不同毛色羊駝皮膚中Agouti和PMEL基因表達與毛纖維中黑色素含量的相關(guān)性研究

劉學瑋,黃昀巍,遲志端,張俊珍*

(1. 山西農(nóng)業(yè)大學 動物科學學院,山西 太谷 030801;2. 山西農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學學院,山西 太谷 030801)

羊駝在傳統(tǒng)動物學分類上屬于哺乳綱、偶蹄目、駱駝科,是毛用型經(jīng)濟動物,羊駝毛有22種天然色。哺乳動物黑色素(真黑素和褐黑素)是由黑色素細胞產(chǎn)生的,真黑素使毛色表現(xiàn)為黑色或褐色,而褐黑素使毛色表現(xiàn)為黃色或紅色。毛色主要受遺傳因素控制[1],Agouti基因和PMEL基因都是較為重要的毛色調(diào)控基因。

研究表明,小鼠的Agouti基因位于2號染色體,結(jié)構(gòu)復(fù)雜,其表達可促進褐黑素的產(chǎn)生并抑制真黑素的產(chǎn)生[2]。真黑素和褐黑素之間的轉(zhuǎn)換通常發(fā)生于黑色素細胞,Agouti基因編碼的ASIP蛋白(Agouti Signaling Protein)為旁分泌信號因子,隨著人、鼠、狐貍、豬、綿羊等的Agouti基因被發(fā)現(xiàn),人們了解到不同物種的Agouti基因及ASIP蛋白具有較高的同源性[3]。

小鼠PMEL基因被定位在第10號染色體上[4],由11個外顯子組成并擁有神秘的重復(fù)結(jié)構(gòu)域(RPT),該結(jié)構(gòu)域由數(shù)量可變的不完全串聯(lián)重復(fù)組成,通過輔助控制淀粉樣蛋白的形成影響黑色素的合成和沉積[5]。PMEL基因?qū)Σ溉閯游锖谏氐暮铣膳c沉積有重要影響[6],可直接啟動黑色小體內(nèi)纖維的形成,促進黑素小體合成[7]。前黑素小體蛋白(premelanosome protein-17,PMEL-17)直接參與黑色素的合成,在小鼠的PMEL17基因敲除試驗中,毛纖維中的黑色素含量減少了40%～50%[8],這表明PMEL對于表皮色素沉積起著重要作用。本研究以羊駝毛纖維為研究對象,分析羊駝皮膚中Agouti與PMEL的表達與毛纖維中黑色素含量的相關(guān)性,為毛色的形成機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

白色、棕色和黑色的健康青年Huacaya型羊駝各3只(山西農(nóng)業(yè)大學羊駝養(yǎng)殖基地),用剪毛剪從毛纖維根部取10 mg,并用取皮器取直徑4 mm的皮膚組織。

TaKaRa LA TaqTM 聚合酶:DRR20AM 寶生物工程(大連)有限公司;dNTP:D4030A,寶生物工程(大連)有限公司;TaKaRa、AxyPreP DNA凝膠回收試劑盒:康寧生命科學(吳江)有限公司;瓊脂糖:Agarose I D0014-50G(Lot: GI-241100),上海生工/SABC(Lot 061180);Tris 堿(三羥甲基氨基甲烷):上海Sangon;Amresco 分裝、EDTA (Na2EDTA,乙二銨四乙酸鈉鹽):華美公司;Sigma 分裝、EB(溴化乙錠):美國Fluck;烏賊墨黑色素、Easy Pure Genomic DNA Kit、2×Es Taq Master Mix、DNA Marker、Trizol:Chanmq-mix。

ABI-2720 pcr 儀:美國 Applied Biosystems 公司;天平:上海精密科學儀器有限公司 ;Thermo EC250-90 型電泳儀:美國 Thermo 公司;紫外照相分析系統(tǒng):天能科技(上海)有限公司;ABI 3730XL 測序儀:美國 Applied Biosystems 公司;Tenbroeck組織研磨機:美國新澤西州米爾維爾惠頓;索爾瓦爾超速離心機:DuPont Instruments,Wilmington,DE,USA。

1.2 試驗方法

1.2.1 轉(zhuǎn)錄組測序與基因差異表達分析 用Trizol法提取羊駝皮膚總RNA,經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后,利用Illumina HiSeq 4000平臺對不同毛色羊駝皮膚cDNA文庫進行測序。測序長度為150 bp,過濾低質(zhì)量片段后,獲得目標片段。用RESM軟件包(版本v1.2.12)計算基因表達RPKM值,基于NOIseq對黑色、褐色、白色羊駝皮膚差異表達基因進行分析(以VicugnapacosVicPac3.2為參考),將差異總數(shù)(fold change)≥ 2和可能性(probablity)≥ 0.8的基因定義為差異表達基因。

1.2.2 黑色素含量的測定 以烏賊墨黑色素混懸液為標準,用分光光度法測定毛纖維中真黑素的含量。各30 mg毛纖維樣品清洗后,分別加入3 mL 1M NaOH(85 ℃反應(yīng)4 h)、3 mL 30%的HI(80 ℃反應(yīng)2 h)、3 mL 0.1 mol/L PBS(pH=10.5,室溫劇烈混合10 min)以分別進行堿溶性總黑色素(ASM)、真黑素(EM)和褐黑素(PM)的測定。取3 mg烏賊墨于3 mL雙蒸水中,在超聲波中溶解5 min,紫外分光光度計讀取其吸光值以做對照。用紫外分光光度分別以A350/mg、A400/mg、A400/mg分別讀取毛纖維中真黑素、褐黑素和堿溶性總黑素的吸光值,分別與烏賊墨的吸光值做對比后,獲取毛纖維中各種黑色素的含量。

1.2.3Agouti和PMEL基因表達分析 取1.2.1中獲得的羊駝皮膚總RNA 1 mg,用Chanmq-mix反轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用SYBR Green檢測系統(tǒng)和比較閾值周期(CT)法對羊駝皮膚中Agouti和PMEL的mRNA豐度進行qRT-PCR分析。所有反應(yīng)在Stratagene Mx3005P實時熒光定量PCR系統(tǒng)上進行。以18S rRNA為內(nèi)參,采用2-ΔΔCT法計算基因的相對表達量,即Agouti和PMEL mRNA的豐度與18S rRNA的豐度進行歸一化。引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 qRT-PCR primer sequence

1.2.4 統(tǒng)計分析 實時熒光定量PCR和黑色素含量用“平均值±標準差(Mean±SD)“表示,用SPSS v.21. 0 軟件(IBM, Armonk, NY, USA)分析數(shù)據(jù),采用ANOVA方差 和T檢驗進行多重比較。不同毛色羊駝毛纖維中黑色素含量與皮膚中Agouti和PMEL的基因表達量之間的相關(guān)性用Person皮爾遜相關(guān)性分析方法進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同毛色羊駝皮膚毛色基因表達譜

以已知的毛色基因為參考,通過對白色和黑色毛色羊駝皮膚的轉(zhuǎn)錄組中的差異基因進行篩選,得到23個已知差異表達的毛色相關(guān)基因,其中,PMEL、TYR、TYRP、ASIP以及TYRP2(DCT)均為差異較大的毛色調(diào)控基因(表2)。

表2 不同毛色羊駝皮膚中毛色相關(guān)的差異表達基因Table 2 Differentially expressed hair color related genes in alpaca skins

2.2 不同毛色羊駝毛纖維黑色素含量

通過對不同毛色的羊駝毛纖維中堿溶性總黑色素(ASM)、真黑素(EM)和褐黑素(PM)的含量測定,結(jié)果顯示隨著毛纖維毛色加深,毛纖維中的ASM、EM和PM的含量升高;與白色毛纖維中的黑色素相比,棕色和黑色ASM和EM的含量增加,并呈差異極顯著(P<0.01;P<0.001)(圖1A,B),而棕色和黑色毛纖維中的PM含量沒有顯著性差異(圖1C)。

圖1 不同毛色羊駝毛纖維中總黑色素(A)、真黑素(B)、褐黑素(C)含量注:*P<0.01,**P<0.05,***P<0.001,****P<0.0001,下同。Fig1. Alkali-soluble melanin content (A), eumelanin content (B) and pheomelanin content (C)in wool fibers of alpacas with different hair colorsNote: * means P<0.01,** means P<0.05, *** means P<0.001,**** means P<0.0001,the same below.

2.3 Agouti基因表達及其與黑色素的相關(guān)性

由圖2可知,Agouti(ASIP)在白色羊駝皮膚中的基因表達高于棕色皮膚和黑色皮膚,尤其是黑色皮膚,呈差異性極顯著(P<0.001)。由表3可知,不同毛色羊駝皮膚中的Agouti基因表達量與毛纖維中ASM和EM含量顯著相關(guān)(P<0.05),而與PM含量沒有顯著相關(guān)性。

圖2 不同毛色羊駝皮膚中Agouti mRNA的差異表達Fig. 2 Differential expression of Agouti mRNA in Alpaca skins with different hair colors

表3 不同毛色羊駝皮膚中Agouti的基因表達量與黑色素的相關(guān)性Table 3 Correlation of expression of Agouti mRNA in skins with different hair colors and melanin contents in hair of alpacas

2.4 PMEL基因表達及其與黑色素的相關(guān)性

由圖3可知,隨著羊駝毛纖維毛色加深,PMEL在皮膚中的基因表達量明顯增加,與白色羊駝皮膚中的基因表達量相比,PMEL在羊駝棕色皮膚和黑色皮膚的基因表達量呈差異性顯著 (P<0.05,P<0.001)。

圖3 PMEL mRNA在不同毛色羊駝皮膚中的差異表達Fig. 3 Differential expression of PMEL mRNA in Alpaca skins with different hair colors

不同毛色羊駝皮膚中PMEL的基因表達量與黑色素的相關(guān)性見表4。由表4可知,不同毛色羊駝皮膚中的PMEL基因表達量與毛纖維中ASM和EM含量顯著相關(guān)(P<0.05),而與PM含量沒有顯著相關(guān)性。

表4 不同毛色羊駝皮膚中PMEL的基因表達量與黑色素的相關(guān)性Table 4 Correlation of expression of PMEL mRNA in skins with different hair colors and melanin contents in hair of alpacas

3 討 論

哺乳動物皮膚中黑色素細胞產(chǎn)生的黑色素分為兩類,即真黑素(EM)和褐黑素(PM),黑色素的含量、分布和比例不僅決定哺乳動物的毛發(fā)、皮膚和眼睛的顏色[9-10],而且為它們的生存提供了一定的保護,其形成有著復(fù)雜的調(diào)控機制。從黑色素細胞的分化成熟,到黑色素合成及轉(zhuǎn)運到角化細胞的過程中,有許多基因、miRNAs和lncRNAs等參與[10],并影響哺乳動物的毛色[11]。常作為動物毛色調(diào)控或研究相對比較深入的候選基因主要有TYR、TYRP1、MCIR、PMEL、KITLG、Agouti等。

毛色基因Agouti、Pomc和Extension基因位點可調(diào)節(jié)真黑素(EM)和褐黑素(PM)的比例大小,它們通過黑素皮質(zhì)素受體1(MC1R)分別編碼Agouti信號蛋白(ASIP)、黑色素細胞刺激激素(MSH)和其受體[12]。ASIP使毛囊黑色素細胞合成褐黑素,且與另一種Agouti基因相關(guān)蛋白(AgRP)共同調(diào)節(jié)毛色,同時與脊椎動物皮膚毛囊中黑色素細胞刺激激素(a-MSH)競爭性地結(jié)合黑素皮質(zhì)激素受體1,導(dǎo)致環(huán)腺苷酸磷酸水平下降,進一步抑制TYR的活性,最終合成更多黑色素,進而產(chǎn)生淺色被毛[12]。即ASIP基因表達量越低,動物毛纖維顏色越深。本研究結(jié)果也證實了Agouti基因表達量與毛纖維毛色的關(guān)系,且與毛纖維中ASM和EM含量顯著相關(guān),而與PM含量無顯著關(guān)系,說明Agouti主要調(diào)控了毛纖維中的ASM和EM含量。

PMEL基因編碼前黑素體蛋白PMEL17,是一種跨膜蛋白,通過蛋白水解在黑素小體(合成和儲存黑色素的酸性細胞器)中產(chǎn)生腔內(nèi)纖維[13]而直接參與黑色素的合成,在小鼠的Pmel17基因敲除突變中顯示,毛纖維的黑色素含量減少了40%～50%;在PMEL17成熟過程中,先以前體P1的形式嵌在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的膜中,再運送到高爾基體中,通過低聚糖轉(zhuǎn)化到成熟的P2的形式,再投入黑素小體中形成纖維性基質(zhì),真黑素的含量上升[7]。同時PMEL基因在a-MSH的調(diào)控下表達量增加,進而提高了PMEL17的蛋白表達水平[14]。PMEL基因型和MCIR基因型共同影響著黑色素和褐黑色素的色素沉積。與灰色山羊皮膚中PMEL的表達高于白色山羊皮膚一樣,羊駝在黑色毛色的皮膚中的表達也高于白色和棕色毛色的皮膚,表明PMEL在紅色或黃色顯型中起重要作用[15]。在北極狐皮膚中,Agouti和PMEL的mRNA表達量顯著高于心、肝、脾、腎、肌肉組織,且在北極藍狐和北極白狐中表達量存在差異[17]。也有研究表明,Agouti基因的第一個編碼外顯子的缺失導(dǎo)致標準銀黑狐的毛色表型[18]。從羊駝選擇信號的分析來看,ASIP和PMEL分別是羊駝和美洲駝馴化信號基因,亦是正向選擇作用的候選基因[19],本試驗發(fā)現(xiàn)PMEL與ASM和EM的相關(guān)性顯著,揭示羊駝ASM和EM是深色被毛色形成的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。

此外,在毛色形成過程中,角蛋白相關(guān)蛋白27-1、KCNG1、GREB1、APOE和CNNM1也是羊駝毛色形成的重要候選基因,可是,其調(diào)控哺乳動物毛色形成過程中的功能鮮見報道,有待進一步研究。

4 結(jié) 論

在白色和黑色羊駝皮膚中存在23個已知的差異表達基因,Agouti mRNA在白色羊駝皮膚中表達較高,而PMEL mRNA在黑色羊駝皮膚中表達較高;不同毛色羊駝皮膚中Agouti與PMEL的基因表達量均與毛纖維中ASM和EM含量顯著相關(guān),揭示了Agouti與PMEL調(diào)控羊駝毛色形成的分子機制,為分子育種提供重要的理論依據(jù)。