補(bǔ)陽還五湯抗腦缺血損傷藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的血清藥物化學(xué)研究

曾珂琪，周欣，聶聰，張英豐（廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006）

腦卒中是由于腦血管阻塞或破裂而導(dǎo)致腦血流減少甚至中斷，進(jìn)而引起腦組織損傷的破壞性腦血管疾病，可引發(fā)身體殘疾和多重功能損傷，是全球第二大死因[1]，其中80%以上為缺血性腦卒中[2]。缺血性腦卒中持續(xù)時(shí)間越久，腦損傷越嚴(yán)重，具有高發(fā)病率、高致殘率、高死亡率和高復(fù)發(fā)率的特點(diǎn)[3]，加強(qiáng)對缺血性腦卒中的研究具有積極的現(xiàn)實(shí)意義。

補(bǔ)陽還五湯出自《醫(yī)林改錯(cuò)》，由黃芪、赤芍、川芎、當(dāng)歸尾、地龍、桃仁、紅花7味中藥組成，具有補(bǔ)氣、活血、通絡(luò)的功效，是治療缺血性腦卒中的經(jīng)典名方[4]。補(bǔ)陽還五湯治療缺血性腦卒中的療效確切，但其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)尚不夠明確，常需要結(jié)合血漿、尿液、腦組織中的藥物化學(xué)成分進(jìn)行藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究[5]，其在作用部位的成分及其濃度常與療效成正相關(guān)。補(bǔ)陽還五湯作用于機(jī)體后，有效成分以血液為橋梁向病變部位轉(zhuǎn)移，形成了治療缺血性腦卒中的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。尋找和分析補(bǔ)陽還五湯入血、入腦成分，可為闡明其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供依據(jù)。故本研究擬采用線栓法復(fù)制缺血性腦卒中大鼠模型，采用超高效液相色譜四級桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用（UPLC-Q-TOF-MS）法檢測補(bǔ)陽還五湯干預(yù)后的大鼠血清及腦組織，確認(rèn)其入血、入腦成分，以闡明其治療缺血性腦卒中的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，為其作用機(jī)制研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 動(dòng)物雄性SD大鼠20只，SPF級，體質(zhì)量（280±20）g，由珠海百試通生物科技有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號：SCXK（粵）2020-0051，動(dòng)物質(zhì)量合格證號：44822700002308。動(dòng)物使用許可證號：SYXK（粵）2020-0051，大鼠飼養(yǎng)在廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，溫度25 ℃，濕度30%～60%，明暗周期各12 h，自由飲水、攝食。適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后開始實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)前禁食不禁水12 h。本研究涉及的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會批準(zhǔn)，倫理批號：20210323002。

1.2 藥物及試劑補(bǔ)陽還五湯組方中藥：黃芪（批號：220302701）、當(dāng)歸尾（批號：220101951）、赤芍（批號：211100191）、川芎（批號：190800201）、紅花（批號：191203821）、桃仁（批號：220401801）、地龍（批號：210701931），上述中藥材均購于康美大藥房連鎖有限公司，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)張英豐副教授鑒定為正品。乙腈（批號：JA095630），美國Merck公司；甲醇（批號：21110224G102），美國Oceanpak公司；甲酸（批號：20170103），天津市大茂化學(xué)試劑廠；紅四氮唑（RT，批號：C13066604），上海麥克林生化科技有限公司；注射用青霉素鈉（批號：20200301），天津市保靈動(dòng)物保健品有限公司；異氟烷（批號：045740），北京友誠嘉業(yè)生物科技有限公司；戊巴比妥鈉（批號：20130307），天津天力化學(xué)試劑有限公司。

1.3 主要儀器LC-30AD 型超高效液相色譜儀（含SIL-30AC型自動(dòng)進(jìn)樣器、CTO-20AC型柱溫箱），日本島津公司； AB SCEIX Triple TOFTM5600+飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（含PeakView、MarkerView、Analyst TF 1.7軟件），美國AB SCEIX 公司；ZORBAX SB-Aq C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，3.5 μm），美國Agilent 公司；LGJ-12 型真空冷凍干燥機(jī)，北京松源華興科技發(fā)展有限公司；E3116R 型臺式高速低溫離心機(jī)，美國Essenscien公司。

2 方法

2.1 補(bǔ)陽還五湯凍干粉的制備根據(jù)補(bǔ)陽還五湯處方比例稱取黃芪120 g、當(dāng)歸尾6 g、赤芍5 g、川芎3 g、紅花3 g、桃仁3 g、地龍3 g；粉碎后加入5 倍量純水，加熱回流提取2 h，用紗網(wǎng)過濾，濾液以4 ℃、5 000×g離心10 min 后，取上清液；倒入凍干盤中，液面高度約為1 cm，于-80 ℃冰箱中預(yù)凍過夜；然后在真空冷凍干燥機(jī)中凍干約48 h，即得補(bǔ)陽還五湯凍干粉，快速稱質(zhì)量后置于干燥器中保存，每克凍干粉相當(dāng)于生藥3.21 g。

2.2 補(bǔ)陽還五湯供試品溶液的制備取補(bǔ)陽還五湯凍干粉0.2 g，置于1 mL 容量瓶中，甲醇定容，超聲20 min，得0.2 g·mL-1樣品溶液（約相當(dāng)于生藥0.642 g·mL-1）；于-20 ℃靜置數(shù)小時(shí)后，以4 ℃、10 000×g離心10 min，取上清液，進(jìn)樣前以0.22 μm微孔濾膜濾過，置于內(nèi)插管中進(jìn)樣。

2.3 模型復(fù)制、給藥及樣品采集（1）將20只SD大鼠按照體質(zhì)量隨機(jī)分為模型組和給藥組，采用線栓法[6]復(fù)制大腦中動(dòng)脈阻塞（MCAO）大鼠模型：大鼠頸部正中作一切口，逐層分離皮膚、肌肉組織，充分暴露頸總動(dòng)脈；逐級分離，使頸內(nèi)動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈充分暴露。分別結(jié)扎頸總動(dòng)脈近心端和頸外動(dòng)脈，用微動(dòng)脈夾夾閉頸內(nèi)動(dòng)脈。于頸總動(dòng)脈結(jié)扎處和分叉口之間用眼科剪剪一“V”字型切口，以合適角度插入線栓；松開頸內(nèi)動(dòng)脈的動(dòng)脈夾，輕輕將線栓送入顱內(nèi)；插入Willis環(huán)，當(dāng)感到略有阻力時(shí)停止，此時(shí)線栓頭離分叉口為（17±1）mm，確定無活動(dòng)性出血后進(jìn)行縫合。手術(shù)過程中維持動(dòng)物體溫恒定，術(shù)后注射抗生素抗感染。

（2）模型組大鼠按照10 mL·kg-1灌胃蒸餾水，給藥組按照生藥5.4 g·kg-1劑量（相當(dāng)于臨床等效劑量的7.2倍）灌胃補(bǔ)陽還五湯凍干粉藥液，每日1次，連續(xù)給藥7 d。（3）末次給藥后，隨機(jī)從模型組及給藥組中各抽取2只大鼠，以2% 異氟烷吸入麻醉；立即處死并迅速取出大鼠腦組織，于-20 ℃冷凍30 min后，將腦組織以冠狀位切面橫切成5 片，每片厚2 mm；腦片置于2% TTC 溶液中，37 ℃下孵育30 min 染色后，用4%多聚甲醛溶液固定24 h；腦片固定后進(jìn)行拍照（見圖1），切片中紅色區(qū)域?yàn)檎ＤX組織區(qū)域，白色為梗死區(qū)域。結(jié)果表明，補(bǔ)陽還五湯對缺血性腦卒中大鼠具有改善作用。（4）末次給藥結(jié)束1 h后，腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈取血，冰上分離腦組織；血樣在4 ℃下靜置數(shù)小時(shí)后，以4 ℃、3 000 ×g離心10 min，取血清，-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 補(bǔ)陽還五湯對缺血性腦卒中大鼠腦梗死區(qū)的影響（TTC染色）Figure 1 Effect of Buyang Huanwu Decoction on cerebral infarction area in rats with ischemic stroke（TTC staining）

2.4 大鼠血清、腦組織樣品前處理（1）血清樣品處理：精密吸取大鼠血清300 μL，加入3 倍體積乙腈（4 ℃），渦旋1 min；以4 ℃、10 000×g離心10 min，吸取上清液至5 mL玻璃刻度離心管，40 ℃下氮?dú)鈸]干；100 μL乙腈（4 ℃）復(fù)溶，渦旋1 min，超聲1 min后轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP 管中；-20 ℃冷凍數(shù)小時(shí)后，以4 ℃、10 000×g離心10 min，吸取上清液至內(nèi)插管中進(jìn)樣分析。（2）腦組織樣品處理：精密稱定大鼠腦組織質(zhì)量，按照質(zhì)量體積比為1∶1（g·L-1）加入4 ℃生理鹽水；置于低溫組織研磨器中，以60 Hz、3 個(gè)循環(huán)研磨1 min；吸取腦組織勻漿液300 μL，加入3 倍體積乙腈（4 ℃），以4 ℃、10 000×g離心10 min；吸取上清液至5 mL 玻璃刻度離心管，40 ℃氮?dú)鈸]干；100 μL 乙腈復(fù)溶，渦旋1 min，超聲1 min 后轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP 管中；-20 ℃冷凍數(shù)小時(shí)后，以4 ℃、10 000×g離心10 min，吸取上清液進(jìn)樣分析。

2.5 色譜條件Agilent ZORBAX SB-Aq C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，3.5 μm）；以0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫（0～5 min，90%～65%A；5～10 min，65%～35%A；10～13 min，35%～15% A；13～15 min，15%～0% A；15～17 min，0%A；17～18 min，0%～90%A；18～21 min，90%～90% A）；流速：0.3 mL·min-1；柱溫：30 ℃；樣品室溫度：4 ℃。正離子模式下進(jìn)樣10 μL，負(fù)離子模式進(jìn)樣20 μL。

2.6 質(zhì)譜條件采用電噴霧離子源正、負(fù)離子掃描模式；正、負(fù)離子源電壓分別為5 500 V、-4 500 V；離子源溫度500 ℃；去簇電壓為±100 V；離子源霧化氣和輔助氣壓力均為55 Pa；氣簾氣壓力為35 Pa。一級質(zhì)譜掃描范圍為m/z100～2 000 Da；碰撞能為45 eV。二級質(zhì)譜采用high sensitivity模式，掃描范圍為m/z50～2 000 Da；開啟動(dòng)態(tài)背景扣除（DBS）；采用Analyst TF 1.7軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。

2.7 補(bǔ)陽還五湯入血、入腦成分指認(rèn)利用TCMSP數(shù)據(jù)庫（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）及相關(guān)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)收集、匯總補(bǔ)陽還五湯中各中藥的化學(xué)成分信息。采用Peakview 軟件采集補(bǔ)陽還五湯、空白/含藥血清、空白/含藥腦組織質(zhì)譜信息，排除空白血清、腦組織中的內(nèi)源性成分，匯總所得成分信息。正離子模式準(zhǔn)分子離子[M+H]+、[M+Na]+，負(fù)離子模式準(zhǔn)分子離子[M-H]-、[M+HCOO]-，以實(shí)測值和理論值誤差＜5 ppm 為成分結(jié)構(gòu)指認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)，通過二級質(zhì)譜結(jié)構(gòu)解析、Chmicalbook 數(shù)據(jù)庫（https：//www.chemicalbook.com）、PubChem 數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）、TCMSP 數(shù)據(jù)庫及相關(guān)文獻(xiàn)分析各成分的結(jié)構(gòu)信息并進(jìn)行成分歸屬，同時(shí)基于串聯(lián)質(zhì)譜和結(jié)構(gòu)預(yù)測軟件CFM-ID 4.0 進(jìn)行二級質(zhì)譜預(yù)測，基于母離子簇和碎片離子簇的相似性，確定母離子與其產(chǎn)生的碎片離子的對應(yīng)關(guān)系。以指認(rèn)所得補(bǔ)陽還五湯凍干粉所含成分為基準(zhǔn)，結(jié)合保留時(shí)間和二級質(zhì)譜圖，最終確認(rèn)缺血性腦卒中大鼠的補(bǔ)陽還五湯入血、入腦成分。

3 結(jié)果

3.1 UPLC-Q-TOF-MS 總離子流圖補(bǔ)陽還五湯凍干粉供試品、空白血清、含藥血清、空白腦組織和含藥腦組織的正、負(fù)離子模式總離子流圖見圖2。正離子模式下的各樣品峰數(shù)目明顯多于負(fù)離子模式，各樣品在同一離子模式下具有相似的質(zhì)譜特征，主要色譜峰的保留時(shí)間基本一致。

圖2 正、負(fù)離子模式下各樣品的總離子流圖Figure 2 Total ion chromatogram for each sample in positive and negative ion mode

3.2 補(bǔ)陽還五湯入血、入腦成分分析通過化合物一、二級質(zhì)譜信息與數(shù)據(jù)庫檢索及文獻(xiàn)查閱，聯(lián)合CFM-ID 4.0 軟件進(jìn)行二級碎片預(yù)測，結(jié)果共指認(rèn)出89 種化學(xué)成分，見表1、表2。其中表1 顯示，正離子模式下共計(jì)29 種入血成分、19 種入腦成分；表2顯示，負(fù)離子模式下共計(jì)15種入血成分、5種入腦成分。通過韋恩圖分析（見圖3）表明，正離子模式下共有11 種成分同時(shí)入血、入腦；負(fù)離子模式下共有5 種成分同時(shí)入血、入腦。

表1 正離子模式下補(bǔ)陽還五湯入血、入腦成分指認(rèn)結(jié)果匯總表Table 1 Summary of blood and brain absorption components identification in the positive ion mode of Buyang Huanwu Decoction

表2 負(fù)離子模式下補(bǔ)陽還五湯入血、入腦成分指認(rèn)結(jié)果匯總表Table 2 Summary of blood and brain absorption components identification in the negative ion mode of Buyang Huanwu Decoction

圖3 補(bǔ)陽還五湯正、負(fù)離子模式下入血、入腦成分的韋恩圖Figure 3 Venn diagram of blood and brain absorption components in the positive and negative ion mode of Buyang Huanwu Decoction

3.3 補(bǔ)陽還五湯入血、入腦成分的鑒定流程示例以毛蕊異黃酮為例，其保留時(shí)間tR=6.39 min，負(fù)離子模式下準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-m/z283.06，二級質(zhì)譜圖主要碎片離子m/z為211.04、239.03、268.03。根據(jù)質(zhì)譜裂解一般規(guī)律推斷，[M-H]-m/z283.06可通過低能量脫掉一個(gè)-CH3基團(tuán)得碎片離子m/z268.03；斷裂-C2H4O基團(tuán)得碎片離子m/z239.03；[M-H]-在高能量狀態(tài)下脫掉-C3H4O基團(tuán)得碎片離子m/z211.04，裂解途徑見圖4。經(jīng)CFM-ID 4.0 軟件預(yù)測所得碎片信息與質(zhì)譜檢測所得以上特征碎片離子信息高度吻合（見圖5），同時(shí)也與文獻(xiàn)報(bào)道的裂解碎片基本一致[7]，可認(rèn)定該成分為毛蕊異黃酮。

圖4 毛蕊異黃酮質(zhì)譜裂解途徑Figure 4 Mass spectrum decomposition pathway of calycosin

圖5 毛蕊異黃酮的實(shí)驗(yàn)所得碎裂二級質(zhì)譜圖與理論推測二級質(zhì)譜圖Figure 5 Experimental and computational secondary mass spectrogram of calycosin

以二氫獼猴桃內(nèi)酯為例，其保留時(shí)間tR=6.69 min，負(fù)離子模式下檢測到準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-m/z179.06，主要二級碎片離子為m/z97.03、135.02、151.05。根據(jù)化合物質(zhì)譜裂解一般規(guī)律推斷，m/z179.06可通過低能量斷裂-C2H5基團(tuán)得到碎片離子m/z151.05；碎片離子m/z97.03和m/z135.02是m/z179.06在高能量狀態(tài)下分別脫掉了-C6H8基團(tuán)和-C3H9基團(tuán)所得，準(zhǔn)分子離子可能的裂解方式見圖6。實(shí)驗(yàn)所得碎裂二級質(zhì)譜圖特征碎片離子與理論推測二級質(zhì)譜圖碎片離子信息高度吻合（見圖7），進(jìn)而認(rèn)定該成分為二氫獼猴桃內(nèi)酯。

圖6 二氫獼猴桃內(nèi)酯質(zhì)譜裂解途徑Figure 6 Mass spectrum decomposition pathway of dihydroactinidiolide

圖7 二氫獼猴桃內(nèi)酯實(shí)驗(yàn)所得碎裂二級質(zhì)譜圖與理論推測二級質(zhì)譜圖Figure 7 Experimental and computational secondary mass spectrogram of dihydroactinidiolide

4 討論

本研究基于血清藥物化學(xué)方法，以補(bǔ)陽還五湯凍干粉所含化學(xué)成分為基準(zhǔn)，采用UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)分析了補(bǔ)陽還五湯干預(yù)缺血性腦卒中大鼠后的血、腦移行成分，結(jié)果共指認(rèn)出芒柄花素、毛蕊異黃酮、黃芪甲苷、芍藥新苷等89 個(gè)化學(xué)成分，其中包括黃芪甲苷、毛蕊異黃酮苷等44 個(gè)入血成分，毛蕊異黃酮、洋川芎內(nèi)酯A 等24 個(gè)入腦成分，以及黃芪甲苷、藁本內(nèi)酯、毛蕊異黃酮、芍藥新苷、二氫獼猴桃內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯I 等16 種同時(shí)入血入腦成分，可能是補(bǔ)陽還五湯干預(yù)缺血性腦卒中大鼠的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

補(bǔ)陽還五湯中重用黃芪，黃芪甲苷、毛蕊異黃酮等為黃芪入血、入腦的特征性藥效成分。研究表明，黃芪甲苷能顯著減輕腦缺血再灌注損傷大鼠的神經(jīng)功能缺損及NLRP3 炎癥小體引發(fā)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡[8]；毛蕊異黃酮可改善腦缺血再灌注大鼠的神經(jīng)功能障礙，并具有劑量依賴性[9]。作為當(dāng)歸、川芎的特征性入血入腦成分，藁本內(nèi)酯可通過增強(qiáng)線粒體自噬發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)活性[10]。芍藥新苷來源于赤芍，可作用于多個(gè)受體活性位點(diǎn)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，從而抗腦缺血損傷[11]。紅花中含有的二氫獼猴桃內(nèi)酯可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞抗氧化和凋亡相關(guān)基因，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[12]。川芎所含的洋川芎內(nèi)酯K、洋川芎內(nèi)酯F、洋川芎內(nèi)酯I等成分可能通過抑制炎癥發(fā)揮抗腦缺血作用[13]。因此推測，既可入血又可入腦的化學(xué)成分普遍與補(bǔ)陽還五湯的抗腦缺血作用機(jī)理密切相關(guān)，可針對該類成分結(jié)合抗腦缺血作用機(jī)制進(jìn)行深入研究。

本研究指認(rèn)得到毛蕊異黃酮苷、阿魏酸、槲皮素、枯茗醛等44 種入血成分。血清藥理學(xué)研究[14]表明，毛蕊異黃酮苷可吸收入血，且在機(jī)體腦缺血后的血管再生中發(fā)揮關(guān)鍵作用。阿魏酸作為黃芪、川芎、當(dāng)歸、紅花的共有成分，其可通過促進(jìn)血管新生發(fā)揮對缺血性中風(fēng)等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的神經(jīng)保護(hù)作用，還可調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣水平及特定蛋白的表達(dá)，發(fā)揮抗氧化、抗炎和抗凋亡等作用，對腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元及整個(gè)神經(jīng)血管單元具有潛在保護(hù)作用[15]。黃芪、紅花所含的槲皮素也可入血發(fā)揮抗腦缺血作用，其可通過抗氧化作用保護(hù)腦缺血再灌注導(dǎo)致的神經(jīng)損傷[16]。當(dāng)歸中含有的入血成分枯茗醛可調(diào)節(jié)中風(fēng)等神經(jīng)退行性疾病的α-突觸核蛋白（α-SN）纖維化過程，具有潛在的治療作用[17]。復(fù)方入血成分研究既可揭示復(fù)方的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，也可為血清藥理學(xué)的體外研究提供科學(xué)依據(jù)。

另外，本研究指認(rèn)出β-谷甾醇、羽扇豆醇等8種入腦成分，但并未在血清中同步檢測到。通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究[18]表明，具有抗氧化、抗炎作用的β-谷甾醇可能是治療腦缺血的潛在核心活性成分。β-谷甾醇可通過血腦屏障到達(dá)中樞神經(jīng)系統(tǒng)，從而發(fā)揮抗炎作用[19]。黃芪、紅花中含有的羽扇豆醇可改善大鼠腦缺血再灌注引起的氧化應(yīng)激損傷，并減輕炎性反應(yīng)[20]。上述成分未能同步在血清中檢測到，可能是由于其快速吸收入血，并先一步被組織代謝；其次，僅在腦中檢測到的成分推測其可能具有腦靶向作用，可通過血腦屏障直達(dá)病灶部位發(fā)揮藥效。因此，上述成分可作為補(bǔ)陽還五湯到達(dá)腦部發(fā)揮抗腦缺血作用的重點(diǎn)研究對象。

本研究針對缺血性腦卒中病理狀態(tài)下的含藥血清及腦組織，以空白大鼠為對照，扣除本底背景，分析了與缺血性腦卒中病理進(jìn)程密切相關(guān)的活性成分，部分活性成分可吸收入血進(jìn)而穿越血腦屏障到達(dá)腦損傷部位，從而發(fā)揮抗腦缺血作用。所指認(rèn)的活性成分可作為潛在的補(bǔ)陽還五湯藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，與補(bǔ)陽還五湯的抗腦缺血機(jī)制密切相關(guān)。由于藥物通常作用在病理狀態(tài)下，在缺血性腦卒中病理狀態(tài)下的血液流變學(xué)、血腦屏障等生理生化指標(biāo)均與正常狀態(tài)下存在差異，有可能導(dǎo)致正常和病理狀態(tài)下補(bǔ)陽還五湯體內(nèi)移行成分的種類、含量存在差異。因此，研究病理狀態(tài)下的入血、入腦成分更有意義，后續(xù)研究將對正常和模型動(dòng)物給藥后入血、入腦成分進(jìn)行差異性分析和含量比對，為補(bǔ)陽還五湯的臨床合理應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。本研究的成分鑒別主要依據(jù)其一、二級質(zhì)譜特征，根據(jù)質(zhì)譜斷裂的一般規(guī)律和斷裂的合理性，參照文獻(xiàn)及相關(guān)數(shù)據(jù)庫，并采用CFM-ID 4.0 軟件對成分質(zhì)譜碎片信息進(jìn)行預(yù)測和對比分析。后續(xù)研究中將采用標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行對照分析，根據(jù)其質(zhì)譜碎片的一致性對成分進(jìn)行最終鑒定。

綜上所述，本研究采用UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)和CFM.ID 4.0軟件預(yù)測分析和指認(rèn)了補(bǔ)陽還五湯干預(yù)缺血性腦卒中大鼠的入血、入腦成分，指認(rèn)了黃芪甲苷、槲皮素、毛蕊異黃酮、阿魏酸等一系列藥效物質(zhì)成分，可能通過促進(jìn)血管恢復(fù)、血流暢通，以及抗炎、抗凋亡作用，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)活性。所得成分可視為補(bǔ)陽還五湯神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)的潛在藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，有助于揭示補(bǔ)陽還五湯治療缺血性腦卒中的作用機(jī)制，可為補(bǔ)陽還五湯的合理應(yīng)用和深度開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。