清燥救肺湯調(diào)控AMPK 通路誘導Lewis 荷瘤小鼠肺癌細胞自噬體膜及溶酶體形成的機制探討

張汗順，余功，鄭鴻翔，謝斌（江西中醫(yī)藥大學，江西 南昌 330004）

肺癌死亡率居惡性腫瘤首位[1]，盡管采取手術治療、放化療等多種綜合治療手段，其5年生存率也僅為20%左右[2]。中醫(yī)藥在肺癌治療中具有獨特優(yōu)勢[3]，可減輕放化療副反應并增強其療效，調(diào)節(jié)機體免疫力，促進術后恢復，改善患者生存質(zhì)量，延長生存期。清燥救肺湯出自清代名醫(yī)喻嘉言的《醫(yī)門法律》，常用于肺癌的臨床治療。研究表明，清燥救肺湯能抑制中晚期非小細胞肺癌化療患者的腫瘤標志物和細胞因子表達，并改善其生存期、生活質(zhì)量及生存率[4]；清燥救肺湯還能夠升高肺癌放射性肺損傷患者的氧分壓，降低C 反應蛋白（CRP）、轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）水平，改善其肺功能，降低肺損傷[5-6]。

本課題組前期研究[7]表明，清燥救肺湯可顯著抑制Lewis 肺癌細胞增殖，可能與抑制細胞色素C 氧化酶亞單位Ⅳ（COX Ⅳ）蛋白表達，降低三磷酸腺苷（ATP）生成，繼而升高一磷酸腺苷（AMP）/ATP 比值有關。ATP 生成減少，相對AMP 增多，升高AMP/ATP 比值能夠激活能量感受器腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK），可誘導自噬的發(fā)生[8]。進一步研究[9]發(fā)現(xiàn)，清燥救肺湯能有效促進Lewis荷瘤小鼠肺癌細胞自噬溶酶體生成，其誘導自噬啟動機制是通過激活AMPK，直接磷酸化UNC-51 樣激酶1（ULK1）蛋白，從而誘導肺癌細胞自噬啟動。本研究擬進一步結合AMPK抑制劑觀察清燥救肺湯對肺癌細胞自噬體膜及溶酶體形成相關蛋白表達的影響。

1 材料

1.1 動物及瘤株SPF級雄性C57BL/6J小鼠50只，體質(zhì)量（20±2）g，購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（魯）2019-0003，動物質(zhì)量合格證號：1107261911004575。小鼠Lewis 肺癌細胞，購自美國菌種保藏中心（ATCC）細胞庫，編號：36470TM。本實驗經(jīng)江西中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會審批，批準文號：JZLLSC20210014。

1.2 藥物清燥救肺湯處方：枇杷葉9 g、黨參12 g、生石膏12 g、霜桑葉9 g、炙阿膠9 g、苦杏仁9 g、麥冬10 g、甘草3 g，上述藥物均購自江西省中醫(yī)院，由江西中醫(yī)藥大學國家工程中心馮育林教授鑒定均為正品。按照前期研究[9]方法制備成清燥救肺湯干粉。陽性對照藥物為環(huán)磷酰胺（CTX），江蘇恒瑞醫(yī)藥公司，批號：9L351A。

1.3 試劑Compound C（AMPK抑制劑）、羧甲基纖維素鈉（CMC-Na），美國MCE 公司，批號：79767、66038；全蛋白抽提試劑盒、BCA 蛋白含量檢測試劑盒、預染蛋白Marker、兔抗GAPDH 抗體、羊抗兔IgG-HRP 二抗、免疫組化筆、DAPI 染色試劑盒，均購自江蘇凱基生物技術公司，批號：20210111、20210126、20210115、20210121、20210115、20210222、20200727；兔抗磷酸化自噬關鍵分子酵母ATG6同系物（p-Beclin-1）抗體，美國CST 公司，批號：1；兔抗自噬關鍵分子酵母ATG6 同系物（Beclin-1）、III 型磷脂酰肌醇3-激酶（VPS34）、自噬蛋白微管相關蛋白輕鏈3B（LC3B）抗體，英國Abcam 公司，批號：GR319837、GR155536-1、GR321382；兔抗磷酸化III 型磷脂酰肌醇3-激酶（p-VPS34）抗體，美國Invitrogen 公司，批號：33591A03；兔抗P62 抗體，武漢三鷹生物技術公司，批號：00082587；ULtrapur-RNA Kit 超純RNA 提取試劑盒、HIFIScript cDNA 第一鏈合成試劑盒、UltraSYBR Mixyture 實時熒光定量PCR 預混體系，北京康為世紀生物公司，批號：34920、36320、35320。

1.4 主要儀器Power Supplies Basic 電泳儀、Trans-Blot Turbo 全能型蛋白轉(zhuǎn)印系統(tǒng)，美國Bio-Rad 公司；G：BOXChemiXR5 型凝膠成像系統(tǒng)，英國SYNGENE 公司；SpectraMaxM3 型多功能酶標儀，美國MD公司；UV752型紫外可見分光光度計，上海佑科儀器公司；XW-80A 型LongGeneRNA 逆轉(zhuǎn)錄儀，上海青浦滬西儀器廠；AFD9600 型熒光定量PCR儀，杭州安杰思醫(yī)學科技公司；BX43 型生物正置顯微鏡、VS200 型數(shù)字病理切片掃描儀，日本Olympus公司。

2 方法

2.1 模型復制Lewis 肺癌細胞用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)環(huán)境為37 ℃、5% CO2。取生長狀態(tài)良好的Lewis 肺癌細胞，以每只1×106個的濃度無菌接種于小鼠右腋皮下[9]。

2.2 分組及給藥將50只小鼠隨機分為模型組、CTX組、清燥救肺湯組、AMPK 抑制劑組、清燥救肺湯+AMPK 抑制劑組，每組10 只。清燥救肺湯組和清燥救肺湯+AMPK 抑制劑組需造模前14 d 開始灌胃清燥救肺湯（11 g·kg-1·d-1），其余各組小鼠正常飼養(yǎng)，清燥救肺湯給藥劑量依據(jù)前期研究[9]結果設定。各組小鼠造模24 h后，模型組以等體積生理鹽水灌胃；CTX組以50 mg·kg-1CTX 隔日腹腔注射1 次，共7 次；AMPK 抑制劑組和清燥救肺湯+AMPK 抑制劑組均腹腔注射Compound C（10 mg·kg-1·d-1）；清燥救肺湯組、清燥救肺湯+AMPK 抑制劑組繼續(xù)按照設定劑量灌胃給藥；各組小鼠給藥時間均為14 d。

2.3 Western Blot 法檢測肺癌組織自噬體膜形成相關蛋白的表達水平取50 mg腫瘤組織，加入蛋白裂解液，冰上勻漿；離心后取上清，采用BCA 法測定總蛋白濃度。SDS-PAGE 電泳分離蛋白后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用5%脫脂奶粉封閉總蛋白，5% BSA 封閉磷酸化蛋白；加入一抗p-Beclin-1（1∶1 000）、p-VPS34（1∶1 000）、Beclin-1（1∶2 000）、VPS34（1∶6 000）、GAPDH（1∶6 000），4 ℃下孵育過夜； 洗膜后加入二抗（1∶8 000），室溫下孵育2 h；顯影并掃描。采用ImageJ 圖像分析軟件分析蛋白條帶灰度值，以GAPDH為內(nèi)參，對目的蛋白進行半定量分析。

2.4 RT-qPCR 法檢測肺癌組織中自噬相關蛋白9A（ATG9A）、乙酰輔酶A 合成酶2（ACSS2）、轉(zhuǎn)錄因子增強子3（TFE3）mRNA 的表達水平取50 mg腫瘤組織，加入1 mL TRIzon試劑提取總RNA；檢測各樣本RNA含量和純度。采用第一鏈cDNA合成試劑盒將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，逆轉(zhuǎn)錄反應條件：42 ℃、15 min，85 ℃、5 min。每個樣本取1 μg cDNA，用UltraSYBR Mixyture 試劑盒配制成50 μL 反應體系，PCR 反應條件：95 ℃、10 s 預變性，95 ℃、5 s 變性，60 ℃、15 s 退火，2 ℃、30 s 延伸，共40 個循環(huán)。熔解曲線程序：95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，95 ℃、15 s。通過擴增曲線和熔解曲線確定引物的特異性；以GAPDH 為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計算目的基因的相對表達水平。引物由深圳華大基因科技有限公司合成，引物序列見表1。

2.5 免疫熒光雙重染色法檢測肺癌組織中LC3B、P62 蛋白表達情況取適量冰凍肺癌組織，制成厚度約4～5 μm 切片，浸入1%丙酮固定液；每張切片滴加2 滴3% H2O2-甲醇溶液滅活酶；用1% BSA 50～100 μL 封閉后，滴加50～100 μL 一抗（1∶100）；滴加50～100 μL FITC/TRITC（1∶200）二抗；每張切片滴加50～100 μL DAPI 染液后，用防淬滅封片膠封片；采用數(shù)字病理切片掃描儀掃片，分析紅色熒光（LC3B）和綠色熒光（P62）的表達強度（IOD/Area），進行半定量分析。

2.6 統(tǒng)計學處理方法采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析；計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示；多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩兩比較采用LSD檢驗；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 清燥救肺湯對Lewis 荷瘤小鼠肺癌組織中Beclin-1、p-Beclin-1 蛋白表達的影響結果見圖1。與模型組比較，清燥救肺湯組和CTX 組小鼠肺癌組織中Beclin-1、p-Beclin-1蛋白表達水平及p-Beclin-1/Beclin-1 比值顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）。與清燥救肺湯組比較，清燥救肺湯+AMPK 抑制劑組小鼠肺癌組織中p-Beclin-1 蛋白表達水平及p-Beclin-1/Beclin-1 比值顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。與AMPK 抑制劑組比較，清燥救肺湯+AMPK 抑制劑組小鼠肺癌組織中Beclin-1、p-Beclin-1 蛋白表達水平顯著升高（P＜0.01）。

圖1 清燥救肺湯對Lewis 荷瘤小鼠肺癌組織中Beclin-1、p-Beclin-1 蛋白表達的影響（±s，n=3）Figure 1 Effects of Qingzao Jiufei Decoction on the protein expressions of Beclin-1 and p-Beclin-1 in lung cancer tissues of Lewis tumor-bearing mice（±s，n=3）

3.2 清燥救肺湯對Lewis 荷瘤小鼠肺癌組織中VPS34、p-VPS34 蛋白表達的影響結果見圖2。與模型組比較，清燥救肺湯組和CTX 組小鼠肺癌組織中VPS34、p-VPS34 蛋白表達水平及p-VPS34/VPS34比值均顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）。與清燥救肺湯組比較，清燥救肺湯+AMPK 抑制劑組小鼠肺癌組織中VPS34、p-VPS34 蛋白表達水平及p-VPS34/VPS34比值均顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。與AMPK 抑制劑組比較，清燥救肺湯+AMPK 抑制劑組小鼠肺癌組織中VPS34、p-VPS34 蛋白表達水平及p-VPS34/VPS34比值均顯著升高（P＜0.01）。

圖2 清燥救肺湯對Lewis 荷瘤小鼠肺癌組織中VPS34、p-VPS34 蛋白表達的影響（±s，n=3）Figure 2 Effects of Qingzao Jiufei Decoction on the protein expressions of VPS34 and p-VPS34 in lung cancer tissues of Lewis tumorbearing mice（±s，n=3）

3.3 清燥救肺湯對Lewis 荷瘤小鼠肺癌組織中ATG9A、ACSS2、TFE3 mRNA 表達的影響結果見圖3。與模型組比較，清燥救肺湯組和CTX組小鼠肺癌組織中ATG9A、ACSS2 mRNA 表達水平顯著升高（P＜0.05，P＜0.01），TFE3 mRNA 表達水平顯著降低（P＜0.01）。與清燥救肺湯組比較，清燥救肺湯+AMPK 抑制劑組小鼠肺癌組織中ATG9A、ACSS2 mRNA 表達水平顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），TFE3 mRNA 表達水平顯著上升（P＜0.01）。與AMPK抑制劑組比較，清燥救肺湯+AMPK 抑制劑組小鼠肺癌組織中ATG9A、ACSS2 mRNA 表達水平顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）。

圖3 清燥救肺湯對Lewis 荷瘤小鼠肺癌組織中ATG9A、ACSS2、TFE3 mRNA 表達的影響（±s，n=3）Figure 3 Effects of Qingzao Jiufei Decoction on the mRNA expressions of ATG9A，ACSS2 and TFE3 in lung cancer tissues of Lewis tumor-bearing mice（±s，n=3）

3.4 清燥救肺湯對Lewis 荷瘤小鼠肺癌組織中LC3B、P62 蛋白表達的影響結果見圖4。與模型組比較，清燥救肺湯組和CTX 組小鼠肺癌組織中LC3B 蛋白熒光強度表達水平顯著升高（P＜0.01），P62 蛋白熒光強度表達水平顯著降低（P＜0.01）。與清燥救肺湯組比較，清燥救肺湯+AMPK 抑制劑組小鼠肺癌組織中LC3B蛋白熒光強度表達水平顯著降低（P＜0.01），P62 蛋白熒光強度表達水平明顯升高（P＜0.05）。

圖4 清燥救肺湯對Lewis 荷瘤小鼠肺癌組織中LC3B、P62 蛋白表達的影響（免疫熒光，×200；±s，n=3）Figure 4 Effects of Qingzao Jiufei Decoction on the protein expressions of LC3B and P62 in lung cancer tissues of Lewis tumor-bearing mice（IF，×200；±s，n=3）

4 討論

肺癌屬于中醫(yī)學“肺痿”的范疇，燥熱傷肺是其重要病機[10]。清燥救肺湯具有清燥潤肺、益氣養(yǎng)陰的功效，方中霜桑葉為君，與臣藥生石膏配伍，清泄肺熱；佐以麥冬、人參和阿膠補氣養(yǎng)陰，杏仁、枇杷葉宣肺止咳；炙甘草調(diào)和諸藥為使。諸藥合用，體現(xiàn)了方劑“宣、清、潤、降”四法并施，補瀉并用的特點，主治溫燥傷肺證，與肺癌放化療后的燥熱病機相符。臨床上清燥救肺湯聯(lián)合化療藥物治療非小細胞型肺癌，能有效改善其臨床咳嗽等癥狀，提高患者免疫力[11]。

通過對清燥救肺湯抗肺癌機制的深入研究發(fā)現(xiàn)，其能降低肺癌細胞內(nèi)核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）、細胞間黏附分子1（ICAM-1）的表達，減少肺癌細胞的增殖遷移[12]；能通過降低糖酵解能量代謝途徑的關鍵限速酶的活性，抑制能量代謝途徑，減少腫瘤細胞生成，發(fā)揮抗癌功效[13]；還能抑制肺癌磷酸戊糖能量代謝途徑的關鍵酶活性，并影響其調(diào)控因子，抑制肺癌細胞增殖[14]；通過抑制轉(zhuǎn)化生長因子的過度表達，實現(xiàn)延緩肺癌發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移的目的[15]。上述基礎實驗證實，清燥救肺湯發(fā)揮抗肺癌作用機制與其“清熱潤燥”功效相契合，通過抑制能量代謝限速酶活性，減少ATP的生成，達到“清熱”之功效。

本課題組在前期研究[9]中發(fā)現(xiàn)，清燥救肺湯能升高肺癌細胞自噬啟動相關蛋白AMPK、ULK1 蛋白磷酸化，降低哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）磷酸化表達；加入AMPK 抑制劑后，AMPK、ULK1 蛋白磷酸化水平明顯降低，mTOR 蛋白磷酸化無明顯變化，表明清燥救肺湯可能是通過激活AMPK、直接磷酸化ULK1來誘導肺癌細胞自噬。結合清燥救肺湯抗肺癌其他相關實驗研究表明，其能顯著抑制肺癌細胞氧化磷酸化[7]、糖酵解[14]、磷酸戊糖途徑代謝限速酶活性[15]等多靶點發(fā)揮抗肺癌作用。因此，阻止癌細胞利用糖原脂類核苷酸等原料獲取能量，既能誘導癌細胞自噬促進其降解，又能抑制其對降解產(chǎn)物的利用，可能是清燥救肺湯發(fā)揮抗肺癌作用的機制。

自噬是細胞內(nèi)一種進化上高度保守的代謝途徑，通過溶酶體將一些錯誤折疊的蛋白及衰老損傷的細胞器進行降解。自噬發(fā)生時，首先在細胞質(zhì)中會形成一種雙層膜包裹的囊泡結構即自噬體，然后自噬體與溶酶體發(fā)生融合，形成自噬溶酶體[16]。其中，自噬體膜的形成、延伸以及溶酶體生成是自噬形成過程中的關鍵步驟。

近年來大量研究[17]表明，在細胞處于低能量水平時，ATP 生成減少，相應AMP/ATP 比值升高，腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）激活，抑制mTOR 活性，通過mTOR 依賴途徑調(diào)節(jié)自噬的發(fā)生，并可通過ULK1的磷酸化直接調(diào)節(jié)自噬。其中AMPK信號通路自噬核心組分ATG9A、VPS34和Beclin-1蛋白表達升高，促進自噬體膜形成及延伸[18-19]。VPS34、Beclin-1 蛋白通過募集大量ATG 蛋白定位于自噬小體，協(xié)助膜和脂質(zhì)體構形改變從而誘導自噬小體生成[20]。ATG9A是一種跨膜蛋白，表達升高能有效促進自噬體延伸的囊泡參與自噬體生物合成，AMPK同樣也可特異性磷酸化ATG9A來影響自噬活性[21]。

溶酶體生成關鍵因子ACSS2可通過乙酰輔酶A的形成和隨后的蛋白質(zhì)乙?；姆绞秸{(diào)節(jié)自噬，當細胞內(nèi)缺乏能量時，AMPK介導的ACSS2在絲氨酸殘基S659處磷酸化，隨后核定位的ACSS2與轉(zhuǎn)錄因子EB（Transcription factor EB，TFEB）結合，并移位至溶酶體和自噬基因啟動子區(qū)域，結合組蛋白乙?；苻D(zhuǎn)產(chǎn)生的乙酸酯，在這些區(qū)域局部產(chǎn)生乙酰輔酶A，從而促進溶酶體形成[22]。TFE3 能上調(diào)多個自噬發(fā)生相關基因的轉(zhuǎn)錄水平，可能的基因包括ATG5、ATG16L和LC3等，進而促進溶酶體的合成，TFE3過表達時細胞的自噬水平也顯著升高，同樣細胞的自噬水平會隨TFE3表達下調(diào)而降低[23]。

LC3B 為哺乳動物自噬發(fā)生的標志蛋白，有LC3B-I、LC3B-Ⅱ兩種存在形式，LC3B-Ⅱ蛋白定位于自噬小體內(nèi)外膜上，識別P62蛋白標記的待降解底物，統(tǒng)一運送到自噬溶酶體中降解[24]。LC3B-Ⅱ蛋白表達上調(diào)，同時P62蛋白表達下調(diào)，表示自噬活性上升，反之則自噬活性受到抑制。

本實驗結果顯示，清燥救肺湯加入AMPK抑制劑后，VPS34、p-VPS34、p-Beclin-1 蛋白表達水平降低，ATG9A、ACSS2 mRNA 表達下調(diào)，TFE3 mRNA表達上調(diào)，LC3B 蛋白熒光強度表達水平降低，P62蛋白熒光強度表達水平升高。結合前期清燥救肺湯誘導自噬啟動機制研究[9]結果表明，清燥救肺湯誘導肺癌細胞自噬溶酶體生成的機制可能是通過激活AMPK，磷酸化自噬啟動子ULK1，進一步激活Beclin-1與VPS34復合體，募集ATG蛋白質(zhì)到自噬體組裝位點，上調(diào)ATG9A mRNA 表達，繼而促進脂質(zhì)轉(zhuǎn)運，將自噬體延伸所需要的膜結構轉(zhuǎn)運至自噬囊泡，促進LC3B-I 向LC3B-Ⅱ蛋白轉(zhuǎn)化，下調(diào)P62 蛋白表達，促進自噬小體生成，同時促進ACSS2 mRNA 表達水平升高，降低TFE3 mRNA 表達水平，從而誘導肺癌細胞自噬小體與溶酶體融合，生成自噬溶酶體，誘導肺癌細胞自噬。

綜上所述，清燥救肺湯誘導肺癌細胞自噬體膜及溶酶體形成的機制可能是通過激活Beclin-1、VPS34蛋白，上調(diào)ATG9A、ACSS2 mRNA 表達，抑制TFE3 mRNA表達實現(xiàn)的。