醬油種曲四階段培養(yǎng)法及其在圓盤(pán)制曲中的應(yīng)用研究

◎ 閆景勇，劉建華，阮沖沖，李潔珠

（廣東廚邦食品有限公司，廣東 陽(yáng)江 529500）

醬油原油的釀造過(guò)程可分為三大環(huán)節(jié)，即原料制曲、醬醪發(fā)酵及原油分離。原料制曲是醬油釀造工藝的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，是米曲霉生長(zhǎng)分泌各種酶的過(guò)程，是醬醪發(fā)酵過(guò)程原料分解、物質(zhì)轉(zhuǎn)化的基礎(chǔ)。一般來(lái)說(shuō)，米曲霉在制曲過(guò)程中經(jīng)歷孢子吸水發(fā)芽期、菌絲生長(zhǎng)繁殖期和孢子著生期3 個(gè)階段[1]。原料制曲首先要進(jìn)行種曲培養(yǎng)，即通過(guò)上述3 個(gè)階段培養(yǎng)68 ～72 h 以實(shí)現(xiàn)米曲霉菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)而獲得成熟種曲；接下來(lái)是進(jìn)行大曲培養(yǎng)，即將成熟種曲與小麥粉、蒸煮冷卻后的黃豆混合培養(yǎng)40 ～44 h，低溫制曲工藝中大曲培養(yǎng)初期6 ～8 h 是米曲霉孢子吸水發(fā)芽期，此階段米曲霉尚未形成生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)來(lái)抑制雜菌的侵入，溫度過(guò)低或過(guò)高均會(huì)造成雜菌的污染繁殖[2]，進(jìn)而易產(chǎn)生花曲、酸曲等品質(zhì)問(wèn)題。

圓盤(pán)通風(fēng)制曲機(jī)是一種自動(dòng)化、精準(zhǔn)化的醬油制曲設(shè)備，目前國(guó)內(nèi)多數(shù)的大型醬油廠都在使用該設(shè)備[3]。在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中，空氣由單一入口進(jìn)入下風(fēng)室，在下風(fēng)室形成明顯的高速和低速區(qū)，造成氣流組織不均勻[4]。由于高速區(qū)占比相對(duì)較?。s占1/8 盤(pán)面），故而圓盤(pán)制曲是以低速區(qū)的曲料溫度進(jìn)行溫度控制，如此就會(huì)出現(xiàn)低速區(qū)曲料溫度合適時(shí)高速區(qū)曲料溫度偏低的問(wèn)題，進(jìn)而易出現(xiàn)高速區(qū)曲料培養(yǎng)前期米曲霉孢子發(fā)芽緩慢而易染雜菌造成圓盤(pán)局部大曲（6%～12%）酸曲/花曲的品質(zhì)問(wèn)題，從而影響產(chǎn)品質(zhì)量。

本研究通過(guò)采用醬油種曲四段培養(yǎng)法，即在常規(guī)種曲培養(yǎng)三階段后增加種曲預(yù)處理期使成熟種曲的孢子在種曲機(jī)內(nèi)達(dá)到發(fā)芽的狀態(tài)而獲得制曲菌種；再將其接種至原料進(jìn)行大曲培養(yǎng)，使大曲培養(yǎng)跳過(guò)孢子吸水發(fā)芽期、直接進(jìn)入生長(zhǎng)繁殖期，培養(yǎng)初期即形成競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)，抑制雜菌的污染繁殖，驗(yàn)證其對(duì)解決圓盤(pán)大曲局部酸曲/花曲品質(zhì)問(wèn)題的有效性。

1 材料與方法

1.1 菌種與原料

菌種：米曲霉3.042，由廣東美味鮮調(diào)味食品有限公司提供。

原料：黃豆、面粉、麩皮，從市場(chǎng)采購(gòu)，符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)即可；頭油，為廣東廚邦食品有限公司廣式高鹽稀態(tài)醬油釀造工藝所產(chǎn)的第一道醬油原油。

1.2 儀器與設(shè)備

IKA RH 磁力攪拌器，廣州綠百草科學(xué)儀器有限公司；25×16 血球計(jì)數(shù)板，上海求精生化試劑儀器有限公司；E100 顯微鏡，南京江南永新光學(xué)有限公司；LRH 生化培養(yǎng)箱與DHG-9140A 電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；T6 新銳可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；種曲機(jī)，江蘇華暉環(huán)?？萍加邢薰?；連續(xù)蒸煮機(jī)與大型圓盤(pán)制曲機(jī)，北京鍵聯(lián)機(jī)械設(shè)備有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 工藝流程

麩皮與水混合均勻后裝入曲盤(pán)，厚度控制在1.0 ～1.5 cm，于種曲機(jī)內(nèi)進(jìn)行高溫滅菌、冷卻后，接入三角瓶菌種，開(kāi)展醬油種曲四階段培養(yǎng)：培養(yǎng)溫度控制在30 ～34 ℃，先通過(guò)孢子吸水發(fā)芽期、菌絲生長(zhǎng)繁殖期、孢子著生期三大階段培養(yǎng)至72 h 以實(shí)現(xiàn)菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)而獲得成熟種曲，再通過(guò)優(yōu)化研究適宜條件繼續(xù)開(kāi)展第4 階段（種曲預(yù)處理期）培養(yǎng)使成熟種曲的孢子達(dá)到發(fā)芽狀態(tài)而獲得制曲菌種。

黃豆經(jīng)蒸煮冷卻后，與面粉、制曲菌種充分混勻后進(jìn)入圓盤(pán)制曲機(jī)內(nèi)，厚度一般為40 ～50 cm，控制溫度為32 ～38 ℃，培養(yǎng)6 ～8 h 后進(jìn)行第一次松曲，控制溫度為30 ～34 ℃，培養(yǎng)15 ～17 h 后進(jìn)行第二次松曲，控制溫度為26 ～30 ℃，培養(yǎng)32 ～34 h 后獲得成熟大曲。如此不僅可有效解決圓盤(pán)局部大曲酸曲/花曲的品質(zhì)問(wèn)題，同時(shí)可在確保大曲質(zhì)量的前提下縮短制曲時(shí)間，從而提升產(chǎn)品質(zhì)量且大大降低圓盤(pán)制曲的能耗成本。具體的工藝流程見(jiàn)圖1。

圖1 醬油種曲四階段培養(yǎng)法的制曲工藝流程圖

1.3.2 不同加濕量對(duì)制曲菌種的影響

第4 階段使用自來(lái)水分別按照100 mL·min-1、150 mL·min-1、200 mL·min-1、250 mL·min-1的加濕量進(jìn)行加濕培養(yǎng)，培養(yǎng)8 h 后出種，以制曲菌種中孢子的發(fā)芽率為判定指標(biāo)，確定合適的加濕量。

1.3.3 不同加濕水對(duì)制曲菌種的影響

第4 階段分別使用含0%、5%、10%、15%（V/V）頭油的加濕水以200 mL·min-1的加濕量進(jìn)行加濕培養(yǎng)，培養(yǎng)8 h 后出種，以制曲菌種中孢子的發(fā)芽率為判定指標(biāo)，確定適宜的加濕水。

1.3.4 不同通風(fēng)方案對(duì)制曲菌種的影響

第4 階段使用含10%（V/V）頭油的加濕水以200 mL·min-1的加濕量進(jìn)行加濕培養(yǎng)，并設(shè)計(jì)不同通風(fēng)方案（見(jiàn)表1）進(jìn)行通風(fēng)培養(yǎng)，培養(yǎng)8 h 后出種，以制曲菌種中孢子的發(fā)芽率為判定指標(biāo)，確定適宜的通風(fēng)方案。

表1 醬油種曲四段培養(yǎng)法中種曲預(yù)處理期通風(fēng)方案試驗(yàn)組別設(shè)計(jì)表

1.3.5 不同預(yù)處理時(shí)長(zhǎng)對(duì)制曲菌種的影響

第4 階段使用含10%（V/V）頭油的加濕水以200 mL·min-1的加濕量，并采用1.3.4 中試驗(yàn)方案2 的通風(fēng)方案進(jìn)行加濕通風(fēng)培養(yǎng)，分別培養(yǎng)至8 h、10 h、12 h、14 h 后出種，以制曲菌種中孢子的發(fā)芽率為判定指標(biāo)，確定合適的四階段培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)。

1.3.6 制曲菌種減時(shí)制曲試驗(yàn)

以成熟大曲的中性蛋白酶活力、感官（重點(diǎn)是有無(wú)酸曲/花曲）為判定指標(biāo)，以酸性蛋白酶活力為參考指標(biāo)，將黃豆經(jīng)蒸煮冷卻后，與面粉、制曲菌種充分混勻后，分別于圓盤(pán)制曲機(jī)培養(yǎng)28 h、30 h、32 h、34 h、36 h 和38 h 取樣檢測(cè)大曲理化與微檢指標(biāo)，并觀察記錄其大曲感官狀態(tài)。

1.3.7 各項(xiàng)指標(biāo)測(cè)定方法

（1）制曲菌種孢子發(fā)芽率的測(cè)定。參照《孢子數(shù)測(cè)定法》（SB/T 10315—1999）[5]對(duì)制曲菌種進(jìn)行樣品處理、制片、鏡檢，鏡檢時(shí)選取計(jì)數(shù)板四周與中間各一個(gè)區(qū)域，分別記錄已發(fā)芽孢子數(shù)目和未發(fā)芽孢子數(shù)目。制曲菌種孢子發(fā)芽率會(huì)影響到大曲培養(yǎng)相關(guān)試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，為確保試驗(yàn)質(zhì)量，以制曲菌種孢子發(fā)芽率≥85%為目標(biāo)[6]。制曲菌種孢子發(fā)芽率計(jì)算為

（2）大曲質(zhì)量指標(biāo)的測(cè)定。中性蛋白酶活力、酸性蛋白酶活力參照《蛋白酶活力測(cè)定》（SB/T 10317—1999）[7]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同加濕量對(duì)制曲菌種的影響

水是米曲霉孢子發(fā)芽必不可少的，不同加濕量對(duì)制曲菌種孢子發(fā)芽的影響見(jiàn)圖2。由圖2 可知，隨著加濕量的增加，制曲菌種孢子發(fā)芽率呈上升趨勢(shì)，當(dāng)加濕量達(dá)到200 mL·min-1后其孢子發(fā)芽率上升不明顯，這可能是米曲霉孢子吸水的速率在200 mL·min-1的加濕量下已達(dá)到最大水平，加濕量繼續(xù)增加但水分并不能被孢子有效吸收。因而，綜合考慮發(fā)芽率與加濕成本，選定四階段培養(yǎng)的加濕量為200 mL·min-1。

圖2 加濕量對(duì)制曲菌種孢子發(fā)芽率的影響圖

2.2 不同加濕水對(duì)制曲菌種的影響

醬油種曲經(jīng)歷前三階段的培養(yǎng)形成大量孢子，此時(shí)原本培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)基本消耗殆盡。在醬油種曲四階段培養(yǎng)時(shí)，適當(dāng)補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)有利于米曲霉孢子的再次發(fā)芽。本試驗(yàn)通過(guò)在加濕水中混入一定比例的含有大量氨基酸、還原糖等可被直接利用的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)頭油進(jìn)行加濕培養(yǎng)，以促進(jìn)孢子的發(fā)芽，其試驗(yàn)結(jié)果如圖3 所示。

圖3 加濕水中頭油含量對(duì)制曲菌種孢子發(fā)芽率的影響圖

由圖3 可知，當(dāng)加濕水中添加5 ～15%頭油時(shí)，其對(duì)應(yīng)的制曲菌種孢子發(fā)芽率均高于不添加的組別，說(shuō)明適當(dāng)補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)確實(shí)可促進(jìn)成熟種曲孢子的再次發(fā)芽。其中，添加量在10%與15%時(shí)促進(jìn)效果基本一致，可使制曲菌種孢子發(fā)芽率達(dá)到約70%，明顯高于添加量為5%的組別，比不添加的組別對(duì)應(yīng)的孢子發(fā)芽率約高6.4%。因此，該試驗(yàn)選用含有10%頭油的自來(lái)水作為加濕水。

2.3 不同通風(fēng)方案對(duì)制曲菌種的影響

由圖4 可知，通風(fēng)方案從對(duì)照方案不通風(fēng)到試驗(yàn)方案1 ～4 逐步增加通風(fēng)時(shí)長(zhǎng)，其對(duì)應(yīng)的制曲菌種孢子發(fā)芽率整體呈上升趨勢(shì)。從總體來(lái)看，采用試驗(yàn)方案2 ～4 時(shí)，制曲菌種孢子發(fā)芽率處于較高水平且發(fā)芽率水平基本一致，是促進(jìn)孢子再次發(fā)芽較適宜的通風(fēng)方案。隨著時(shí)間的推移，孢子陸續(xù)開(kāi)始發(fā)芽，對(duì)氧的需求會(huì)逐步增加且會(huì)逐步產(chǎn)生呼吸熱，適時(shí)的通風(fēng)有利于供氧散熱、避免局部高溫，使整體溫度更加均一而有利于孢子的萌發(fā)；但前期孢子僅是吸水膨脹，故而對(duì)氧基本無(wú)需求，因此試驗(yàn)方案3、4 雖通風(fēng)時(shí)間更長(zhǎng)但其對(duì)應(yīng)的制曲菌種孢子發(fā)芽率并未顯著高于試驗(yàn)方案2。綜上，確定通風(fēng)方案采用試驗(yàn)方案2，即醬油種曲四階段培養(yǎng)0 ～4 h 不通風(fēng)、4 h 以后以4 ～6 m3·h-1進(jìn)行持續(xù)通風(fēng)的通風(fēng)方案。

圖4 不同通風(fēng)方案對(duì)制曲菌種孢子發(fā)芽率的影響圖

2.4 不同預(yù)處理時(shí)長(zhǎng)對(duì)制曲菌種的影響

通過(guò)對(duì)加濕量、加濕水、通風(fēng)方案的優(yōu)化，在醬油種曲四階段培養(yǎng)時(shí)間為8 h（低溫制曲工藝中大曲培養(yǎng)孢子發(fā)芽的時(shí)間）時(shí)，最高的制曲菌種孢子發(fā)芽率約為80%，尚不能達(dá)到≥85%的理想狀態(tài)。分析認(rèn)為，本法直接采用在種曲機(jī)內(nèi)繼續(xù)加濕通風(fēng)培養(yǎng)的方案使孢子發(fā)芽，其孢子需從種曲機(jī)內(nèi)的氣流中吸收水分、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，相對(duì)于大曲培養(yǎng)時(shí)孢子與原料直接接觸而直接汲取水分、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的方式，其吸收的速率要低于后者，故而導(dǎo)致即使已創(chuàng)造較好的培養(yǎng)條件，但其孢子的發(fā)芽速度仍相對(duì)較慢的問(wèn)題。基于上述分析，該試驗(yàn)通過(guò)以2 h 為一個(gè)梯度逐步增加四階段的預(yù)處理時(shí)長(zhǎng)，以驗(yàn)證不同預(yù)處理時(shí)間對(duì)制曲菌種的影響，試驗(yàn)結(jié)果如圖5 所示。

圖5 不同預(yù)處理時(shí)長(zhǎng)對(duì)制曲菌種孢子發(fā)芽率的影響圖

由圖5 可知，隨著醬油種曲四階段預(yù)處理時(shí)長(zhǎng)的增加，培養(yǎng)所得的制曲菌種孢子發(fā)芽率逐漸升高。當(dāng)預(yù)處理時(shí)長(zhǎng)達(dá)到10 h 后，制曲菌種孢子發(fā)芽率均超過(guò)90%，完全達(dá)到≥85%的理想目標(biāo)。綜合考慮，實(shí)際生產(chǎn)有一定波動(dòng)，建議醬油種曲四階段的預(yù)處理時(shí)長(zhǎng)控制在10 ～12 h 為宜。

2.5 制曲菌種減時(shí)制曲試驗(yàn)

試驗(yàn)采用上述孢子發(fā)芽率超過(guò)90%的制曲菌種進(jìn)行大曲培養(yǎng)，跳過(guò)孢子吸水發(fā)芽期而直接進(jìn)入生長(zhǎng)繁殖期，培養(yǎng)初期即形成競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)，抑制雜菌的污染繁殖，有利于大曲品質(zhì)的提升，具體試驗(yàn)結(jié)果詳見(jiàn)表2。

表2 制曲菌種減時(shí)制曲試驗(yàn)結(jié)果匯總表

由表2 不同制曲時(shí)間大曲的質(zhì)量指標(biāo)與感官對(duì)比結(jié)果可知，采用本試驗(yàn)的制曲菌種進(jìn)行圓盤(pán)大曲的培養(yǎng)，其培養(yǎng)所得大曲均無(wú)酸曲/花曲，可以有效解決圓盤(pán)局部大曲存在酸曲/花曲的品質(zhì)問(wèn)題。隨著制曲時(shí)間的延長(zhǎng)，其中性蛋白酶活力與酸性蛋白酶活力整體呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，中性蛋白酶活力在制曲時(shí)間為38 h時(shí)最高、酸性蛋白酶活力在制曲時(shí)間為36 h 時(shí)最高。在制曲時(shí)間為36 ～38 h 時(shí)蛋白酶活力最高，對(duì)應(yīng)大曲整體呈黃綠色、孢子多，但就生產(chǎn)而言，孢子數(shù)過(guò)多可能影響工人操作，同時(shí)也不便于后期清潔[8]；制曲時(shí)間為32 ～34 h 時(shí)中性蛋白酶活力均超過(guò)1 500 U·g-1、酸性蛋白酶活力均超過(guò)300 U·g-1，蛋白酶活力水平整體處于優(yōu)良水平且大曲孢子適中/不多，不會(huì)影響工人操作與后期清潔。同時(shí)，相對(duì)于常規(guī)圓盤(pán)大曲培養(yǎng)周期40 ～44 h 可縮短8 ～10 h，從而提升了產(chǎn)品質(zhì)量且大大降低了原料制曲的能耗成本，本試驗(yàn)醬油種曲四階段培養(yǎng)法及其圓盤(pán)制曲的生產(chǎn)工藝具有常規(guī)圓盤(pán)大曲生產(chǎn)工藝不可比擬的品質(zhì)與成本優(yōu)勢(shì)。因此，采用本試驗(yàn)的制曲菌種制曲的時(shí)間優(yōu)選為32 ～34 h。

3 結(jié)論

通過(guò)采用本試驗(yàn)的醬油種曲四段培養(yǎng)法，即在常規(guī)種曲培養(yǎng)三階段后增加種曲預(yù)處理期使成熟種曲的孢子在種曲機(jī)內(nèi)達(dá)到發(fā)芽的狀態(tài)而獲得制曲菌種，再使用制曲菌種進(jìn)行圓盤(pán)制曲，與現(xiàn)有圓盤(pán)制曲工藝對(duì)比，得到以下結(jié)論。

（1）采用本試驗(yàn)優(yōu)化后的醬油種曲四階段培養(yǎng)法，即在常規(guī)種曲培養(yǎng)三階段結(jié)束（72 h）后，第4階段使用10%（V/V）頭油的加濕水以200 mL·min-1的加濕量，并采用0 ～4 h 不通風(fēng)、4 h 后以4 ～6 m3·h-1持續(xù)通風(fēng)的工藝進(jìn)行加濕通風(fēng)培養(yǎng)，培養(yǎng)10 ～12 h后出曲而獲得制曲菌種，該方法可使制曲菌種孢子的發(fā)芽率超過(guò)90%，達(dá)到≥85%的理想目標(biāo)。

（2）使用本試驗(yàn)的制曲菌種進(jìn)行圓盤(pán)制曲，大曲培養(yǎng)過(guò)程可跳過(guò)孢子吸水發(fā)芽期而直接進(jìn)入生長(zhǎng)繁殖期，培養(yǎng)初期即形成競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)，有利于抑制雜菌的污染繁殖，其培養(yǎng)所得大曲均無(wú)酸曲/花曲，可有效解決現(xiàn)有圓盤(pán)制曲工藝中局部大曲存在酸曲/花曲的品質(zhì)問(wèn)題。

（3）使用本試驗(yàn)的制曲菌種進(jìn)行圓盤(pán)制曲，可在確保大曲品質(zhì)的前提下，使其制曲時(shí)間相對(duì)于常規(guī)圓盤(pán)制曲工藝縮短8 ～10 h，從而大大降低了原料制曲的能耗成本。