高線Fig.3 Response surfaces and contours of neohesperidin yield注:a～c為響應(yīng)面圖;d～f為等高線圖

表4 二次響應(yīng)面回歸模型方差分析Table 4 Analysis of variance of quadratic response surface regression model

2.1.3.2 響應(yīng)面驗(yàn)證試驗(yàn)

利用Design-expert 8.0軟件分析優(yōu)化枳殼中新橙皮苷、柚皮苷提取的最佳條件:乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)26.61%、(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)21.84%、超聲功率137.06 W,新橙皮苷提取效果預(yù)測(cè)為73.83 mg/g,柚皮苷提取效果預(yù)測(cè)為60.62 mg/g。為了便于實(shí)際操作,對(duì)最佳條件進(jìn)行優(yōu)化:乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)27%、(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)21%、超聲功率137 W,其他參數(shù)同1.3.1.2節(jié)。經(jīng)過3次平行試驗(yàn)實(shí)際測(cè)得,新橙皮苷得率為(74.94±1.45) mg/g,柚皮苷得率為(61.05±1.42) mg/g,與預(yù)測(cè)值接近,說明該模型適用于超聲輔助雙水相提取新橙皮苷和柚皮苷的工藝優(yōu)化。

2.2 UEA-ATPE提取枳殼黃烷酮條件的確定

2.2.1 酶種類的確定

其他參數(shù)同響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果,試驗(yàn)結(jié)果如圖4-a所示。纖維素酶促進(jìn)作用優(yōu)于果膠酶和中性蛋白酶,纖維素酶復(fù)合另外兩種酶后,促進(jìn)作用變?nèi)?中性蛋白酶/果膠酶促進(jìn)作用強(qiáng)于其他兩種復(fù)合酶。由于枳殼中存在果膠,在加熱狀態(tài)下果膠大量溶出,提取液黏稠[26],增加了分離難度,故引入果膠酶提高新橙皮苷和柚皮苷的得率,它與中性蛋白酶復(fù)合使用后,兩者得率達(dá)到最大,這可能是因?yàn)殍讱しN子中還含有蛋白質(zhì),引入中性蛋白酶有利于提高兩者得率,因此,本試驗(yàn)后續(xù)選擇中性蛋白酶/果膠酶。

a-酶種類;b-酶質(zhì)量比圖4 酶種類和比例對(duì)新橙皮苷和柚皮苷得率的影響Fig.4 Effects of different enzyme types and enzyme proportions on the yield of neohesperidin and naringin

2.2.2 酶比例的確定

選擇中性蛋白酶/果膠酶,其他參數(shù)同響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果,試驗(yàn)結(jié)果如圖4-b所示。1：2與1：3(質(zhì)量比)的復(fù)合酶分別對(duì)兩者得率有類似的影響。1：1(質(zhì)量比)的復(fù)合酶對(duì)兩者得率優(yōu)于其他幾種比例組合,不同酶組合比例對(duì)新橙皮苷得率的影響比柚皮苷大,究其原因可能是:a)本試驗(yàn)枳殼提取液中新橙皮苷的含量高于柚皮苷,在適宜的酶處理?xiàng)l件下,柚皮苷的溶出量已達(dá)到飽和狀態(tài);b)新橙皮苷和柚皮苷的熱穩(wěn)定性和溶解度不一樣[27]。故綜合考慮,選擇質(zhì)量比1：1,新橙皮苷和柚皮苷得率分別為(92.27±2.13)、(72.24±1.56) mg/g。

2.3 UEA-ATPE與其他提取方法得率的比較

結(jié)果如圖5所示,不同的提取工藝對(duì)新橙皮苷和柚皮苷得率有明顯的影響:UEA-ATPE>超聲輔助雙水相>50%乙醇浸漬>水煎法>90%乙醇超聲輔助,可能是由于雙水相的選擇特性,超聲輔助提取的空化作用,以及酶輔助提取的高效性能更大程度地破壞枳殼細(xì)胞壁結(jié)構(gòu),促進(jìn)更多的黃烷酮被釋放出來。在5種方法中,新橙皮苷純度最高的是UEA-ATPE和超聲輔助雙水相,由于雙水相獨(dú)特的選擇性,蛋白質(zhì)、多糖等雜質(zhì)向下相轉(zhuǎn)移,可以實(shí)現(xiàn)新橙皮苷的初步分離,并簡化后續(xù)進(jìn)一步純化操作。本試驗(yàn)結(jié)果表明,一種適宜的鹽/乙醇雙水相體系可以作為提取植物中有效成分的溶劑,這與近年來的科研結(jié)果一致[28],同時(shí)超聲和酶輔助能大大提高目標(biāo)化合物的提取效率。

圖5 不同提取方法對(duì)新橙皮苷和柚皮苷得率的影響Fig.5 Effects of different extraction methods on the yield of neohesperidin and naringin

2.4 UEA-ATPE提取物的分離、純化和鑒定

a-純化物質(zhì)核磁共振碳譜圖;b-純化物質(zhì)核磁共振氫譜圖;c-純化物質(zhì)傅里葉紅外光譜圖;d-純化物質(zhì)高分辨質(zhì)譜圖附圖1 純化物質(zhì)的核磁共振圖譜、傅里葉紅外光譜圖和高分辨質(zhì)譜圖Fig.S1 NMR、FT-IR and HR MS of the purified substance

表5 純化物質(zhì)的核磁共振數(shù)據(jù)Table 5 NMR data of purified substance

綜上NMR、FT-IR和HR MS所列結(jié)果該物質(zhì)鑒定為新橙皮苷。

3 結(jié)論

本文建立了UEA-ATPE提取枳殼黃烷酮的工藝,并進(jìn)行了參數(shù)優(yōu)化。試驗(yàn)結(jié)果表明,最佳雙水相體系為 (NH4)2SO4/乙醇,乙醇和(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為27%和21%,超聲功率137 W,中性蛋白酶/果膠酶質(zhì)量比為1：1,新橙皮苷和柚皮苷得率分別達(dá)到(92.27±2.13)、(72.24±1.56) mg/g。比較了UEA-ATPE和傳統(tǒng)、新型單一提取等方法,結(jié)果表明UEA-ATPE得率最高,其提取液純化后經(jīng)光譜分析,結(jié)果表明純化物質(zhì)純度達(dá)99.37%,光譜分析鑒定為新橙皮苷。枳殼黃烷酮作為一種天然的食品成分,可用于抗炎、抗癌、保健品等方面,這為枳殼的新橙皮苷和柚皮苷的高效提取以及綜合開發(fā)利用提供參考。