發(fā)芽對小麥苗酚類物質(zhì)及抗氧化能力的影響

馬燕,王婧,程永霞,喬明武,宋蓮軍,黃現(xiàn)青*,劉星凱,屈玲玉,王世銘

1(河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,河南 鄭州,450002)2(河南省食品加工與流通安全控制工程技術(shù)研究中心,河南 鄭州,450002)

酚類物質(zhì)合成以苯丙烷代謝途徑為主,其合成途徑為:由L-苯丙氨酸經(jīng)苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia lyase, PAL)脫氨基,形成反式肉桂酸,在肉桂酸-4-羥化酶(cinnamic acid 4-hydroxylase, C4H)和4-香豆酸輔酶A連接酶(4-coumaric acid:CoA ligase, 4CL)等作用下生成黃酮類、酚酸和花色苷類等酚類物質(zhì)[9]。谷物籽粒萌發(fā)時生理生化過程得以調(diào)控,物質(zhì)代謝流向改變,酚類物質(zhì)呈現(xiàn)動態(tài)變化。以往關(guān)于小麥中酚類物質(zhì)的研究主要集中于不同品種原料籽粒及組織部位中含量變化,關(guān)注點更多在于對酚類物質(zhì)變化結(jié)果的分析,而對于發(fā)芽過程中小麥酚類物質(zhì)及其合成途徑中關(guān)鍵酶活力、抗氧化能力的動態(tài)變化還缺乏系統(tǒng)研究。基于此,本研究以大平原1號、秋樂6號、秋樂168、鄭麥163和百農(nóng)307五個品種小麥為研究對象,探討在不同發(fā)芽階段下,小麥苗總酚含量、酚類物質(zhì)合成關(guān)鍵酶PAL、C4H、4CL活力及抗氧化能力的變化,為研發(fā)谷物芽苗健康食品提供科學(xué)依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小麥:品種為大平原1號、秋樂6號、秋樂168、鄭麥163和百農(nóng)307購自河南省秋樂種業(yè)科技有限公司,2020年收獲,置于-20 ℃下保存。

培養(yǎng)條件:稱取經(jīng)過挑選、除雜后的小麥籽粒,用0.5%(體積分?jǐn)?shù))的NaClO溶液以料液比1：5(g：mL)消毒15 min,用去離子水浸泡6 h。然后將小麥籽粒均勻放置于有自動噴淋裝置的小型發(fā)芽機中進行發(fā)芽,發(fā)芽機置于濕度80%,25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中。采用LED白光照射,每天照射12 h。分別在第2、4、6天取樣(0 d為原料種子),用于后續(xù)指標(biāo)檢測。

甲醇和乙酸乙酯,廣東光華科技股份有限公司;福林酚、DPPH、ABTS、Trolox、沒食子酸,Sigma-Aldrich公司;鹽酸、碳酸鈉、氫氧化鈉、抗壞血酸,國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

MS-04SU型磁力攪拌器,蘇州捷美電子有限公司;WH-861型渦旋器,太倉市華利達實驗設(shè)備有限公司;UV-5100B型紫外可見分光光度計,上海元析儀器有限公司;MS-04SU型磁力攪拌器,蘇州捷美電子有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 生長狀況測定

隨機選取30株小麥芽苗,測定其芽長/根長,取其平均值,結(jié)果表示為mm/株。隨機選取100株小麥芽苗,測定其鮮重/干重,取其平均值,結(jié)果表示為g/100株。

1.3.2 游離和結(jié)合酚類物質(zhì)提取

游離和結(jié)合酚類化合物提取方法在MA等[10]方法的基礎(chǔ)上作適當(dāng)?shù)男薷?。將小麥苗冷凍干燥、粉碎并過60目的篩網(wǎng)后,取小麥苗粉1 g,加20 mL 80%(體積分?jǐn)?shù))甲醇,于試管架上手搖10 min,然后在10 000×g,4 ℃條件下離心10 min,重復(fù)此操作3次并把離心后的提取液合并旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干,定容后作為游離酚提取液。提取游離酚后的沉淀物加入2 mol/L NaOH后避光振蕩水解4 h,然后將得到的水解液調(diào)整pH值為1.8,乙酸乙酯與水解液充分混合后離心10 min,取上層乙酸乙酯層,重復(fù)此操作3次后合并乙酸乙酯層旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干,定容后作為結(jié)合酚提取液。

1.3.3 總酚含量

總酚含量的測定參照CHEN等[8]的方法。以沒食子酸作為標(biāo)準(zhǔn)品,通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算總酚含量,總酚含量用mg GAE(gallic acid equivalents)/100 g DW(dry weight)表示。

1.3.4 PAL活力

PAL的提取與測定參照ASSIS等[11]的方法。取小麥苗,以料液比1：10(g：mL)加入預(yù)冷的緩沖液,研磨離心后取上清液加入硼砂緩沖液、L-苯丙氨酸溶液,于37 ℃ 保溫60 min,在290 nm下測定吸光值。以每小時每克小麥苗(鮮重)酶促反應(yīng)體系吸光度值增加0.01 為一個PAL活力單位(U),表示為0.01ΔOD290/(h·g FW),即U/g FW(fresh weight)。

1.3.5 C4H活力

C4H的提取與測定參照HAN等[12]的方法。取小麥苗,以料液比1：10加入預(yù)冷的緩沖液,研磨離心后取上清液加入磷酸緩沖液、肉桂酸、NADPH,于30 ℃保溫20 min,在340 nm下測定吸光值。以每分鐘每克小麥苗(鮮重)酶促反應(yīng)體系吸光度值增加0.01為一個C4H活力單位(U),表示為0.01ΔOD340/(min·g FW),即U/g FW(fresh weight)。

1.3.6 4CL活力

4CL的提取與測定參照HAN等[12]的方法。取小麥苗,以料液比1：10加入預(yù)冷的緩沖液,研磨離心后取上清液加入MgCl2、ATP、CoA、對香豆酸,于40 ℃保溫10 min,在333 nm下測定吸光值。以每分鐘每克小麥苗(鮮重)酶促反應(yīng)體系吸光度值增加0.01為一個4CL活力單位(U),表示為0.01ΔOD 333/min·g FW,即U/g FW(fresh weight)。

1.3.7 ABTS陽離子自由基和DPPH自由基清除能力

ABTS陽離子自由基和DPPH自由基清除能力的測定參照MA等[10]的方法。以Trolox配制標(biāo)準(zhǔn)曲線,ABTS陽離子自由基和DPPH自由基清除能力以μmol TE/g DW(dry weight)計。

1.4 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析

設(shè)計3次生物學(xué)重復(fù)實驗,結(jié)果以平均值(means)±標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)表示。數(shù)據(jù)采用SPASS 20.0進行統(tǒng)計分析,顯著性水平為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)芽對小麥苗生長狀況的影響

隨著發(fā)芽時間的延長,大平原1號、秋樂6號、秋樂168、鄭麥163和百農(nóng)307五個品種小麥的芽長、根長和鮮重均呈增加趨勢(圖1-A～圖1-C),而干重則下降(圖1-D)。其中芽長在發(fā)芽前期增加幅度較大,4 d時5個品種小麥的芽長均是2 d的3倍以上,而發(fā)芽6 d時5個品種小麥的芽長則是4 d的1.5～2.0倍。秋樂168和鄭麥163在發(fā)芽全程保持較高的長勢。鮮重的變化趨勢與芽長變化一致,也是在發(fā)芽前期的增長幅度大于后期。5個品種小麥的根長和干重則在整個發(fā)芽期間保持相對穩(wěn)定的變化速率。

A-芽長; B-根長; C-鮮重;D-干重圖1 不同小麥品種發(fā)芽期間生長狀況變化Fig.1 Changes of growth status in different wheat varieties during germination注: 不同小寫字母表示在同一發(fā)芽時間下不同品種間差異顯著(P<0.05)(下同)。

2.2 發(fā)芽對小麥苗總酚含量的影響

隨著發(fā)芽時間的延長,大平原1號、秋樂6號、秋樂168、鄭麥163和百農(nóng)307五個品種小麥的游離酚含量、結(jié)合酚和總酚含量均呈增加趨勢(圖2)。發(fā)芽2 d時,大平原1號、秋樂6號、秋樂168、鄭麥163和百農(nóng)307五個小麥品種游離酚含量分別較未發(fā)芽種子增加92%、51%、52%、86%和111%;發(fā)芽4 d時,大平原1號、秋樂6號、秋樂168、鄭麥163和百農(nóng)307五個小麥品種游離酚含量分別較發(fā)芽2 d時增加68%、50%、81%、37%和51%,其中秋樂168小麥苗的游離酚含量為193 mg GAE/100 g DW,顯著高于其他品種(P<0.05),秋樂6號小麥苗的游離酚含量最低;發(fā)芽6 d時,大平原1號、秋樂6號、秋樂168、鄭麥163和百農(nóng)307五個小麥品種游離酚含量分別較第4天時增加88%、84%、54%、110%和120%,游離酚增幅最大的為百農(nóng)307,其次為鄭麥163、秋樂168,增幅最小的為秋樂6號。由于百農(nóng)307和鄭麥163游離酚增幅較大,到第6天時,二者含量已和秋樂168接近,均顯著高于另外2個品種(P<0.05)。對于結(jié)合酚而言,5個小麥品種中秋樂168具有最高的結(jié)合酚含量,且均顯著高于其他品種,秋樂6號次之,百農(nóng)307含量最低。與發(fā)芽第4天相比,5個品種小麥結(jié)合酚含量分別增加48%、43%、34%、110%和120%,其漲幅變化與游離酚變化基本一致。發(fā)芽過程中隨著游離酚和結(jié)合酚含量的提高,小麥苗的總酚含量也大幅提高,秋樂168在發(fā)芽全程都具有最高的總酚含量。

A-游離酚; B-結(jié)合酚;C-總酚圖2 不同小麥品種發(fā)芽期間總酚含量變化Fig.2 Changes of phenolics contents in different wheat varieties during germination

2.3 發(fā)芽過程小麥苗游離和結(jié)合酚比例變化

如圖3所示,發(fā)芽過程中游離酚占總酚含量的比值呈上升趨勢,但是不同品種之間差異較大,未發(fā)芽時,大平原1號、秋樂6號、秋樂168、鄭麥163和百農(nóng)307游離酚占總酚含量的比值分別為31%、29%、32%、38%和38%;第2天時5個小麥品種游離酚占總酚含量的比值分別為33%、30%、34%、40%和41%;發(fā)芽第4天時,游離酚占總酚含量的比值分別為34%、31%、37%、43%和44%;第6天時其比值變?yōu)?9%、34%、40%、44%和45%。結(jié)果顯示,發(fā)芽使小麥苗中游離和結(jié)合酚類物質(zhì)的比例發(fā)生了較大變化,進一步改善了小麥的功能品質(zhì)。

A-0 d; B-2 d; C-4 d;D-6 d圖3 不同小麥品種發(fā)芽期間游離酚類和結(jié)合酚類物質(zhì)比例變化Fig.3 Changes in the proportion of free and bound phenols in different wheat varieties during germination

2.4 發(fā)芽對小麥苗PAL、C4H和4CL活力的影響

PAL是苯丙烷代謝途徑的第一步酶,也是重要的限速酶。如圖4-A所示,隨著發(fā)芽時間的延長,5個品種小麥苗的PAL活力均先增加后下降的趨勢。發(fā)芽全程,秋樂168號小麥苗中PAL活力最高,顯著高于其他4個品種(P<0.05),百農(nóng)307的PAL活力最低。如圖4-B所示,隨著發(fā)芽時間的延長,5個品種的小麥苗C4H活力均呈上升趨勢,發(fā)芽4 d時,大平原1號、秋樂6號、秋樂168、鄭麥163和百農(nóng)307五個小麥品種C4H活力分別較發(fā)芽2 d增加47%、20%、45%、75%和48%;發(fā)芽6 d時,大平原1號、秋樂6號、秋樂168、鄭麥163和百農(nóng)307五個小麥品種C4H活力分別較第4天時增加79%、81%、43%、2%和21%,品種間變化差異較大。4CL活力變化與PAL變化趨勢一致,也是隨著發(fā)芽時間的延長活力均先增加后下降的趨勢(圖4-C),但各個品種間差異較大。發(fā)芽2 d和4 d時,鄭麥163活力顯著高于其余4個品種;發(fā)芽6 d時,鄭麥163小麥苗4CL活力與秋樂6之間無顯著差異。

A-PAL; B-C4H; C-4CL圖4 不同小麥品種發(fā)芽期間PAL、C4H和4CL變化Fig.4 Changes of PAL, C4H and 4CL during germination of different wheat varieties

2.5 發(fā)芽對小麥苗抗氧化能力的影響

由圖5看出小麥苗的抗氧化能力隨著發(fā)芽時間的延長而增加,游離態(tài)和結(jié)合態(tài)總酚的ABTS陽離子自由基和DPPH自由基清除能力均提高。發(fā)芽2 d時,大平原1號、秋樂6號、秋樂168、鄭麥163和百農(nóng)307五個小麥品種小麥苗總酚的ABTS陽離子自由基清除能力分別較未發(fā)芽種子增加60%、42%、47%、84%和104%,DPPH自由基清除能力分別較未發(fā)芽種子增加60%、47%、48%、72%和90%;發(fā)芽4 d時,5個小麥品種小麥苗總酚的ABTS陽離子自由基清除能力分別較未發(fā)芽種子增加57%、57%、59%、25%和33%,DPPH自由基清除能力分別較第2天增加58%、52%、76%、41%和45%;發(fā)芽6 d時,5個小麥品種小麥苗總酚的ABTS陽離子自由基清除能力分別較第4天增加47%、35%、27%、70%和93%,DPPH自由基清除能力分別較未發(fā)芽種子增加56%、47%、20%、72%和90%。整體看來,小麥苗ABTS陽離子自由基清除能力和DPPH自由基清除能力變化趨勢較為一致。

A-游離ABTS陽離子自由基; B-結(jié)合ABTS陽離子自由基; C-總ABTS陽離子自由基;D-游離DPPH自由基;B-E-結(jié)合DPPH自由基;F-總DPPH自由基圖5 不同小麥品種發(fā)芽期間抗氧化能力變化Fig.5 Changes of antioxidant capacity of different wheat varieties during germination

2.6 小麥苗酚類物質(zhì)和抗氧化能力相關(guān)性分析

對小麥苗酚類物質(zhì)和抗氧化能力進行相關(guān)性分析。由表1可知,大平原1號、秋樂6號、秋樂168、鄭麥163和百農(nóng)307五個小麥品種在不同生長階段的總酚含量與ABTS陽離子自由基清除能力均在0.01水平上均呈現(xiàn)顯著正相關(guān)。秋樂168在不同生長階段的總酚含量與DPPH自由基清除能力在0.05水平上均呈現(xiàn)顯著正相關(guān),其余4個品種的麥苗在不同生長階段的總酚含量與ABTS陽離子自由基清除能力均在0.01水平上均呈現(xiàn)顯著正相關(guān)。

表1 小麥苗酚類物質(zhì)和抗氧化能力相關(guān)性分析Table 1 Correlation analysis between phenols and antioxidant capacity of Wheat Seedlings

3 討論

本研究中,大平原1號、秋樂6號、秋樂168、鄭麥163和百農(nóng)307五個小麥品種的芽長、根長和鮮重隨著發(fā)芽時間的延長而增加(圖1)。小麥芽苗在不同萌發(fā)階段的生長情況不同,在本研究的3個發(fā)芽階段(0～2 d、2～4 d、4～6 d)中小麥苗生長表現(xiàn)出典型的“慢-快-慢”趨勢:0～2 d發(fā)芽減慢,2～4 d發(fā)芽加快,4～6 d發(fā)芽減慢,這與ZHOU等[13]的研究結(jié)果相似。谷物發(fā)芽時,直鏈淀粉和支鏈淀粉水解成單糖,貯藏蛋白水解成肽和氨基酸,因而干重下降,植酸酶活性增加降解多余植酸鹽,從而提高了營養(yǎng)物質(zhì)的生物利用率[14]。與此同時,發(fā)芽使得谷物中γ-氨基丁酸、類黃酮和酚酸等生理活性成分含量增加,谷物抗氧化、抗菌消炎、免疫力調(diào)節(jié)等功效增強,營養(yǎng)價值和保健功能得到提升。本研究比較了不同品種小麥籽粒中游離、結(jié)合及總酚含量,結(jié)果表明發(fā)芽能夠顯著提高小麥的酚類物質(zhì)含量(圖2),這與前人研究結(jié)果一致[15-16]。谷物中的多酚類化合物包括酚酸、花青素、醌類、黃酮醇、查耳酮、黃酮、黃烷酮類等[17],酚類物質(zhì)一部分以游離態(tài)存在,另一部分與蛋白質(zhì)、木聚糖、纖維素和半纖維素等結(jié)合存在于植物的細胞壁中[18]。以往關(guān)于酚類物質(zhì)的研究對象主要為蔬菜和水果,對于谷物中酚類物質(zhì)的研究有限,由于酚類物質(zhì)提取和純化工藝的進步,使得谷物中大量結(jié)合態(tài)酚類物質(zhì)(酚酸)被發(fā)現(xiàn),結(jié)合酚的抗氧化能力也陸續(xù)得到證實,谷物的營養(yǎng)價值被重新認(rèn)定,成為膳食多酚的重要來源之一。值得注意的是,本研究特別關(guān)注了小麥發(fā)芽期間游離和結(jié)合總酚比例的變化,發(fā)現(xiàn)發(fā)芽過程中游離酚占總酚含量的比值呈上升趨勢(圖3),這與他人研究中小麥等谷物游離態(tài)酚類物質(zhì)含量增加結(jié)論明顯一致,可能是由于發(fā)芽期間籽粒生命活動增強,苯丙烷代謝途徑被激活,相關(guān)酶的活動使得與細胞壁等結(jié)構(gòu)結(jié)合的酚類物質(zhì)釋放出來[6]。

酚類物質(zhì)含量的增加與酚類物質(zhì)合成途徑的關(guān)鍵酶活力變化有關(guān),目前關(guān)于植物食品原料中酚類物質(zhì)的研究主要集中于游離態(tài)、酯化和結(jié)合態(tài)酚酸的提取和純化工藝[19],酚類物質(zhì)組分及含量的分析[8,20]以及生理活性[21-22]等方面。對于酚類物質(zhì)合成關(guān)鍵酶活力關(guān)注較少,對于酶活力與酚類物質(zhì)含量相關(guān)性分析研究尚淺。PAL在植物次生代謝過程中有重要作用,迄今為止,已證實PAL參與花青素積累、木質(zhì)化、黃酮類物質(zhì)合成以及病蟲害防御等多種生理過程[23]。PAL是苯丙烷代謝途徑的限速酶,其活力對酚類物質(zhì)的形成速率有重要影響。本研究中,發(fā)芽前期,PAL的變化趨勢與5個品種小麥苗的總酚含量變化趨勢一致,均是隨著發(fā)芽時間的延長而持續(xù)提高,這是酚類物質(zhì)積累的直接原因,發(fā)芽后期PAL酶活力下降,但酚類物質(zhì)持續(xù)增加,這可能是因為酶活力呈動態(tài)變化,而取樣時間點有限,此外,PAL活力雖然有所下降,但仍高于發(fā)芽初期,這也使得酚類物質(zhì)持續(xù)積累,含量增加。在不同發(fā)芽階段,5個品種小麥苗酚類物質(zhì)含量與PAL酶活均呈顯著或極顯著正相關(guān)(P<0.05或P<0.01),其中秋樂168PAL酶活最強,其也具有最高的酚類物質(zhì)含量。C4H在植物組織中具有很高的活性,是黃酮類物質(zhì)合成的關(guān)鍵酶[24],本研究中,C4H與5個品種小麥苗的總酚含量在發(fā)芽全過程變化一致,都是隨著發(fā)芽時間的延長而增加。4CL于1976年由MANSELL等首次從嫩柳枝中提取,4CL酶處在苯丙烷類代謝中合成特定產(chǎn)物的轉(zhuǎn)折點上,其可生成綠原酸、羥基肉桂酸等酚酸類物質(zhì),也可以作為重要的前體物質(zhì)介入類黃酮代謝[9]。發(fā)芽全過程4CL的變化趨勢與PAL較為一致,在發(fā)芽前期增加,后期略有下降,不同品種間表現(xiàn)出一致性(圖4)。在發(fā)芽前期階段(2 d,4 d),5個品種小麥苗酚類物質(zhì)含量與C4H和4CL酶活相關(guān)性較弱,但在發(fā)芽后期(6 d)酚類物質(zhì)含量與C4H和4CL酶活表現(xiàn)出較強正相關(guān)。

大量研究表明,酚類物質(zhì)通常被認(rèn)為是對人體健康有益的一類生物活性物質(zhì),主要是因為它們具有較強的抗氧化活性。本研究采用ABTS陽離子自由基和DPPH自由基清除能力評價小麥苗的抗氧化能力,這2種評價方法都是基于電子轉(zhuǎn)移并涉及有色氧化劑還原,目前已被廣泛用來評價谷物及果蔬的抗氧化能力。研究結(jié)果表明小麥苗的抗氧化能力隨著發(fā)芽時間的延長而增加,游離態(tài)和結(jié)合態(tài)總酚的ABTS陽離子自由基和DPPH自由基清除能力均提高(圖5)。對小麥苗酚類物質(zhì)和抗氧化能力進行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),不同生長階段麥苗的總酚含量與ABTS陽離子自由基和DPPH自由基清除能力均呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)(表1),說明酚類物質(zhì)的積累是提高抗氧化能力的重要條件。

本研究分析了不同品種小麥苗發(fā)芽過程中酚類含量、酚類合成關(guān)鍵酶活力以及抗氧化能力的變化,可為小麥苗產(chǎn)品開發(fā)提供一定理論基礎(chǔ)?？偹苤?酚類物質(zhì)種類眾多,包括酚酸、黃酮、縮合單寧、木脂素等幾大類8 000多種物質(zhì),且在不同原料中的含量和種類差異較大,基于此,后續(xù)工作應(yīng)加強對小麥苗酚類物質(zhì)鑒定分析,深入研究小麥苗發(fā)芽過程酚類物質(zhì)的組成、存在形式及含量變化,系統(tǒng)性構(gòu)建小麥苗發(fā)芽過程酚類物質(zhì)變化圖譜。

4 結(jié)論

谷物營養(yǎng)價值高,富含膳食纖維、維生素和礦物質(zhì),發(fā)芽可提高谷物中各營養(yǎng)元素的含量,且可顯著提高籽粒生物活性成分,賦予其更多生理活性功能,用來開發(fā)功能食品。本研究聚焦于發(fā)芽對大平原1號、秋樂6號、秋樂168、鄭麥163和百農(nóng)307五個品種小麥苗酚類物質(zhì)形成及抗氧化能力的影響,結(jié)果表明,發(fā)芽激活了小麥苗酚類物質(zhì)合成關(guān)鍵酶,隨著發(fā)芽時間的延長小麥苗酚類物質(zhì)顯著增加,抗氧化能力顯著增強。該研究結(jié)果可為小麥深加工提供新思路,為開發(fā)富含酚類物質(zhì)等其他功能成分的谷物食品奠定理論基礎(chǔ),對促進國民經(jīng)濟和社會發(fā)展有重要意義。