連翹苷經(jīng)miR-545-3p/SLC7A11 途徑誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞鐵死亡

李紹霄，李邦亮（.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬平陽醫(yī)院耳鼻喉科，浙江 溫州 35400；.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬瑞安醫(yī)院耳鼻喉科，浙江 溫州 3599）

鼻咽癌是一種好發(fā)于中國南部省份、東南亞國家和北非地區(qū)的惡性腫瘤，近20%的鼻咽癌患者在確診時出現(xiàn)遠(yuǎn)處臟器轉(zhuǎn)移[1]?；熓潜茄拾┑闹匾委熓侄?，但鼻咽癌患者對化療藥物多存在一定的毒性反應(yīng)和耐藥現(xiàn)象[2]。研究[3-4]表明，中醫(yī)藥成分在鼻咽癌臨床治療過程中具有毒副作用小和療效明確等優(yōu)勢，能有效增強(qiáng)化療藥物作用效果，同時減輕不良反應(yīng)。

連翹苷作為中藥連翹中的標(biāo)識性成分，具有抗菌、抗免疫、抗炎和降糖等多種生物學(xué)功效[5-6]。研究[7]表明連翹苷可通過抑制Nrf2通路抑制宮頸癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，從而增強(qiáng)紫杉醇的化療效果，但連翹苷對鼻咽癌生長的抑制作用及其可能作用機(jī)制尚未見諸報道。鐵死亡是一種不同于凋亡和自噬的新型細(xì)胞程序性死亡，其特征性表現(xiàn)為活性氧（ROS）的積累和鐵載體蛋白-轉(zhuǎn)鐵蛋白的形成[8]，鐵死亡對癌細(xì)胞的增殖非常重要，最終激發(fā)惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移潛能[9]。本研究擬觀察連翹苷對鼻咽癌細(xì)胞生長和鐵死亡的作用，以期進(jìn)一步探明連翹苷的抗腫瘤機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞人鼻咽正常上皮細(xì)胞系NP69、鼻咽癌細(xì)胞系HNE1，美國ATCC公司。

1.2 動物雄性無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級BALB/c裸鼠10只，7周齡，體質(zhì)量18～20 g，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。動物質(zhì)量合格證號：202011179；動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2020-1-003；動物批次號：202007013。飼養(yǎng)于溫州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心SPF條件下，實驗動物使用許可證號：SYXK（浙）2021-0017，恒溫（25±3）℃，濕度60%，光暗循環(huán)12 h/12 h，自由進(jìn)食飲水。動物實驗通過溫州醫(yī)科大學(xué)附屬平陽醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)，編號： 20210024。

1.3 藥物及試劑連翹苷，南京森貝伽生物科技有限公司，純度≥98%，批號：110821；CCK-8 試劑盒、DMEM 培養(yǎng)基、DCFH-DA 熒光探針，大連美侖生物生物科技有限公司，批號分別為：MA0218-2、MB4682-1、PWL045；MDA 試劑盒，北京普利萊科技有限公司，批號：BC0020；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒，日本TaKaRa 公司，批號分別為：EE047A、RR820A；BCA 蛋白濃度測定試劑盒，上海碧云天生物科技有限公司，批號：P0012S；SLC7A11 抗體、β-actin 抗體，美國Abcam 公司，批號分別為：ab37185、ab125066；miR-545-3p mimics及其陰性對照mimics NC，上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司合成；SLC7A11 過表達(dá)載體（SLC7A11 OE）及其陰性載體（OE NC），上海漢恒生物科技有限公司合成；LipofectamineTM2000，美國Gibco公司，批號：11668；熒光素酶報告基因檢測試劑盒，上海金畔生物科技有限公司，批號：12518。

1.4 儀器ELX808 酶標(biāo)儀，美國Bio-Tek 公司；X73倒置熒光顯微鏡，日本奧林巴斯光學(xué)有限公司；Q1000 PCR 儀，杭州朗基科學(xué)儀器公司；B5060EK CO2 細(xì)胞培養(yǎng)箱，德國Hearers 公司；JY92-2D 超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，美國Bio-Tek生物儀器有限公司。

1.5 CCK-8 實驗96孔板中每孔加入2×104個HNE1細(xì)胞，待細(xì)胞過夜貼壁后，將HNE1細(xì)胞分為空白組（不加細(xì)胞，只加培養(yǎng)基）、對照組（含HNE1 細(xì)胞及連翹苷溶劑）和不同濃度連翹苷組（含HNE1 細(xì)胞及0、0.625、1.25、2.5、5、10、20 μmol·L-1連翹苷）。給藥處理后，將96孔板放置CO2培養(yǎng)箱孵育24 h，隨后每孔添加10 μL CCK-8 試劑，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育30 min。采用酶標(biāo)儀檢測450 nm 處吸光值，使用GraphPad 9.0 軟件計算連翹苷的IC50值。每組設(shè)6 個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。根據(jù)實驗結(jié)果，選擇連翹苷低濃度（1/2 倍IC50值）、中濃度（1 倍IC50值）和高濃度（2 倍IC50值）作為后續(xù)實驗濃度。

1.6 克隆形成實驗將HNE1 細(xì)胞按每孔1 000 個接種于6 孔板中，待細(xì)胞過夜貼壁后，將HNE1 細(xì)胞按分為對照組（連翹苷溶劑）和不同濃度（4、8、16 μmol·L-1）連翹苷組，藥物處理24 h后使用PBS洗滌3次，置于CO2培養(yǎng)箱孵育10 d，再用1%結(jié)晶紫染色20 min，顯微鏡下觀察細(xì)胞克隆數(shù)量。每組設(shè)6個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

1.7 細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）分析將HNE1細(xì)胞按每孔1×105個接種于6 孔板中，待細(xì)胞過夜貼壁后，將HNE1 細(xì)胞分為對照組（連翹苷溶劑）和不同濃度（4、8、16 μmol·L-1）連翹苷組。藥物處理24 h 后，每孔添加200 μL DCFH-DA 試劑，室溫避光反應(yīng)1 h，在熒光顯微鏡下觀察并拍攝照片，以ImageJ 軟件分析。每組設(shè)6個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

1.8 細(xì)胞內(nèi)MDA 含量檢測96 孔板中每孔加入2×104個HNE1 細(xì)胞，待細(xì)胞過夜貼壁后，將HNE1 細(xì)胞分為對照組（連翹苷溶劑）和不同濃度（4、8、16 μmol·L-1）連翹苷組。藥物處理24 h 后，用PBS洗滌3 次，加細(xì)胞裂解液反應(yīng)后，在0.1 mL 細(xì)胞裂解液中加入0.2 mL MDA 試劑，在4 ℃條件中反應(yīng)20 min。以10 000×g離心10 min 后取上清液，采用酶標(biāo)儀檢測532 nm 處的吸光值。每組設(shè)6 個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

1.9 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組用完全培養(yǎng)基制成HNE1細(xì)胞懸液并調(diào)整濃度為5×106個·mL-1，將細(xì)胞懸液接種至6孔板中，每孔100 μL。每組設(shè)3個復(fù)孔，實驗重復(fù)3 次。根據(jù)LipofectamineTM2000 試劑盒說明書進(jìn)行操作，分別將miR-545-3p mimics、mimics NC、SLC7A11 OE、OE NC 轉(zhuǎn)染到HNE1 細(xì)胞，無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12 h 后在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)，確定轉(zhuǎn)染效率后再進(jìn)行細(xì)胞體外實驗。

1.10 蛋白質(zhì)印跡（Western Blot）法檢測采用細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞蛋白，總蛋白經(jīng)勻漿、離心、變性等操作后，采用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，脫脂奶粉進(jìn)行封閉操作。整體實驗環(huán)境為4 ℃，維持12 h，硝酸纖維素膜分別經(jīng)過一抗（體積稀釋比例均為1∶1 000）和二抗（體積稀釋比例均為1∶5 000）的孵育后，利用顯影定影試劑盒完成最后的顯色和曝光操作，以ImageJ軟件分析。

1.11 RT-qPCR 法檢測miR-545-3p 的表達(dá)在轉(zhuǎn)染后的HNE1 細(xì)胞中用Trizol 試劑提取細(xì)胞總RNA，RNA 濃度由超微量分光光度計檢測，逆轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR 過程嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。設(shè)置U6 作為內(nèi)參，通過2-△△Ct法計算miR-545-3p 的相對表達(dá)量。實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.12 熒光素酶報告基因檢測將重組熒光素酶報告載體mut-psiCHECK-SLC7A11-3'UTR 或wt-psiCHECKSLC7A11-3'UTR 共轉(zhuǎn)染至HNE1 細(xì)胞中；再分別將miR-545-3p mimics 或mimics NC 轉(zhuǎn)染至HNE1 細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染48 h 后收獲細(xì)胞。按試劑盒說明書提供的方法對樣品熒光素酶活性進(jìn)行檢測。

1.13 建立鼻咽癌異種移植瘤模型將0.1 mL HNE1細(xì)胞（2×107個·mL-1）注射到雄性BALB/c 裸鼠的腋部皮下組織。當(dāng)瘤發(fā)展到大約100 mm3時，將裸鼠隨機(jī)分為對照組和連翹苷組，每組5 只。連翹苷組每隔2 d 經(jīng)腹腔注射10 mg·kg-1連翹苷溶液0.1 mL，對照組經(jīng)腹腔注射等量生理鹽水。在給藥后第0、2、4、6、8 、10、12和14天測量荷瘤裸鼠的體質(zhì)量和腫瘤體積。第14 天頸椎脫臼法處死裸鼠，測量腫瘤質(zhì)量，然后收集腫瘤組織用于后續(xù)的實驗。

1.14 免疫組化法檢測鼻咽癌異種移植瘤組織中Ki-67和SLC7A11 的表達(dá)樣品用5%甲醛固定過夜，采用梯度乙醇脫水法將腫瘤組織脫水后包埋在石蠟中切片。采用SP染色法進(jìn)行免疫組化染色，Ki-67的陽性表達(dá)少數(shù)位于細(xì)胞質(zhì)中，大部分的陽性表達(dá)位于細(xì)胞核中；SLC7A11 的陽性表達(dá)大部分位于細(xì)胞質(zhì)中。隨機(jī)選擇20 個視野并在低倍鏡下拍照，采用Image-Pro Plus 6.0圖像處理軟件分析Ki-67和SLC7A11在樣本中的積分光密度（IOD）值。

1.15 統(tǒng)計學(xué)處理方法用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，計量資料結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用LSD 單因素方差檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 連翹苷對HNE1 細(xì)胞生長的影響見圖1。將連翹苷（0.625、1.25、2.5、5、10、20 μmol·L-1）作用于NP69 細(xì)胞和HNE1 細(xì)胞24 h 后，較低濃度連翹苷（0.625、1.25、2.5 μmol·L-1）對NP69細(xì)胞的生長無明顯抑制作用，高濃度連翹苷（5、10、20 μmol·L-1）對NP69 細(xì)胞的生長有明顯抑制作用（P＜0.05，P＜0.001）；連翹苷呈濃度依賴性抑制HNE1 細(xì)胞生長（P＜0.001），其IC50值為8.4 μmol·L-1，故選擇4（1/2倍IC50值）、8（1倍IC50值）和16 μmol·L-1（2 倍IC50值）作為連翹苷低、中、高3 個劑量進(jìn)行后續(xù)實驗。

圖1 連翹苷對NP69 細(xì)胞和HNE1 細(xì)胞生長的影響（±s，n=3）Figure 1 Effect of phillyrin on the growth of NP69 cells and HNE1 cells（±s，n=3）

2.2 連翹苷對鼻咽癌HNE1 細(xì)胞增殖的影響如圖2所示，連翹苷（4、8、16 μmol·L-1）作用后，鼻咽癌HNE1 細(xì)胞克隆形成數(shù)分別為（118.6±12.8）、（84.7±6.9）和（45.1±3.4）個，與對照組（259.6±32.4）個比較，連翹苷可明顯抑制鼻咽癌HNE1細(xì)胞增殖（P＜0.001）。

圖2 連翹苷對HNE1 細(xì)胞增殖的影響（±s，n=3）Figure 2 Effect of phillyrin on the proliferation of HNE1 cell s（±s，n=3）

2.3 連翹苷對鼻咽癌HNE1 細(xì)胞ROS、MDA 含量的影響見圖3，在熒光顯微鏡下觀察DCFH-DA 熒光探針檢測結(jié)果。連翹苷（4、8、16 μmol·L-1）作用后，鼻咽癌HNE1細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，與對照組比較，連翹苷呈劑量依賴性提高鼻咽癌細(xì)胞ROS水平（P＜0.001）。

如圖4 所示，連翹苷（4、8、16 μmol·L-1）處理后，鼻咽癌HNE1 細(xì)胞中的相對MDA 水平分別為（1.41±0.13）、（1.56±0.14）和（1.79±0.21），與對照組（1.00±0.08）比較，連翹苷可明顯提高鼻咽癌HNE1細(xì)胞的MDA水平（P＜0.05，P＜0.001）。

圖4 連翹苷對HNE1 細(xì)胞丙二醛（MDA）產(chǎn)生的影響（±s，n=3）Figure 4 Effect of phillyrin on the MDA production of HNE1 cells（±s，n=3）

以上結(jié)果表明，連翹苷可有效促進(jìn)體外鼻咽癌細(xì)胞鐵死亡。

2.4 連翹苷對鼻咽癌HNE1 細(xì)胞鐵死亡相關(guān)SLC7A11 蛋白和miR-545-3p 基因表達(dá)的影響Western Blot 結(jié)果表明（圖5-A），連翹苷（4、8、16 μmol·L-1）作用后，鼻咽癌HNE1 細(xì)胞中鐵死亡相關(guān)蛋白SLC7A11 的水平降低（P＜0.001）。RT-qPCR檢測結(jié)果（圖5-B）顯示，連翹苷（4、8、16 μmol·L-1）處理鼻咽癌HNE1 細(xì)胞后，miR-545-3p 的表達(dá)水平明顯升高（P＜0.001）。

圖5 連翹苷對HNE1 細(xì)胞中SLC7A11（A）和miR-545-3p（B）表達(dá)的影響（±s，n=3）Figure 5 Effect of phillyrin on the expressions of SLC7A11（A）and miR-545-3p（B）in HNE1 cells（±s，n=3）

2.5 驗證miR-545-3p 的直接靶基因為SLC7A11通過檢索miRBase 數(shù)據(jù)庫獲得has-miR-545-3p 序列，并通過生物信息學(xué)工具TargetScan 對miR-545-3p 靶基因進(jìn)行預(yù)測。如圖6 所示，SLC7A11 基因與has-miR-545-3p 存在潛在的結(jié)合位點，為此，我們進(jìn)一步應(yīng)用熒光素酶報告檢測系統(tǒng)驗證miR-545-3p對體外HNE1細(xì)胞中SLC7A11的調(diào)控作用。

圖6 生物信息學(xué)工具預(yù)測miR-545-3p 的靶基因Figure 6 The target gene of miR-545-3p predicted by bioinformatics tool

熒光素酶報告實驗結(jié)果如圖7 所示，與共轉(zhuǎn)染wt-psiCHECK-SLC7A11-3'UTR和mimics NC后HNE1細(xì)胞熒光素酶活性比較，共轉(zhuǎn)染wt-psiCHECKSLC7A11-3'UTR 和miR-545-3p mimics 后HNE1 細(xì)胞的熒光素酶活性值明顯降低（P＜0.001）；而共轉(zhuǎn)染mut-psiCHECK-SLC7A11-3'UTR 和miR-545-3p mimics 后細(xì)胞熒光素酶活性值與共轉(zhuǎn)染mutpsiCHECK-SLC7A11-3'UTR和mimics NC后的細(xì)胞熒光素酶活性值比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

圖7 熒光素酶報告實驗驗證miR-545-3p 的靶基因（±s，n=3）Figure 7 The target gene of miR-545-3p verified by luliferase report detection system（±s，n=3）

如圖8 所示，miR-545-3p mimics 轉(zhuǎn)染HNE1 細(xì)胞后，miR-545-3p mimics 組HNE1 細(xì)胞中SLC7A11的表達(dá)明顯低于mimics NC組（P＜0.001）。

圖8 Western Blot 法檢測轉(zhuǎn)染miR-545-3p mimics 或mimics NC 后對鼻咽癌細(xì)胞中SLC7A11 蛋白表達(dá)的影響（±s，n=3）Figure 8 Detection the effect of the transfection of miR-545-3p mimics or mimics NC on the expression of SLC7A11 protein in HNE1 cells by Western Blot（±s，n=3）

以上結(jié)果表明，miR-545-3p可與SLC7A11的3'-UTR 結(jié)合，SLC7A11 是miR-545-3p 的直接靶向基因。

2.6 SLC7A11 的外源性過表達(dá)可降低連翹苷對鼻咽癌細(xì)胞活力、增殖和鐵死亡的作用用8 μmol·L-1連翹苷處理轉(zhuǎn)染SLC7A11 OE 或OE NC 的HNE1細(xì)胞，結(jié)果表明，與OE NC+8 μmol·L-1連翹苷組比較，SLC7A11 OE+8 μmol·L-1連翹苷組HNE1 細(xì)胞中SLC7A11 相對蛋白表達(dá)水平（圖9-A）、細(xì)胞增殖（圖9-B）和細(xì)胞活力（圖9-C）均明顯升高（P＜0.001），ROS 熒光強(qiáng)度（圖9-D）和MDA水平（圖9-E）均明顯降低（P＜0.05，P＜0.01）。上述結(jié)果進(jìn)一步證實了連翹苷通過降低SLC7A11來調(diào)控鼻咽癌HNE1細(xì)胞增殖和鐵死亡。

圖9 過表達(dá)SLC7A11 聯(lián)合連翹苷對鼻咽癌細(xì)胞活力、增殖和鐵死亡的作用（±s，n=3）Figure 9 Effects of expressions of SLC7A11 combined with phillyrin on the viability,proliferation and ferroptosis of HNE1 cells（±s，n=3）

2.7 連翹苷對鼻咽癌異種移植瘤生長的影響給藥前，對照組和連翹苷組裸鼠體質(zhì)量分別為（19.5±3.2）、（20.4±2.1）g，兩組數(shù)據(jù)的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。實驗結(jié)束時，對照組和連翹苷組裸鼠體質(zhì)量分別為（18.7±3.3）、（19.1±2.6）g，兩組數(shù)據(jù)的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。實驗結(jié)束時，對照組和連翹苷組鼻咽癌異種移植瘤平均質(zhì)量分別為（0.68±0.13）、（0.25±0.03）g，兩組數(shù)據(jù)的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見圖10-A。以上結(jié)果表明，本實驗劑量的連翹苷對實驗動物無明顯毒副作用，但可有效抑制體內(nèi)鼻咽癌生長。

圖10 連翹苷對鼻咽癌異種移植瘤生長的影響（±s，n=3）Figure 10 Effect of phillyrin on the growth of nasopharyngeal carcinoma xenografts（±s，n=3）

免疫組化結(jié)果顯示，對照組和連翹苷組腫瘤組織中Ki-67 的IOD 值分別為（245.6±29.4）和（105.8±7.6），兩組數(shù)據(jù)的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）。SLC7A11在對照組和連翹苷組腫瘤組織中的IOD值分別為（348.6±38.7）和（145.2±12.8），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），見圖10-B。結(jié)果表明，本實驗劑量的連翹苷可有效抑制鼻咽癌增殖，同時抑制SLC7A11在體內(nèi)鼻咽癌中的表達(dá)。

3 討論

以往研究[10]表明，連翹苷對前列腺癌具有抑制細(xì)胞增殖、拮抗細(xì)胞轉(zhuǎn)移和誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的作用，但連翹苷對鼻咽癌的抑制作用暫未見報道。為此，本研究首先使用依次增高濃度的連翹苷分別作用于體外鼻咽癌HNE1 和鼻咽正常導(dǎo)管NP69 細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)較低濃度（0.625～2.5 μmol·L-1）的連翹苷對體外NP69 細(xì)胞生長無明顯抑制作用，但HNE1細(xì)胞對連翹苷的生長抑制效應(yīng)較敏感，0.625 μmol·L-1的連翹苷即可有效抑制體外HNE1 細(xì)胞生長，同時連翹苷（4、8、16 μmol·L-1）對體外HNE1 細(xì)胞鐵死亡具有明顯誘導(dǎo)作用。另外在體內(nèi)實驗中，較低劑量（10 mg·kg-1）的連翹苷對實驗動物無明顯毒副作用，且對鼻咽癌異種移植瘤生長具有明顯抑制效應(yīng)。本文全面報道了連翹苷在低劑量下對體內(nèi)外正常細(xì)胞無明顯毒副作用，且可通過促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞鐵死亡，進(jìn)而發(fā)揮抑制體內(nèi)外鼻咽癌細(xì)胞生長的效果。

脂質(zhì)過氧化和鐵積累產(chǎn)生的大量ROS 是鐵死亡的首要特征性改變。腫瘤細(xì)胞易受到ROS 的損傷，高氧化應(yīng)激是抗腫瘤藥物的常見抗癌機(jī)制。腫瘤細(xì)胞中的二價鐵可以激活和催化腫瘤藥物分子氧橋的裂解，產(chǎn)生大量高度烷基化的碳中心自由基和活性氧，活性氧等活性中間體可以破壞腫瘤細(xì)胞DNA[8-9]。連翹苷的抗腫瘤作用機(jī)制與氧化應(yīng)激反應(yīng)有一定聯(lián)系。雙氧水是一種常見的氧化劑，可以增強(qiáng)連翹苷的抗腫瘤作用[11]。N-叔丁基-α-苯基硝酮（PBN）和維生素E是氧自由基清除劑，均可降低連翹苷的抗腫瘤活性[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，連翹苷可以誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞脂質(zhì)過氧化和ROS 生產(chǎn)，從而表明誘導(dǎo)細(xì)胞鐵死亡可能是連翹苷抑制鼻咽癌細(xì)胞生長的主要作用方式。SLC7A11 是鐵死亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，可以調(diào)節(jié)細(xì)胞中谷胱甘肽的生物合成[13]；SLC7A11在鼻咽癌細(xì)胞中的表達(dá)較正常細(xì)胞明顯升高，在鼻咽癌細(xì)胞中沉默SLC7A11 的表達(dá)可提高癌細(xì)胞對化療藥物的敏感性[14]。本研究結(jié)果表明，連翹苷可濃度依賴性抑制鼻咽癌細(xì)胞中SLC7A11 的表達(dá)水平，提示連翹苷可能通過抑制SLC7A11 的表達(dá)從而抑制鼻咽癌細(xì)胞生長和促進(jìn)細(xì)胞鐵死亡過程?？紤]到連翹苷不能完全抑制SLC7A11 的表達(dá)，連翹苷聯(lián)合其他藥物是否具有更好的抗腫瘤作用有待下一步實驗證實。

先前的研究[15-16]表明，miR-545-3p在鼻咽癌等多種惡性腫瘤細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，并且作為重要的獨立預(yù)后標(biāo)志物。因此，我們猜想miR-545-3p可能參與鼻咽癌細(xì)胞的鐵死亡過程。本研究結(jié)果支持了這一假設(shè)，連翹苷可明顯促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞中miR-545-3p的表達(dá)。然而，miR-545-3p與SLC7A11之間的相互作用尚未見研究。在我們的研究中，上調(diào)miR-545-3p可下調(diào)SLC7A11 蛋白在體外鼻咽癌細(xì)胞中的表達(dá)；此外，熒光素酶報告實驗進(jìn)一步表明miR-545-3p直接靶向SLC7A11 的3'-UTR；最后本研究通過挽救實驗證實，過表達(dá)SLC7A11 可部分逆轉(zhuǎn)連翹苷對鼻咽癌HNE1細(xì)胞生長和鐵死亡過程的調(diào)節(jié)作用。這些結(jié)果表明，連翹苷可能主要通過miR-545-3p/SLC7A11通路從而抑制鼻咽癌細(xì)胞生長和促進(jìn)細(xì)胞鐵死亡過程。

總之，連翹苷可明顯抑制體內(nèi)外鼻咽癌細(xì)胞生長，并有效促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞鐵死亡，miR-545-3p/SLC7A11信號通路可能是其主要的作用機(jī)制。