高脂飲食誘導(dǎo)脾虛濕阻型（內(nèi)濕型）銀屑病小鼠模型的建立及評價

張雅婷，張駿鴻，汪晴，周攀宇，黎莉，韓凌，5，6 [.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 50006；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)東莞醫(yī)院（東莞市中醫(yī)院），廣東 東莞 52327；3.省部共建中醫(yī)濕證國家重點實驗室（廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院），廣東 廣州 5020；4.廣東省中醫(yī)藥科學(xué)院中醫(yī)藥分子生物與系統(tǒng)生物學(xué)團隊，廣東 廣州 5020；5.廣東省中醫(yī)證候臨床研究重點實驗室，廣東 廣州 5020；6.粵港澳中醫(yī)藥與免疫疾病研究聯(lián)合實驗室，廣東 廣州 5020]

脾虛濕阻證是由于“脾主運化”的功能虛弱，導(dǎo)致全身津液的生成不足與輸布不暢，常出現(xiàn)以疲倦乏力、少氣懶言等脾虛證為主的臨床表現(xiàn)，隨著脾虛日久，水濕積聚，全身氣血津液的運行進一步受阻，進而影響全身各臟腑功能的正常進行[1]。

銀屑病是一種由T細胞介導(dǎo)的慢性、炎癥性自身免疫性疾病，其發(fā)病受遺傳基因、免疫異常、機體內(nèi)分泌和環(huán)境等因素影響，具有纏綿難愈、易復(fù)發(fā)、影響外觀的特點，對患者的生活質(zhì)量及心理健康造成了很大的影響。早在隋朝《諸病源候論》中即有對銀屑病的記載“干癬，但有匡郭，皮枯索，癢，搔之白屑出是也”。中醫(yī)學(xué)稱銀屑病為白疕，多因情志內(nèi)傷，郁久化火，毒熱伏于營血，或因飲食失節(jié)，脾胃失和，復(fù)受風熱毒邪而發(fā)?。蝗舨【没蚍磸?fù)發(fā)作，化燥生風或經(jīng)脈阻滯，則氣血凝結(jié)，肌膚失養(yǎng)。近年來脾虛濕阻證在銀屑病發(fā)病中的影響日益受到關(guān)注。脾臟運化功能虛弱，致津液代謝輸布障礙則生內(nèi)濕；濕邪粘滯聚集，阻滯氣機，阻礙津液正常敷布，精微氣血不能濡養(yǎng)肌膚，產(chǎn)生銀屑病皮膚干燥脫屑之象；另外銀屑病反復(fù)發(fā)作，又與濕性纏綿密不可分[2]。目前已有眾多醫(yī)家應(yīng)用健脾祛濕法治療銀屑病，均取得較好的臨床效果[3-5]。因此深入研究脾虛濕阻在銀屑病發(fā)病中的作用，明確健脾祛濕藥物作用機制就顯得尤為重要，而穩(wěn)定、簡單的病證結(jié)合動物模型在此研究中是不可或缺的。

本文通過模擬“飲食不節(jié)、喜食肥甘”導(dǎo)致脾失健運，內(nèi)生濕邪的單純內(nèi)濕病因，采用高脂飼料喂養(yǎng)建立脾虛濕阻證動物模型，并結(jié)合咪喹莫特誘導(dǎo)銀屑病的經(jīng)典模型，試圖建立內(nèi)濕型脾虛濕阻證銀屑病的病證結(jié)合動物模型，從而為銀屑病臨床證型及治療研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 動物C57BL/6 小鼠，雄性，SPF 級，10 周齡，體質(zhì)量（22±2）g，由廣東斯嘉景達生物科技有限公司提供，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（粵）2020-0052，動物質(zhì)量合格證號：44825400000592。實驗動物飼養(yǎng)溫度為22～24 ℃，相對濕度為45%～55%，實驗期間動物自由進食、飲水。實驗經(jīng)廣東省中醫(yī)院實驗動物倫理委員會審批，倫理編號為：2021088。

1.2 藥物及試劑脫毛膏，美國Nair 公司，批號：NRSL-22329-05/ 70501347；5%咪喹莫特乳膏，四川明欣藥業(yè)有限責任公司，規(guī)格：3 g/支，批號：40210904；戊巴比妥鈉，美國Sigma 有限公司，批號：SHBD9166V；增殖細胞核抗原（PCNA）抗體、p38 MAPK 抗體，美國Cell Signaling Technology 公司，批號分別為：13110S、9212S；GAPDH 抗體、Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）HRP 二抗，中國Affinity Biosciences 公司，批號分別為：AF7021、S 0001；30%過氧化氫，廣州化學(xué)試劑廠，批號：KD10-AR-0.5L，臨用時按體積比1∶9 用純水稀釋成3%過氧化氫；山羊血清，碧云天生物科技公司，批號：C0265；加強型DAB 顯色試劑盒、免疫組化MaxVision HRP 試劑盒（兔），邁新生物有限公司，批號分別為：DAB-2031、KIT-5005；BCA 試劑盒，美國Thermo Scientific 公司，批號： 23227； Color Reverse Transcription Kit（with gDNA Remover），美國EZBioscience 公司，批號： A0010 CGQ； SYBR Green Pro Taq HS 預(yù)混型qPCR 試劑盒，艾科瑞生物有限公司，批號：AG11701；無水乙醇、異丙醇、三氯甲烷為國產(chǎn)分析純。

1.3 儀器Nanodrop2000 超微量紫外/可見分光光度計，美國Thermo Scientific公司；ML204T萬分之一電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；Quant Studio 7 Flex 熒光定量PCR 儀，美國ABI 公司；ChemiDoc Touch 高靈敏度化學(xué)發(fā)光成像儀，美國BIO-RAD 公司；BX53+DP72正置成像顯微鏡，日本OLYMPUS公司；VIP6-AI-J2全自動脫水機，日本櫻花公司；HistoStar 組織包埋機，美國Thermo Scientific 公司；RM2245 石蠟切片機，德國Leica公司。

1.4 脾虛濕阻證銀屑病“病證結(jié)合”小鼠模型的建立適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，將C57BL/6 小鼠隨機分為2 組，分別為正常組及脾虛濕阻證組，每組10只。正常對照組采用普通飼料（SPF 級動物維持飼料）喂養(yǎng)，脾虛濕阻證組采用45%高膽固醇高脂飼料喂養(yǎng)，共喂養(yǎng)8 周，通過內(nèi)濕法構(gòu)建脾虛濕阻證小鼠模型[6]。模型建立期間觀察小鼠的精神狀態(tài)、活動情況、對刺激的反應(yīng)以及毛發(fā)清潔度等脾虛濕阻證宏觀指標，并于每周固定時間稱量并記錄小鼠的體質(zhì)量變化。當喂養(yǎng)高脂飼料組小鼠體質(zhì)量高于正常飼料組體質(zhì)量的20%，并出現(xiàn)精神萎靡不振、扎堆蜷縮、反應(yīng)遲鈍懶動、大便質(zhì)軟以及毛發(fā)污穢油膩等表現(xiàn)時，認為脾虛濕阻證模型建立成功[7]。

將正常對照組及鑒定為脾虛濕阻證模型建立成功的小鼠均按體質(zhì)量隨機各分為兩組，每組5 只。其中，脾虛濕阻證小鼠隨機分為脾虛濕阻證組和脾虛濕阻型銀屑病組，正常組隨機分為正常組及尋常型銀屑病組。使用電動剃毛刀脫去小鼠背部2 cm × 3 cm區(qū)域的毛發(fā)，涂抹溫和型脫毛膏以去除底部絨毛。尋常型銀屑病組及脾虛濕阻型銀屑病組小鼠每日于背部涂抹5%咪喹莫特軟膏50 mg，連續(xù)涂抹7 d構(gòu)建銀屑病模型[8]。當小鼠背部涂抹咪喹莫特區(qū)域出現(xiàn)與臨床銀屑病相似的特征，肉眼可觀察到小鼠背部出現(xiàn)明顯的紅斑、鱗屑，皮膚有明顯增厚，即認為小鼠銀屑病模型建立成功。

1.5 銀屑病皮損情況及PASI 評分拍照記錄小鼠背部皮損情況，參照文獻[9]評分標準從紅斑、鱗屑以及增厚3 個方面的嚴重程度對小鼠背部皮膚進行PASI評分。評分標準為：0分（無癥狀）；1分（輕微）；2分（顯著）；3 分（嚴重）；4 分（非常嚴重），三個方面評分總和即為PASI總分。

1.6 取材咪喹莫特誘導(dǎo)7 d 后，各組小鼠腹腔注射0.3%戊巴比妥鈉（10 mL·kg-1）進行麻醉，以小鼠是否有翻身反應(yīng)確定麻醉程度。小鼠麻醉完全后，分離脾臟及皮損部位皮膚用于后續(xù)分析。取材結(jié)束后，小鼠腹腔注射過量麻醉處死。

1.7 脾臟指數(shù)比較分離得到的脾臟，于生理鹽水中清洗去除血污，濾紙吸干多余水分，電子天平稱量脾臟質(zhì)量（g），并按照如下公式計算脾臟指數(shù)。

脾臟指數(shù)=脾臟質(zhì)量（mg）/小鼠體質(zhì)量（g）

1.8 皮膚組織病理學(xué)變化分離小鼠皮損部位皮膚于4%多聚甲醛溶液中固定48 h，自動脫水機脫水，石蠟包埋。切片機將組織切成4 μm厚的切片，脫蠟后進行HE染色，顯微鏡下觀察皮膚組織表皮增厚、角化過度、角化不全以及Munro微膿腫等病理變化。

1.9 免疫組化法檢測皮膚組織中PCNA 表達取“1.8”項中皮膚組織切片，脫蠟后置于檸檬酸鈉緩沖液中采用微波法進行抗原修復(fù)，滴加3%過氧化氫作用10 min以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶。滴加5%山羊血清封閉30 min，甩干山羊血清，滴加PCNA（1∶2 000）一抗，置于濕盒中4 ℃過夜。復(fù)溫后滴加HRP 山羊抗兔二抗，室溫孵育30 min，DAB 顯色。蘇木素復(fù)染，95%乙醇、無水乙醇梯度脫水，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察棕黃色陽性表達。

1.10 皮膚屏障蛋白及細胞因子的基因檢測采用Trizol 法提取皮膚組織總RNA。勻漿破碎后的皮膚組織加入三氯甲烷混勻，靜置3 min 后于4 ℃、12 000 r·min-1（離心半徑8 cm）離心15 min。吸取500 μL 透明上清液，加入等量異丙醇，上下顛倒混勻，于4 ℃、12 000 r·min-1（離心半徑8 cm）離心15 min。棄去上清液，可見羽毛狀白色沉淀，加入75%乙醇充分洗滌沉淀，于4 ℃、7 500 r·min-1（離心半徑8 cm）離心5 min 后晾干，加入DEPC 水溶解沉淀。總RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA 后進行RT-QPCR 檢測皮膚中屏障蛋白及細胞因子的轉(zhuǎn)錄水平。選擇GAPDH作為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計算mRNA相對表達量。

1.11 皮膚組織p38 MAPK 蛋白檢測稱取60 mg皮膚組織，加入含有磷酸酶抑制劑及蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解液進行勻漿破碎，以12 000 r·min-1（離心半徑8 cm）、4 ℃離心15 min 后取上清液，采用BCA法測定各樣品蛋白濃度。蛋白樣品加入3X Loading buffer 混勻，100 ℃變性10 min 后保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?5 μg蛋白使用SDS-PAGE 凝膠進行電泳，半干轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)印至PVDF 膜上，5%BSA 室溫封閉1 h后，加入p-p38 MAPK（1∶1 000）、p38 MAPK（1∶1 000）、GAPDH（1∶10 000）抗體4 ℃孵育過夜。次日，TBST洗滌3次，每次5 min，加入HRP標記的二抗（1∶5 000）室溫搖床孵育1 h，TBST洗滌3次。以化學(xué)發(fā)光成像儀對條帶進行掃描拍照，應(yīng)用Image Lab 軟件進行條帶灰度值分析。

1.12 統(tǒng)計學(xué)處理方法采用SPSS 26.0進行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)± 標準差（±s）表示。如數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，使用One-way ANOVA 單因素方差分析；如數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，使用Kruskal-Wallis 秩和檢驗。如數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布且滿足方差齊性，采用Bonferroni 檢驗進行兩兩比較；數(shù)據(jù)不滿足方差齊性，則采用Dunnett T3 檢驗進行兩兩比較。以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠狀態(tài)、體質(zhì)量、體長及腹圍寬度變化情況脾虛濕阻證組小鼠給予高脂高膽固醇飼料喂養(yǎng)8 周后，與正常組小鼠比較，脾虛濕阻證組小鼠體質(zhì)量明顯升高（圖1-A），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），且出現(xiàn)倦怠少動、扎堆蜷縮、毛發(fā)雜亂、抓取時反應(yīng)遲鈍、掙扎較少等情況，認為脾虛濕阻證模型建立成功[7]。

圖1-B～D 結(jié)果表明，外涂咪喹莫特軟膏7 d后，脾虛濕阻證組及脾虛濕阻型銀屑病組小鼠體質(zhì)量（圖1-B）、體長（圖1-C）與正常組比較仍明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.05）；脾虛濕阻型銀屑病組小鼠腹圍與正常組比較明顯增大，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。脾虛濕阻型銀屑病組小鼠體質(zhì)量、體長與尋常型銀屑病組比，有明顯升高（P＜0.05）。小鼠仍維持倦怠少動、萎靡嗜睡、扎堆蜷縮、毛發(fā)油膩雜亂、抓取時反抗不明顯等脾虛濕阻證指征，說明脾虛濕阻型銀屑病“病證結(jié)合”模型建立成功。

2.2 小鼠背部皮損情況及PASI 評分變化情況見圖2。實驗結(jié)果表明，正常組及脾虛濕阻證組小鼠背部皮膚光滑平整，而尋常型銀屑病組小鼠和脾虛濕阻型銀屑病組小鼠給予咪喹莫特乳膏涂抹2 d后皮膚即開始發(fā)紅，在涂抹咪喹莫特乳膏3 d后小鼠背部皮膚出現(xiàn)明顯鱗屑及明顯增厚，形成銀屑病樣皮損。涂抹咪喹莫特乳膏7 d 后，與尋常型銀屑病小鼠比較，脾虛濕阻型銀屑病小鼠背部紅斑面積增大、色深，皮膚表面干燥，鱗屑覆蓋面積增大，皮膚增厚明顯，靠近尾部皮膚有明顯損傷。與尋常型銀屑病組小鼠比較，脾虛濕阻型銀屑病小鼠皮膚增厚評分有上升的趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；兩組的鱗屑評分的差異也無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；脾虛濕阻型銀屑病小鼠紅斑評分以及PASI 總分均明顯增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。

圖2 各組小鼠背部皮損情況及PASI 評分比較（±s，n=5）Figure 2 The skin lesions and PASI score of mice in different groups（±s，n=5）

2.3 小鼠脾臟質(zhì)量及脾臟指數(shù)變化情況見圖3。結(jié)果表明，與正常組比較，尋常型銀屑病組和脾虛濕阻型銀屑病組小鼠脾臟明顯腫大，脾臟質(zhì)量和脾臟指數(shù)明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）。與尋常型銀屑病小鼠比較，脾虛濕阻型銀屑病組小鼠脾臟腫大更為明顯，脾臟質(zhì)量和指數(shù)明顯高于尋常型銀屑病組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）。

圖3 各組小鼠脾臟形態(tài)變化、脾質(zhì)量及脾臟指數(shù)比較（±s，n=5）Figure 3 Morphological changes of spleen，spleen mass and spleen index of mice in different groups（±s，n=5）

2.4 小鼠皮膚病理變化及PCNA 表達情況取各組小鼠背部皮膚切片進行HE染色，觀察小鼠皮膚病理變化，結(jié)果見圖4-A。結(jié)果表明，正常組及脾虛濕阻證組小鼠背部皮膚正常，表皮層及真皮層較薄。進一步觀察尋常型銀屑病小鼠以及脾虛濕阻型銀屑病小鼠背部皮損病理變化發(fā)現(xiàn)，尋常型銀屑病組小鼠表皮增厚，可見角化不全細胞及炎性細胞浸潤等病理表現(xiàn)；與尋常型銀屑病組小鼠比較，脾虛濕阻型銀屑病組小鼠表皮增厚更加明顯，表皮突向下延伸，基底層可見角化細胞增殖過度，伴有明顯炎性細胞浸潤。

圖4 各組小鼠皮膚病理變化（A）情況（HE 染色，×100）及PCNA 表達水平（B）比較（免疫組化，×200）Figure 4 Pathological change of the skin（A）（HE staining，×100）and expression level of PCNA（B）（IHC，×200）in the mice skin

PCNA 在細胞增殖的啟動上起重要作用，是反映細胞增殖狀態(tài)的良好指標，在銀屑病皮損中PCNA表達常異常增高，目前已被廣泛應(yīng)用于銀屑病皮損模型評價中[10]。我們也采用免疫組化法檢測了各組小鼠背部皮損中PCNA 的表達情況，見圖4-B。結(jié)果顯示，與正常組及脾虛濕阻證組比較，尋常型銀屑病組及脾虛濕阻型銀屑病組小鼠皮膚PCNA陽性表達明顯增多，脾虛濕阻型銀屑病小鼠局部PCNA陽性表達更強，表明小鼠皮損部位有角質(zhì)細胞異常增殖的現(xiàn)象。

2.5 小鼠皮膚屏障蛋白基因表達變化情況皮膚屏障主要由角質(zhì)細胞、細胞間脂質(zhì)和皮脂膜構(gòu)成，其中角質(zhì)層細胞的包膜可為胞間脂質(zhì)提供正確的結(jié)合點[11]。皮膚屏障蛋白主要包括緊密連接蛋白（Claudin）、內(nèi)披蛋白（Involucrin，INV）和兜甲蛋白（Loricrin，LOR）等，這些蛋白活性紊亂可導(dǎo)致皮膚屏障功能受損。屏障受損后會產(chǎn)生信號誘使表皮的有核層不斷合成板層小體及角質(zhì)形成細胞增殖來修復(fù)屏障[12]。而增殖過程一旦失控則會導(dǎo)致銀屑病的發(fā)生。因此我們采用熒光定量PCR 的方法檢測了各組小鼠背部皮損中屏障相關(guān)蛋白LOR、INV、Claudin-1的基因表達情況，見圖5。結(jié)果表明，與正常組比較，尋常型銀屑病組及脾虛濕阻型銀屑病組小鼠皮膚中INV、LOR 和Claudin-1 基因表達水平明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與尋常型銀屑病組比較，脾虛濕阻型銀屑病組INV 下降更多（P＜0.05），LOR和Claudin-1表達水平的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

圖5 各組小鼠皮膚表皮屏障蛋白的基因表達情況（±s，n=3）Figure 5 mRNA expression level of epidermal barrier protein in mice skin（±s，n=3）

2.6 小鼠皮膚細胞因子基因表達變化情況多種細胞因子參與銀屑病的發(fā)病、維持以及復(fù)發(fā)，尤其是Th1類以及Th17 類細胞因子，包括TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17等。鈣結(jié)合蛋白S100A8 和S100A9屬于S100 鈣蛋白家族成員，在多種炎癥性及自身免疫性疾病中大量表達。在細胞內(nèi)S100A8、S100A9參與炎性細胞的遷移和花生四烯酸（arachidonic acid，AA）的代謝，在細胞外促進中性粒細胞、單核細胞募集和細胞因子分泌[13]。近年來S100A8和S100A9在銀屑病及銀屑病關(guān)節(jié)炎發(fā)病中的重要作用日益受到重視[14]。為此，我們采用熒光定量PCR 法檢測了小鼠背部皮膚中細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17A以及鈣結(jié)合蛋白S100A8、S100A9 mRNA表達水平，見圖6。結(jié)果表明，與正常組比較，尋常型銀屑病組及脾虛濕阻型銀屑病組炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17A以及鈣結(jié)合蛋白S100A8、S100A9 mRNA表達均有上升趨勢，其中IL-1β、S100A8 及S100A9 mRNA 的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。與尋常型銀屑病組比較，脾虛濕阻型銀屑病組小鼠皮膚IL-1β、IL-17A、TNF-α、S100A8 及S100A9 表達升高，但除IL-1β（P＜0.01）外，其余的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。以上表明脾虛濕阻型銀屑病小鼠皮膚中炎癥浸潤嚴重，可能進一步促進了銀屑病的病理發(fā)展。

圖6 各組別小鼠炎癥因子和鈣結(jié)合蛋白的基因表達情況（±s，n=3）Figure 6 mRNA expression level of inflammatory cytokines and calcium binding protein of mice in each group（±s，n=3）

2.7 小鼠皮損中p38 MAPK 蛋白表達變化為進一步明確小鼠脾虛濕阻型銀屑病的發(fā)病機制，我們采用Western Blot 的方法檢測了各組小鼠背部皮損中p38 MAPK 以及磷酸化p38 MAPK 蛋白表達變化情況，見圖7。結(jié)果表明，與正常組比較，尋常型銀屑病組及脾虛濕阻型銀屑病組p38 MAPK蛋白磷酸化水平明顯上升，且差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與尋常型銀屑病組比較，脾虛濕阻型銀屑病組小鼠p38 MAPK蛋白磷酸化水平上調(diào)稍多，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

圖7 各組小鼠p38 MAPK 蛋白磷酸化水平比較（±s，n=3）Figure 7 Phosphorylation level of p38 MAPK protein of mice in each group（±s，n=3）

3 討論

濕邪是六淫之一，可由外感內(nèi)傷而得。外感濕邪，與地域特點、天氣變化有關(guān)；內(nèi)傷濕邪，多與脾腎陽虛有關(guān)，如素體脾虛，或飲食傷脾，脾陽虛衰，無力運化水液，致水濕內(nèi)停，或疾病早期，過量使用苦寒清熱藥損傷脾腎陽氣，使水液代謝障礙，致濕從中生等。羅光浦等[15]研究發(fā)現(xiàn)廣東地區(qū)尋常型銀屑病患者中濕熱質(zhì)占有很大比例。押麗靜[16]研究發(fā)現(xiàn)在194例不同地域的尋常銀屑病患者病性類證素中，濕邪僅次于熱邪，位于第二，占比為63.4%。臨床上銀屑病皮膚干燥、鱗屑起皮表現(xiàn)為燥象，但反復(fù)發(fā)作、纏綿難愈的疾病特點與中醫(yī)“濕”較為相似，可能是濕邪阻滯氣機引起津聚濕阻，從而產(chǎn)生燥象，燥濕互化[17]。白彥萍教授總結(jié)多年臨床治療銀屑病的經(jīng)驗認為銀屑病纏綿難愈，復(fù)發(fā)率高的主要原因為濕邪常伴發(fā)于銀屑病的病理過程中[18]。閔仲生教授也認為在銀屑病進展期患者有出現(xiàn)以脾虛為本，濕蘊為標的脾虛濕蘊證[19]。因此，在銀屑病的中醫(yī)藥治療中，銀屑病與濕邪之間的聯(lián)系得到重視。但目前研究報道銀屑病病證結(jié)合的動物模型主要為血熱證[20]、濕熱證[21]和苦寒瀉下所致脾虛證銀屑病模型[22]，而關(guān)于外感濕邪及內(nèi)生濕邪所致脾虛濕阻型銀屑病病證結(jié)合動物模型的研究較少。

在本實驗中，我們初步建立了單純內(nèi)濕法結(jié)合咪喹莫特制備脾虛濕阻型銀屑病動物模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與尋常型銀屑病組比較，脾虛濕阻型銀屑病小鼠皮損明顯加重，脾臟質(zhì)量明顯增加，炎癥因子表達上調(diào)，p38MAPK 蛋白異?；罨?。在銀屑病的發(fā)病過程中，免疫細胞分泌IL-1β、TNF-α、IL-17A等各種促炎細胞因子和刺激因子，這些因子又反過來刺激免疫細胞活化，導(dǎo)致了機體免疫失衡，最終加速炎癥進程，促進銀屑病的發(fā)展[23]。而p38 MAPK 蛋白是MAPK信號通路中調(diào)控炎癥反應(yīng)的重要蛋白，也是銀屑病發(fā)病進程中的重要調(diào)控蛋白[24]。除了介導(dǎo)炎癥反應(yīng)外，p38 MAPK還參與細胞周期、凋亡、自噬等細胞生理功能的調(diào)控[25]。研究[26]發(fā)現(xiàn)，p38 MAPK 激活劑可迅速誘發(fā)小鼠IL-17A 依賴性銀屑病炎癥反應(yīng)，而p38 MAPK 特異性抑制劑可下調(diào)IL-17A 刺激的HaCat 細胞中炎癥因子的表達。因此，p38 MAPK蛋白的活化及下游炎癥因子的分泌增加可作為脾虛濕阻型銀屑病動物模型微觀觀測指標的參考。除表現(xiàn)出銀屑病病理特征外，還觀察到動物出現(xiàn)倦怠少動、扎堆蜷縮、毛發(fā)雜亂、抓取時反應(yīng)遲鈍、掙扎較少等中醫(yī)證候特征，提示脾虛濕阻型銀屑病病證結(jié)合模型建立成功。

然而，在對脾虛濕阻型銀屑病動物模型進行評估時，我們發(fā)現(xiàn)此病證結(jié)合動物模型還缺乏特異性的客觀指標。雖然在此病證結(jié)合動物模型中可觀察到脾臟異常腫大、炎癥因子分泌增多、炎癥信號通路活化等微觀特征，但不具有特異性，在其他證型銀屑病模型中也有觀察到相似變化[20]。但由于人與實驗動物間的差異及實驗動物的多變性，目前尚無脾虛濕阻型銀屑病動物模型判定的統(tǒng)一標準，病證結(jié)合銀屑病模型仍需要進一步的探索。在病證結(jié)合模型的判定標準中，可增加動物舌象、舌苔變化等中醫(yī)宏觀指標觀察，結(jié)合代謝組學(xué)、脂質(zhì)組學(xué)及菌群分析等現(xiàn)代分析手段為輔助，以臨床中醫(yī)證候特征及西醫(yī)疾病特征為指導(dǎo)，建立客觀統(tǒng)一的評價標準，為中醫(yī)藥治療脾虛濕阻型銀屑病提供基礎(chǔ)科學(xué)研究支持。