博落回提取物對肉牛瘤胃體外發(fā)酵、甲烷產(chǎn)量和微生物區(qū)系的影響

曾 澤,張華琦,*,桂干北,圣 平

(1.銅仁職業(yè)技術(shù)學院 國家民委中獸藥重點開放實驗室,貴州 銅仁 554300;2.江西省科學院 生物資源研究所,江西 南昌 330096)

近100多年以來,由于溫室氣體的排放,導致全球氣候變暖。全球氣候變暖不僅是人類面臨的最嚴峻的全球環(huán)境問題,也是制約社會經(jīng)濟發(fā)展乃至人類生存的重要問題。而甲烷是主要的溫室氣體之一,其溫室效應是二氧化碳的25倍[1]。全球50%～60%的甲烷排放來自于農(nóng)業(yè)生產(chǎn),而其中絕大部分甲烷氣體來源于反芻動物生產(chǎn)。反芻動物在瘤胃發(fā)酵過程中會產(chǎn)生大量甲烷,有2%～15%的飼料能以甲烷的形式被損失掉[2-3]。所以,反芻動物瘤胃發(fā)酵所產(chǎn)生的甲烷,不但造成飼料能量損失,還會造成溫室效應。因此,抑制瘤胃甲烷的產(chǎn)生對提高飼料能量利用率和減輕溫室效應具有重要作用。

近年來,抗生素類添加劑的應用受到各國政策法規(guī)的限制,尋求抗生素的替代品成為了國內(nèi)外學者越來越關注的研究方向[4]。中草藥提取物被認為是替代抗生素降低瘤胃甲烷排放的可行辦法,相比其它添加劑,中草藥提取物還具有無毒、無耐藥性以及無殘留等特點,可以確保動物產(chǎn)品的安全性[5]。但目前可以作為飼料添加劑用于降低瘤胃甲烷生成的中草藥提取物并不是很多。博落回是罌粟科博落回屬植物,含有血根堿、白屈菜紅堿、原阿片堿等生物堿,具有殺菌、殺蟲、消炎、抗病毒和抗腫瘤等作用,且不易產(chǎn)生耐藥性,是較為理想的抗生素替代藥[6-7]。研究表明,博落回提取物可作為豬、牛、家禽和魚等畜禽的飼料添加劑,不但能預防治療畜禽呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)疾病,還能促進畜禽的生長[8-11]。博落回提取物在湖羊瘤胃體外發(fā)酵試驗中能夠降低甲烷生成,瘤胃的發(fā)酵模式由乙酸型向丙酸型轉(zhuǎn)變[12],但是對瘤胃微生物區(qū)系的影響沒有作進一步研究。本研究利用體外瘤胃發(fā)酵技術(shù),通過研究和分析博落回提取物對肉牛瘤胃體外發(fā)酵中甲烷產(chǎn)量、氨態(tài)氮(NH3-N)、揮發(fā)性脂肪酸(VFA)等發(fā)酵參數(shù)以及瘤胃微生物區(qū)系的影響,為開發(fā)安全、穩(wěn)定和多功能的降甲烷調(diào)控劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗所用的博落回提取物為固體粉末,購買于湖南美可達生物資源有限公司,其中血根堿含量40%,白屈菜紅堿含量20%。

1.2 試驗動物及飼養(yǎng)管理

選取3只體況良好,體重(250±15)kg,安裝有永久性瘤胃瘺管的錦江黃牛作為瘤胃液供體動物。肉牛飼喂該場全混和日糧(主要成分為黑麥草、玉米、麥麩、豆粕等,精粗比為60∶40),每日09:00和17:00 2次等量飼喂,試驗前驅(qū)蟲,自由飲水、采食。

1.3 人工瘤胃液的配制

晨飼前抽取3頭瘺管肉牛的瘤胃液混合均勻,置于預熱過的保溫杯中密封帶回實驗室,在39 ℃水浴環(huán)境中經(jīng)四層紗布過濾備用。人工唾液配置參考Menke等[13]的方法,持續(xù)通入CO2,直至溶液顏色變?yōu)闊o色。以1∶2的比例充分混勻過濾后的瘤胃液和人工唾液作為人工瘤胃液,將人工瘤胃液置于39 ℃水浴鍋中,持續(xù)通入CO2以保持厭氧環(huán)境待用。

1.4 體外發(fā)酵底物

底物經(jīng)65 ℃烘干48 h,充分研磨過1 mm篩,發(fā)酵底物精料和黑麥草按精粗比為50∶50組成。發(fā)酵底物組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 發(fā)酵底物組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎)Table 1 Composition and nutrient levels of fermentation substrate (DM basis)

1.5 試驗設計

準確稱取500 mg的發(fā)酵底物置于150 mL產(chǎn)氣瓶中。試驗采用完全隨機試驗設計,分為對照組(不添加博落回提取物)和試驗組(按0.11%底物干物質(zhì)基礎添加博落回提取物)。在產(chǎn)氣瓶中迅速加入預熱的人工瘤胃液60 mL,向瓶中通入CO25 s后,立即蓋上瓶塞,將產(chǎn)氣瓶放置于恒溫搖床中,100 r/min 39 ℃培養(yǎng)12 h和24 h。每個處理組設置5個重復,試驗重復3次,同時設置空白對照組(不添加發(fā)酵底物和博落回提取物,只添加人工瘤胃液)。

1.6 樣品采集和測定分析

1.6.1 發(fā)酵液樣品采集與處理 分別于發(fā)酵3 h、6 h、9 h、12 h和24 h時測定產(chǎn)氣量,然后采集氣體樣本用于甲烷測定。分別于培養(yǎng)12 h和24 h后將產(chǎn)氣瓶取出放入冰水浴中終止發(fā)酵,將產(chǎn)氣瓶中的發(fā)酵液取出,放入已知質(zhì)量的50 mL塑料離心管中,立即用pH計測定發(fā)酵液的pH。取2 mL發(fā)酵液用于微生物區(qū)系測定。將發(fā)酵液5000×g離心10 min,取上清液用于NH3-N、微生物蛋白(MCP)和VFA的測定,離心之后的固相殘渣用于干物質(zhì)降解率的測定。

1.6.2 產(chǎn)氣量測定 參照Romero-Pérez等[14]的方法,用壓力傳感器測定產(chǎn)氣瓶內(nèi)的壓力值,結(jié)合產(chǎn)氣瓶容積換算出產(chǎn)氣瓶中的實際產(chǎn)氣量。產(chǎn)氣量計算公式如下:

GP為產(chǎn)氣瓶的實際產(chǎn)氣量(mL); P為實際測出的壓力值(kpa);V1為產(chǎn)氣瓶的容積(mL);V2為加入發(fā)酵液的容積(mL);W為底物干物質(zhì)質(zhì)量(g)。

1.6.3 甲烷產(chǎn)量測定 參考Menke等[13]的氣相色譜法條件測定甲烷含量。色譜條件:載氣為高純氮氣,燃氣為高純氫氣,空氣為助燃氣,柱溫70 ℃,前進樣口溫度50 ℃,后進樣口溫度375 ℃,FID檢測器溫度200 ℃,空氣流速360 mL/min,氫氣流速45 mL/min,氮氣流速25 mL/min。

1.6.4 NH3-N濃度測定 發(fā)酵液中NH3-N濃度采用馮宗慈等[15]改進的比色法進行測定。采用標準系列溶液制作標準曲線,得到回歸方程式,再用酶標儀檢測待測樣本700 nm吸光值,即可根據(jù)回歸方程式計算樣品中的NH3-N濃度。

1.6.5 MCP濃度測定 發(fā)酵液中MCP濃度采用楊德蓮等[16]的方法進行測定。取經(jīng)離心預處理去除原蟲和飼料大顆粒的上清液1 mL,16000×g離心20 min,棄去上清液,沉淀的細菌部分加0.9 mL的10%三氯乙酸溶液,混勻,4000 r/min離心10 min,取沉淀物加5%氫氧化鈉溶解,然后稀釋至2.5 mL。4000 r/min離心10 min,用紫外分光光度計測定上清液280 nm和260 nm吸光值。應用下面公式即可計算細菌蛋白含量。蛋白質(zhì)含量(mg/mL)=(1.45×D280 nm-0.74×D260 nm)。

1.6.6 VFA含量測定 發(fā)酵液中VFA含量采用王加啟[17]的方法用氣相色譜進行測定。取發(fā)酵液1 mL于1.5 mL離心管中,4 ℃ 13000×g離心10 min。上清液轉(zhuǎn)移至加有20 μL 85%正磷酸的1.5 mL離心管中,充分混勻,4 ℃ 13000×g離心10 min。上清液過0.22 μm水系濾膜,打入氣相上樣瓶自動進樣至氣相色譜儀的火焰離子化檢測器進樣口進行測定。

1.6.7 微生物區(qū)系測定 發(fā)酵液中微生物相對豐度采用Illumina NovaSeq 測序進行分析。提取樣本DNA,分別采用細菌16S rDNA擴增引物進行PCR擴增,對PCR擴增產(chǎn)物進行純化,構(gòu)建文庫,Illumina NovaSeq 測序,對測序得到的下機數(shù)據(jù)進行拼接和質(zhì)控,進行嵌合體過濾,得到有效數(shù)據(jù)并進行分析。

1.7 統(tǒng)計分析

采用Excel 2016進行數(shù)據(jù)的初步統(tǒng)計處理,使用SPSS 16.0軟件對數(shù)據(jù)進行獨立樣本T檢驗分析,并以P<0.05為差異顯著性判斷的標準。

2 結(jié)果與分析

2.1 對瘤胃體外發(fā)酵產(chǎn)氣量和甲烷產(chǎn)量的影響

由表2可知,發(fā)酵3 h、6 h、9 h和12 h時,博落回提取物添加組的產(chǎn)氣量顯著低于對照組(P<0.05);發(fā)酵24 h時,相比對照組,博落回提取物添加組的產(chǎn)氣量有下降的趨勢,但無差異顯著性(P>0.05)。發(fā)酵3 h、6 h、9 h和12 h時,博落回提取物添加組的甲烷產(chǎn)量顯著低于對照組(P<0.05);發(fā)酵24 h時,博落回提取物添加組的甲烷產(chǎn)量顯著高于對照組(P<0.05)。

表2 博落回提取物對瘤胃體外發(fā)酵產(chǎn)氣量和甲烷產(chǎn)量的影響Table 2 Effects of M. cordata extract on gas and methane emission in rumen fermentation in vitro

2.2 對pH、NH3-N、MCP、干物質(zhì)降解率、中性洗滌纖維和酸性性洗滌纖維的影響

由表3可知,發(fā)酵12 h和24 h時,相比對照組,博落回提取物添加組的pH、干物質(zhì)降解率、中性洗滌纖維和酸性性洗滌纖維無明顯變化(P>0.05)。發(fā)酵12 h和24 h時,博落回提取物添加組發(fā)酵液中NH3-N濃度顯著低于對照組(P<0.05)。發(fā)酵12 h時,博落回提取物添加組發(fā)酵液中MCP濃度顯著低于對照組(P<0.05),但發(fā)酵24 h時,相比對照組,博落回提取物添加組發(fā)酵液中MCP濃度無明顯變化(P>0.05)。

表3 博落回提取物對發(fā)酵液pH及干物質(zhì)降解率、NH3-N、MCP、中性洗滌纖維和酸性性洗滌纖維含量的影響Table 3 Effects of M. cordata extract on pH, dry matter degradation rate, NH3-N, MCP,Neutral detergent fiber, and acidic detergent fiber content of fermentation fluid

2.3 對VFA的影響

由表4可知,發(fā)酵12 h時,相比對照組,博落回提取物添加組的丁酸含量和乙酸/丙酸比值無明顯變化(P>0.05),但總揮發(fā)性脂肪酸(TVFA)、乙酸和丙酸含量顯著降低(P<0.05)。發(fā)酵24 h時,相比對照組,博落回提取物添加組的TVFA、乙酸、丙酸、丁酸含量和乙酸/丙酸比值均無明顯變化(P>0.05)。相對發(fā)酵12 h時,對照組和博落回提取物添加組發(fā)酵24 h時TVFA、乙酸、丙酸、丁酸含量和乙酸/丙酸比值均升高。

表4 博落回提取物對發(fā)酵液VFA濃度的影響Table 4 Effects of M. cordata extract on VFA concentration of fermentation fluid

2.4 對瘤胃微生物區(qū)系的影響

由表5可知,對照組和博落回提取物處理組的瘤胃發(fā)酵液中,厚壁菌門和擬桿菌門占主導地位。與對照組相比,發(fā)酵12 h后,博落回提取物處理組的擬桿菌門相對豐度顯著升高(P<0.05),疣微菌門相對豐度在數(shù)值上略有升高,但無差異顯著性(P>0.05),黏膠球形菌門相對豐度顯著降低(P<0.05),厚壁菌門、軟壁菌門、變形桿菌門、Kiritimatiellaeota、浮霉菌門和放線菌門相對豐度在數(shù)值上略有降低,但無差異顯著性(P>0.05);發(fā)酵24 h后,博落回提取物處理組的厚壁菌門、疣微菌門、浮霉菌門和放線菌門相對豐度在數(shù)值上略有升高,但無差異顯著性(P>0.05),擬桿菌門、軟壁菌門、變形桿菌門、Kiritimatiellaeota和黏膠球形菌門相對豐度在數(shù)值上略有降低,但無差異顯著性(P>0.05)。

由表6可知,對照組和博落回提取物處理組的瘤胃發(fā)酵液中假丁酸弧菌屬、毛螺菌屬、琥珀酸菌屬和疣微菌屬占主導地位。發(fā)酵12 h后,與對照組相比,博落回提取物處理組的毛螺菌屬和支原體屬相對豐度顯著降低(P<0.05),假丁酸弧菌屬、琥珀酸菌屬和甲烷細菌屬相對豐度在數(shù)值上略有降低,但無差異顯著性(P>0.05),疣微菌屬相對豐度在數(shù)值上略有升高,但無差異顯著性(P>0.05);發(fā)酵24 h后,與對照組相比,博落回提取物處理組的假丁酸弧菌屬、毛螺菌屬、疣微菌屬和甲烷細菌屬相對豐度在數(shù)值上略有升高,但無差異顯著性(P>0.05),琥珀酸菌屬和支原體屬相對豐度在數(shù)值上略有降低,但無差異顯著性(P>0.05)。

3 討 論

3.1 對體外瘤胃發(fā)酵產(chǎn)氣量和甲烷產(chǎn)量的影響

反芻動物瘤胃內(nèi)含有豐富的瘤胃微生物,瘤胃微生物在發(fā)酵飼料的過程中會產(chǎn)生大量的氣體。在瘤胃體外發(fā)酵試驗中,產(chǎn)氣量能夠反映發(fā)酵底物的可發(fā)酵程度和瘤胃微生物的活動趨勢,即可作為瘤胃體外發(fā)酵試驗中評定瘤胃微生物發(fā)酵和發(fā)酵底物可利用性的指標之一[18]。在瘤胃體外發(fā)酵中,產(chǎn)氣量與日糧中有機物的消化率呈正相關[13]。研究表明,富含生物堿的提取物可以作為一種潛在的飼料添加劑以降低瘤胃發(fā)酵的產(chǎn)氣量[19]。在本研究中,添加博落回提取物之后,發(fā)酵3 h、6 h、9 h和12 h時的產(chǎn)氣量均顯著低于對照組,但發(fā)酵24 h時,產(chǎn)氣量無差異顯著性變化,這表明博落回提取物對瘤胃微生物發(fā)酵有一定抑制作用,但隨著時間的延長,抑制作用會慢慢消失。之前研究結(jié)果表明,在湖羊瘤胃體外發(fā)酵研究中,博落回提取物能夠降低產(chǎn)氣量[12],與本研究的實驗結(jié)果一致。

反芻動物瘤胃在發(fā)酵的過程中會產(chǎn)生大量甲烷氣體,這不但會浪費飼糧能,還會加速全球溫室效應,因此降低瘤胃發(fā)酵甲烷的排放對減少飼料能的浪費和減少環(huán)境污染均有重要作用。研究表明,富含生物堿的提取物可以減少瘤胃發(fā)酵甲烷的產(chǎn)量[6,20-21]。在湖羊瘤胃體外發(fā)酵研究中,博落回提取物能夠顯著降低甲烷的產(chǎn)量[12]。在本研究中,添加博落回提取物發(fā)酵3 h、6 h、9 h和12 h后,甲烷產(chǎn)量均顯著降低,但是發(fā)酵24 h后,甲烷產(chǎn)量卻增加了,這可能是由于博落回提取物對產(chǎn)甲烷菌的抑制作用在12 h后緩慢消失,產(chǎn)甲烷菌迅速增長,這才導致24 h時甲烷產(chǎn)量增加;微生物測序結(jié)果表明,發(fā)酵12 h后產(chǎn)甲烷菌相對豐度有降低的趨勢,發(fā)酵24 h后產(chǎn)甲烷菌相對豐度有升高的趨勢,但均無差異顯著性。本研究中博落回提取物的添加能夠降低瘤胃發(fā)酵12 h后發(fā)酵液中乙酸和丙酸濃度,這也可能是發(fā)酵12 h后甲烷產(chǎn)量減少的原因之一,因為乙酸和丙酸是瘤胃發(fā)酵過程中生成甲烷的底物[22]。

3.2 對體外瘤胃發(fā)酵NH3-N和MCP的影響

NH3-N是瘤胃發(fā)酵和消化代謝過程中的重要產(chǎn)物,同時也是大多數(shù)瘤胃微生物合成MCP的原料,NH3-N濃度可以直接反映瘤胃發(fā)酵環(huán)境的好壞[23]。在本研究中,添加博落回提取物之后可以顯著降低NH3-N的濃度,這與之前的研究結(jié)果一致[12],可能是由于博落回提取物降低了一些微生物利用碳水化合物的能力,所以導致NH3-N的濃度降低。MCP是瘤胃發(fā)酵的重要指標,能夠反應瘤胃內(nèi)細菌、原蟲、真菌等微生物的數(shù)量[24]。在本研究中,添加博落回提取物可以降低發(fā)酵12 h時的MCP濃度,但是發(fā)酵24 h時的MCP濃度沒有明顯變化,這可能是由于合成MCP的原料NH3-N減少了,所以會導致發(fā)酵液中MCP含量降低,另外可能由于博落回提取物對瘤胃微生物有抑制作用,降低了微生物的繁殖速度,微生物數(shù)量減少,這才導致發(fā)酵12 h時MCP含量降低。但是,隨著時間的延長,博落回提取物對瘤胃微生物的抑制作用逐漸消失,瘤胃微生物數(shù)量逐漸增加,導致發(fā)酵24 h時MCP含量與對照組無明顯變化。

3.3 對體外瘤胃發(fā)酵VFA的影響

VFA是瘤胃微生物發(fā)酵碳水化合物的主要產(chǎn)物,其中以乙酸、丙酸和丁酸為主,約占TVFA的95%。VFA是反芻動物的主要能量來源,其含量和組成直接反映瘤胃新陳代謝活動的水平[25-26]。在本研究中,添加博落回提取物能夠降低總揮發(fā)性脂肪酸、乙酸和丙酸濃度,這與之前研究結(jié)果不一致[12],這可能是由于博落回提取物的添加劑量不一樣所致,也有可能是由于瘤胃液供體動物不一樣所致。本試驗中隨著時間的延長,VFA的濃度逐漸升高,這主要是因為體外發(fā)酵是在密閉的發(fā)酵瓶中進行的,沒有VFA的消耗和排出過程。本研究結(jié)果表明,添加博落回提取物對發(fā)酵液的pH沒有顯著的影響,pH保持在正常的pH范圍內(nèi)(6.37～7.35),這對纖維素消化、蛋白質(zhì)合成、蛋白水解活動、揮發(fā)性脂肪酸合成以及瘤胃微生物活動無不良影響[27-28]。在本研究中,添加博落回提取物對干物質(zhì)降解率沒有明顯影響,這表明該濃度的博落回提取物不影響日糧的發(fā)酵和降解。

3.4 對體外瘤胃發(fā)酵微生物區(qū)系的影響

反芻動物瘤胃內(nèi)含有數(shù)量和種類都較為豐富的微生物,瘤胃發(fā)酵的過程其實就是瘤胃微生物對飼料中纖維素和半纖維素等植物物質(zhì)進行消化的過程,瘤胃微生物通過發(fā)酵能夠?qū)暳限D(zhuǎn)化為反芻動物能夠利用的營養(yǎng)物質(zhì),瘤胃微生物的種類和相互之間的比例能夠直接影響反芻動物對飼料中營養(yǎng)物質(zhì)的消化利用[16,29-30]。在本研究中,添加博落回提取物能夠顯著升高擬桿菌門的相對豐度,顯著降低黏膠球形菌門、毛螺菌屬和支原體屬的相對豐度。添加博落回提取物發(fā)酵12 h之后,細菌的優(yōu)勢菌群由厚壁菌門改變?yōu)閿M桿菌門,且大部分細菌的相對豐度均有不同程度的降低;添加博落回提取物發(fā)酵12 h之后有降低甲烷細菌屬相對豐度的趨勢,但發(fā)酵24 h之后甲烷細菌屬相對豐度略有升高,這與本研究中甲烷產(chǎn)量先降低后升高的結(jié)果一致。同種微生物在發(fā)酵12 h和24 h時的相對豐度有一定差異,隨著時間的延長,博落回提取物對厚壁菌門、毛螺菌屬和甲烷細菌屬等微生物的抑制作用會消失,這表明博落回提取物對瘤胃微生物相對豐度的影響有時效性。

4 結(jié) 論

在本研究中,添加0.11%博落回提取物可降低產(chǎn)氣量,甲烷產(chǎn)量先降低后升高,可降低發(fā)酵液中TVFA、乙酸、丙酸、NH3-N和MCP濃度,可顯著升高擬桿菌門相對豐度,顯著降低黏膠球形菌門、毛螺菌屬和支原體屬的相對豐度,但對干物質(zhì)降解率無顯著影響,表明博落回提取物對體外瘤胃發(fā)酵有一定的調(diào)控作用。但還需進一步評估博落回提取物對反芻動物體內(nèi)瘤胃發(fā)酵的影響。