百香果可可毛色二孢莖基腐病菌產(chǎn)孢條件研究

黃艷花 黃 強(qiáng) 覃連紅 張燕杏 崔忠吉 蒙 成*

（1廣西農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)大學(xué)，廣西南寧 530007；2廣西現(xiàn)代農(nóng)業(yè)技術(shù)展示中心，廣西南寧 530007）

百香果（Passiflora edulisSims）具有較高的營養(yǎng)價值和藥用價值[1-3]，在我國亞熱帶地區(qū)被列為重點(diǎn)開發(fā)作物之一，近年來廣西、福建和貴州等地百香果的種植面積迅速擴(kuò)大[4]?？煽擅呔↙. theobromae）是子囊菌門座囊菌綱葡萄座腔菌目葡萄座腔菌科的一種植物病原菌，病原菌引起的植物病害寄主范圍廣，可侵染茶樹[5]、獼猴桃[6]、橡膠樹[7]、春芋[8]、桉樹[9]、肉桂[10]、白木香[11]、毛葡萄[12]、南洋楹[13]、欒樹[14]、檳榔[15]、劍麻[16]等500 多種植物，致病時呈現(xiàn)葉斑、潰瘍、梢枯、枝枯、根腐、果腐、流膠、壞死等癥狀[17]，對農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)造成了重大經(jīng)濟(jì)損失。黃艷花等[18]報道了可可毛色二孢菌引起百香果莖基腐病，在高溫高濕條件下，受該病原菌為害，百香果植株可在3～7 d 失水萎蔫死亡，嚴(yán)重年份部分連作果園病株死亡率高達(dá)50%～60%[18]?？煽擅呔诔Ｒ?guī)培養(yǎng)條件下分生孢子難產(chǎn)生且周期長，而獲得病原菌大量分生孢子是開展基因功能、侵染過程、致病機(jī)理、藥劑生物測定和寄主抗病品種抗性鑒定等研究的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，因此，研究可可毛色二孢菌產(chǎn)孢適宜條件，對進(jìn)一步研究百香果莖基腐病及可可毛色二孢菌具有重大意義。

關(guān)于可可毛色二孢菌產(chǎn)孢條件的描述，薛振南等[10]認(rèn)為，在連續(xù)光照的OMA 培養(yǎng)基上，該菌產(chǎn)孢較快且較多。史國英等[13]認(rèn)為，在pH 為3～4的PSB 培養(yǎng)基上培養(yǎng)30 d 后可產(chǎn)生子座及分生孢子。迄今為止，國內(nèi)外系統(tǒng)性對可可毛色二孢菌（L. theobromae）產(chǎn)孢因素的研究尚處于空白，為獲得產(chǎn)量高的可可毛色二孢菌分生孢子，筆者以查氏培養(yǎng)基粉、燕麥瓊脂培養(yǎng)基粉、玉米粉瓊脂培養(yǎng)基粉、瓊脂粉、PCA 培養(yǎng)基為主要材料，以百香果枝條小節(jié)、百香果枝條碎粒、百香果煮枝液、甘露醇、維生素B1、維生素B2、維生素B6、維生素C 等為輔料，單因素組配32 種培養(yǎng)基開展產(chǎn)孢量試驗(yàn)，同時對不同溫度、pH、光照、植物枝條等影響產(chǎn)孢的因素進(jìn)行進(jìn)行了較深入的研究，以期掌握可可毛色二孢菌簡易、快速、大量獲取其分生孢子產(chǎn)孢技術(shù)因素，也為此類真菌的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

百香果可可毛色二孢莖基腐病菌（L.theobromae），由廣西農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)大學(xué)植保實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定并保存。

1.2 供試培養(yǎng)基

供試培養(yǎng)基，分別由山東拓普生物工程有限公司生產(chǎn)的查氏培養(yǎng)基粉、燕麥瓊脂培養(yǎng)基粉、玉米粉瓊脂培養(yǎng)基粉和北京索萊寶科技有限公司生產(chǎn)的瓊脂粉、自制PCA 培養(yǎng)基為主要材料，以百香果枝條小節(jié)、百香果枝條碎粒、百香果煮枝液、甘露醇、維生素B1、維生素B2、維生素B6、維生素C 等為輔料，單因素組配32 種培養(yǎng)基，以PDA 培養(yǎng)基為對照（表1）。

表1 培養(yǎng)基配方

枝條小節(jié)：選取長勢一致百香果綠枝條切3.0～4.0 cm 小段，于121 ℃高壓滅菌鍋滅菌20 min，置于70 ℃烘箱24 h烘干，得到滅菌的百香果枝條小節(jié)備用。

枝條碎粒：選取長勢一致百香果綠枝條剪0.2 cm 左右碎粒，于121 ℃高壓滅菌鍋滅菌20 min，置于70 ℃烘箱24 h烘干，得到滅菌的百香果枝條碎粒備用。

煮枝液：選取長勢一致百香果綠枝條，去掉葉片和嫩梢，切1.0～2.0 cm 小段，稱取30 g 枝條節(jié)加入水中熬制，大火煮開，小火熬煮1 h，加水定容至100 mL，獲得百香果煮枝液備用。

1.2.1基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方CMA（玉米粉瓊脂培養(yǎng)基粉2.2 g+水100 mL）；Czapek（查氏培養(yǎng)基粉5.0 g+水100 mL）；OA（燕麥瓊脂培養(yǎng)基粉7.3 g+水100 mL）；WA（瓊脂粉2.0 g+水100 mL）；PCA培養(yǎng)基（土豆20.0 g+蔗糖2.0 g+瓊脂粉2.0 g+水100 mL）；PDA 培養(yǎng)基（土豆20.0 g+葡萄糖2.0 g+瓊脂粉2.0 g+水100 mL）。按常規(guī)配制方法配制好后經(jīng)121 Pa高壓滅菌25 min備用。

1.2.2植物組織培養(yǎng)基配制方法取配方中所需的基礎(chǔ)培養(yǎng)基倒入平板，每皿15 mL，冷卻后加入2～3節(jié)枝條小節(jié)，使枝條大部分暴露在平板培養(yǎng)基外面，得到枝條小節(jié)培養(yǎng)基。在超凈工作臺中，每100 mL 平板培養(yǎng)基中加入30.0 g 枝條碎粒，混勻后倒入平板，每皿15 mL，得到枝條碎粒培養(yǎng)基。

1.2.3合成培養(yǎng)基配制方法以煮枝液或基礎(chǔ)培養(yǎng)基為溶液加熱，添加配方中所需成分，充分溶解混勻，經(jīng)121 Pa高壓滅菌25 min備用。

1.3 供試儀器

供試培養(yǎng)箱為珠江牌培養(yǎng)箱，型號：LRH-250-GSB1。

1.4 病原菌產(chǎn)孢條件篩選

1.4.1不同培養(yǎng)基對病原菌產(chǎn)孢量的影響參考羅利娟等[19]的方法并改進(jìn)，單因素組配32 種營養(yǎng)培養(yǎng)基進(jìn)行產(chǎn)孢量試驗(yàn)。分植物組織培養(yǎng)基組和合成培養(yǎng)基培養(yǎng)基組，分植物源培養(yǎng)基組10個處理（表1 中K1、K8、k15、K22、K31；K2、K9、K16、K23、K32），純平板培養(yǎng)基組22 個處理（表1 中K3、K4、k5、K6、K7；K10、K11、K12、K13、K14、K16、K17、k18、K19、K20；K21、K24、K25、K26、K27、K128、K29、k30），每處理4次重復(fù)。供試菌株在PDA 培養(yǎng)基上擴(kuò)繁3 d，用6 mm 打孔器取菌餅，接到各培養(yǎng)基處理平板中央，置于28 ℃、12 h 黑暗、12 h 光照（光照強(qiáng)度300 lx）的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，7 d 后拍照，觀察記錄載孢體形態(tài)；第10 天測定產(chǎn)孢量；第20 天測定孢子成熟比例。

1.4.2不同溫度對病原菌產(chǎn)孢量的影響參考孫光軍等[20]的方法并改進(jìn)，以K20和K25培養(yǎng)基為供試培養(yǎng)基，供試菌株在PDA 培養(yǎng)基上擴(kuò)繁3 d，用6 mm 打孔器取菌餅，接種到培養(yǎng)基處理平板中央，分別在10、15、20、25、30和35 ℃共6個溫度梯度，黑暗12 h、光照12 h（光照強(qiáng)度300 lx）條件下培養(yǎng)，每處理4 次重復(fù)，7 d后拍照，觀察記錄載孢體形態(tài)，分別在第10、18天測定產(chǎn)孢量。

1.4.3pH 值對病原菌產(chǎn)孢量的影響參考孫光軍等[20]的方法等并改進(jìn)，以K20培養(yǎng)基為供試培養(yǎng)基，配置1.0 mol/L NaOH、1.0 mol/L HCl 滅菌，在無菌條件下用NaOH 和HCl 把K20培養(yǎng)基pH 分別調(diào)為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0和12.0共10個梯度，倒入培養(yǎng)基平板，待冷卻后將直徑6.0 mm 的病原菌菌餅接種于不同pH 平板中央，每處理4 次重復(fù)，置于28 ℃、黑暗12 h、光照12 h（光照強(qiáng)度300 lx）培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，7 d 后拍照，觀察記錄載孢體形態(tài)；第10天測定產(chǎn)孢量。

1.4.4不同光照對病原菌產(chǎn)孢量的影響參考孫光軍等[20]的方法等并改進(jìn)，以K20和K25培養(yǎng)基為供試培養(yǎng)基，將6 mm病原菌菌餅分別接種于K20和K25培養(yǎng)基平板中央，進(jìn)行全黑暗（0 lx）、半光半暗（黑暗12 h、光照12 h，光照強(qiáng)度300 lx）、全光照（光照24 h，光照強(qiáng)度300 lx）3種光照環(huán)境處理，全黑暗處理使用4 層錫箔紙包裹遮光，每處理4 次重復(fù)，置于28 ℃人工氣候箱培養(yǎng)，7 d后拍照，觀察記錄載孢體形態(tài)；第10天測定產(chǎn)孢量。

1.4.5不同植物枝條對病原菌產(chǎn)孢量的影響以K31培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別添加荔枝（編號T1，下類同）、桑樹（T2）、扶桑（T3）、柑橘（T4）、桂花樹（T5）、木瓜（T6）、杧果（T7）、陽桃（T8）、李樹（T9）、黃皮（T10）、堅果（T11）、黃素梅（T12）、龍眼（T13）、百香果（T14）、葡萄（T15）15 種植物枝條小節(jié)，制成15 種不同植物的植物源培養(yǎng)基，每種植物源培養(yǎng)基為1 個處理，每處理4 次重復(fù)，將6 mm 病原菌菌餅分別接種于培養(yǎng)基中央，置于28 ℃人工氣候箱培養(yǎng)，7 d 后拍照，觀察記錄載孢體形態(tài)；第10 天測定產(chǎn)孢量。

1.5 病原菌產(chǎn)孢量測定

將10 mL 無菌水加入產(chǎn)孢培養(yǎng)基中，用一次性滅菌涂布器輕磨培養(yǎng)基上的菌落，碾碎載孢體，用雙層滅菌擦鏡紙過濾，洗下分生孢子，用血球計數(shù)板統(tǒng)計產(chǎn)孢量。

1.6 病原菌孢子成熟度的測定

顯微鏡下觀察孢子成熟情況，分生孢子單胞無色計為未成熟，分生孢子雙胞褐色計為成熟，每處理連續(xù)統(tǒng)計孢子100 個以上，4 次重復(fù)，用計數(shù)器統(tǒng)計分生孢子成熟率。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基對病原菌產(chǎn)孢量的影響

2.1.1植物組織培養(yǎng)基從表2、圖1中可知，百香果可可毛色二孢莖基腐病菌（L. theobromae）在5 種枝條小節(jié)培養(yǎng)基中均產(chǎn)生載孢體，除K8（CMA+枝條）培養(yǎng)基無分生孢子外，其他4個處理均產(chǎn)生分生孢子。在K31（PCA+枝條）培養(yǎng)基上，載孢體粒大、量多、凸出，產(chǎn)生的分生孢子量為14.91×104 個/cm2，極顯著高于其他培養(yǎng)基；在K1（OA+枝條）培養(yǎng)基上，載孢體粒大、量中等、凸出，產(chǎn)生的分生孢子量為11.54×104 個/cm2，極顯著高于K22（Czapek+枝條）和K15（WA+枝條）培養(yǎng)基。百香果可可毛色二孢莖基腐病菌在5種枝條碎粒培養(yǎng)基中均產(chǎn)生載孢體及分生孢子，在K2（OA+碎粒）培養(yǎng)基上產(chǎn)生的載孢體粒大、量多，半埋生，產(chǎn)生的分生孢子量為28.56×105 個/皿，極顯著高于其他培養(yǎng)基；在K32（PCA+碎粒）培養(yǎng)基上，載孢體粒大、量多、多數(shù)凸出，產(chǎn)生的分生孢子量為22.10×105 個/皿，極顯著高于K16（WA+碎粒）、K23（Czapek+碎粒）、K9（CMA+碎粒）培養(yǎng)基；K9（CMA+碎粒）產(chǎn)生的分生孢子量極顯著低于其他處理的產(chǎn)孢量。

圖1 病原菌在部分培養(yǎng)基上生長7 d的狀態(tài)

表2 不同植物組織培養(yǎng)基對病原菌產(chǎn)孢量的影響

在10 種植物組織培養(yǎng)基上培養(yǎng)20 d 后，K9（CMA+碎粒）產(chǎn)生的分生孢子成熟率為90.91%，其他處理孢子成熟率在1.11%～29.41%。

可知，百香果可可毛色二孢莖基腐病菌（L. theobromae）在植物組織培養(yǎng)基上容易產(chǎn)生分生孢子，以O(shè)A、CPA+枝條組織的培養(yǎng)基產(chǎn)孢量較高，WA、Czapek+枝條組織的培養(yǎng)基產(chǎn)孢量次之，CMA+枝條組織的培養(yǎng)基產(chǎn)孢量較少或不產(chǎn)孢。

2.1.2合成培養(yǎng)基將供試菌株分別接種在22種合成培養(yǎng)基上，培養(yǎng)7 d 后觀察發(fā)現(xiàn)15 種合成培養(yǎng)基產(chǎn)生載孢體，7 種合成培養(yǎng)基沒有產(chǎn)生載孢體，PDA（CK）培養(yǎng)基沒有產(chǎn)生載孢體（圖1）；培養(yǎng)10 d后測定發(fā)現(xiàn)，沒有產(chǎn)生載孢體的培養(yǎng)基都沒有產(chǎn)生分生孢子，K14和K19號培養(yǎng)基上產(chǎn)生載孢體但沒有產(chǎn)生分生孢子。K4（燕麥培養(yǎng)基粉7.3 g+煮枝液100 mL+甘露醇2.5 g）培養(yǎng)基載孢體粒較大、多、多數(shù)立生，產(chǎn)生的分生孢子量最多，為5.27×105個/皿，極顯著高于其他培養(yǎng)基；K6（燕麥培養(yǎng)基粉7.5 g+煮枝液100 mL+維生素B13.0 mg+甘露醇2.5 g）和K7（燕麥培養(yǎng)基粉7.5 g+煮枝液100 mL+B130 mg、維生素B21.5 mg、維生素B60.2 mg、維生素C 100 mg）培養(yǎng)基載孢體粒較大、多、多數(shù)立生，產(chǎn)生的分生孢子量排第2、3位，分別為4.65×105個/皿和4.62×105個/皿，極顯著高于除K4以外的培養(yǎng)基；K20（白瓊脂粉2 g+煮枝液100 mL+維生素B13.0 mg+甘露醇2.5 g）培養(yǎng)基載孢體粒大、多、立生，產(chǎn)生的分生孢子量為2.91×105個/皿，排第4 位，極顯著高于除K4、K6和K7外的培養(yǎng)基；產(chǎn)生的分生孢子量排第5～10 的培養(yǎng)基分別為K3、K25、K27、K21、K5、K17，分生孢子量分別為2.06×105、1.22×105、1.16×105、0.37×105、0.36×105、0.45×105個/皿，其間存在顯著性差異；K24、K26和K28培養(yǎng)基產(chǎn)孢量排第11～13位，3個處理間沒有顯著性差異；K10、K11、K12、K13、K14、K18、K19、K29、K30和K33（CK）10個處理培養(yǎng)基沒有產(chǎn)生分生孢子（表3）。

表3 不同合成培養(yǎng)基對病原菌產(chǎn)孢量的影響

因此，K4（燕麥培養(yǎng)基粉7.5 g+煮枝液100 mL+甘露醇2.5 g）培養(yǎng)基為百香果可可毛色二孢莖基腐病菌（L. theobromae）分生孢子產(chǎn)生的最佳合成培養(yǎng)基，其次為K6（燕麥培養(yǎng)基粉7.3 g+煮枝液100 mL+維生素B13.0 mg+甘露醇2.5g）和K7（燕麥培養(yǎng)基粉7.5 g+煮枝液100 mL+維生素B13.0 mg、維生素B21.5 mg、維生素B60.2 mg、維生素C 100 mg）培養(yǎng)基，再次為K20（白瓊脂粉2.0 g+煮枝液100 mL+維生素B13.0 mg+甘露醇2.5 g）培養(yǎng)基。

在12種合成培養(yǎng)基上均可產(chǎn)生分生孢子，培養(yǎng)20 d后，孢子成熟率在3.33%～50.00%。

2.2 不同溫度對病原菌產(chǎn)孢量的影響

培養(yǎng)溫度對百香果可可毛色二孢莖基腐病菌（L. theobromae）載孢體和分生孢子產(chǎn)生的影響較大，溫度過低或過高都不利于載孢體和分生孢子產(chǎn)生。由圖2 可知，病原菌在K20號培養(yǎng)基上、溫度為15～30 ℃產(chǎn)生載孢體，溫度≤15 ℃或≥35 ℃時，未產(chǎn)生載孢體。K20和K25培養(yǎng)基在不同溫度條件下培養(yǎng)10 d，25 ℃條件下產(chǎn)孢量極顯著高于其他處理，20 ℃條件下產(chǎn)孢量其次，30 ℃條件下產(chǎn)孢量較少，溫度≤15 ℃或≥35 ℃時，未產(chǎn)生分生孢子。K20和K25培養(yǎng)基在不同溫度條件下培養(yǎng)18 d，25 ℃條件下產(chǎn)孢量極顯著高于其他，20、30 ℃條件下產(chǎn)孢量其次，15 ℃條件下產(chǎn)孢量較少，溫度≤10 ℃或≥35 ℃時，未產(chǎn)生分生孢子，培養(yǎng)18 d 產(chǎn)生的分生孢子量高于培養(yǎng)10 d產(chǎn)生的分生孢子量（圖3）。

圖2 病原菌在K20號培養(yǎng)基上不同溫度條件下生長7 d的狀態(tài)

圖3 不同溫度對病原菌產(chǎn)孢量的影響

因此，百香果可可毛色二孢莖基腐病菌分生孢子產(chǎn)生的最適宜的溫度條件為25 ℃。

2.3 不同pH值對病原菌產(chǎn)孢量的影響

由圖4 可知，百香果可可毛色二孢莖基腐病菌（L. theobromae）在pH 3～6 培養(yǎng)基上產(chǎn)生的載孢體較多，在pH 7～12培養(yǎng)基上產(chǎn)生的載孢體較少。由圖5 可知，在pH 為4 時產(chǎn)生的分生孢子量最多，為5.41×105個/皿，極顯著高于其他pH 條件；pH 為3 時產(chǎn)生的分生孢子量次之，為4.31×105個/皿，極顯著高于除pH 為4 以外的pH 條件；產(chǎn)生的分生孢子量排在第3、4、5位的pH值為5～7，產(chǎn)生的分生孢子量分別為3.13×105、2.67×105、0.78×105個/皿，分生孢子產(chǎn)孢量與pH 值呈反比，pH 越高，產(chǎn)孢量越少，處理間存在顯著性差異；pH 為8～12 條件下分生孢子產(chǎn)孢量最少，為0.05×105～0.01×105個/皿，處理間沒有顯著性差異。

圖4 病原菌在不同pH值條件下生長7 d的狀態(tài)

圖5 不同pH值對病原菌產(chǎn)孢量的影響

因此，偏酸性條件有利于百香果可可毛色二孢莖基腐病菌（L. theobromae）分生孢子產(chǎn)生，最適宜pH值條件是pH 4。

2.4 不同光照條件對病原菌產(chǎn)孢量的影響

由圖6、圖7 可知，光照條件對百香果可可毛色二孢莖基腐病菌（L. theobromae）產(chǎn)生分生孢子的影響較大，在K20和K25培養(yǎng)基上全黑暗光照條件下未產(chǎn)生載孢體，在半光半暗和全光照條件下產(chǎn)生載孢體；K20和K25培養(yǎng)基在半光半暗條件產(chǎn)生的分生孢子量極顯著大于全光照和全黑暗，全黑暗條件下產(chǎn)孢量為0。

圖6 病原菌在不同光照條件下生長7 d的狀態(tài)

圖7 不同光照條件對病原菌產(chǎn)孢量的影響

因此，可知半光半暗是百香果可可毛色二孢莖基腐病菌（L. theobromae）分生孢子產(chǎn)生的最佳光照條件，全光照次之，全黑暗沒有產(chǎn)生分生孢子。

2.5 不同植物枝條培養(yǎng)基對病原菌產(chǎn)孢量的影響

由圖8、圖9 可知，百香果可可毛色二孢莖基腐病菌（L. theobromae）在15種不同植物組織培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d 后均產(chǎn)生載孢體。其中，在柑橘+PCA 的T4培養(yǎng)基產(chǎn)孢量最多，為19.93×104個/cm2，產(chǎn)生的分生孢子量極顯著高于其他培養(yǎng)基；在桑樹、扶桑+PCA的T2、T3培養(yǎng)基上，產(chǎn)生的分生孢子量次之，分別為18.13×104、16.72×104個/cm2，極顯著高于除T4外的培養(yǎng)基；堅果、百香果、桂花樹+PCA的T11、T14、T15培養(yǎng)基產(chǎn)生的分生孢子量排第3 位，為14.40×104、14.14×104、13.86×104個/cm2，極顯著高于除T4、T2和T3外的培養(yǎng)基；桑樹、李樹、龍眼、木瓜、葡萄、陽桃、杧果、黃素梅+PCA 的T2、T9、T13、T6、T15、T8、T7、T12培養(yǎng)基孢子量較少、依次降低。

圖8 病原菌在不同植物枝條培養(yǎng)基上生長7 d的狀態(tài)

圖9 不同植物枝條培養(yǎng)基對病原菌產(chǎn)孢量的影響

因此，可知病原菌在15種不同植物枝條培養(yǎng)基上培養(yǎng)均產(chǎn)生分生孢子，柑橘、桑樹、扶桑、堅果、百香果、桂花樹依次為較適合百香果可可毛色二孢莖基腐病菌（L. theobromae）產(chǎn)孢的植物枝條。

3 討論

方中達(dá)［21］認(rèn)為，在促進(jìn)植物病原真菌產(chǎn)孢的研究進(jìn)程中，培養(yǎng)基與孢子產(chǎn)生關(guān)系最大，采用不同培養(yǎng)基或改變它們成分，是促進(jìn)孢子產(chǎn)生的最主要途徑。本次研究結(jié)果顯示，培養(yǎng)基營養(yǎng)成分對百香果可可毛色二孢莖基腐病菌（L. theobromae）分生孢子產(chǎn)生影響較大，參試的32 個配方培養(yǎng)基中，21 個配方培養(yǎng)基產(chǎn)生分生孢子，11個配方培養(yǎng)基未產(chǎn)生分生孢子。在植物組織培養(yǎng)基上容易產(chǎn)生分生孢子，以O(shè)A、CPA+枝條組織培養(yǎng)基產(chǎn)孢量較高，WA、Czapek+枝條組織培養(yǎng)基產(chǎn)孢量次之，CMA+枝條組織培養(yǎng)基產(chǎn)孢量較少或沒有產(chǎn)孢，在一定面積的合適基礎(chǔ)培養(yǎng)基上，載孢體數(shù)量與組織材料面積呈正相關(guān)，而分生孢子量與載孢體數(shù)量、體積也呈正相關(guān)；病原菌在不同合成培養(yǎng)基上產(chǎn)生分生孢子情況差異較大，最佳合成培養(yǎng)基是K4（燕麥培養(yǎng)基粉7.3 g+煮枝液100 mL+甘露醇2.5 g）培養(yǎng)基，其次為K6（燕麥培養(yǎng)基粉7.3 g+煮枝液100 mL+維生素B13.0 mg+甘露醇2.5 g）和K7（燕麥培養(yǎng)基粉7.3 g+煮枝液100 mL+維生素B13.0 mg、維生素B21.5 mg、維生素B60.2 mg、維生素C 100.0 mg）培養(yǎng)基，再次為K20（白瓊脂粉2.0 g+煮枝液100 mL+維生素B13.0 mg+甘露醇2.5 g）培養(yǎng)基，其中K4、K6、K7為同一系列營養(yǎng)的培養(yǎng)基，都是以“燕麥培養(yǎng)基粉7.5 g+煮枝液”添加不同微量元素組成，K4和K20培養(yǎng)基添加的微量元素為甘露醇，可知燕麥培養(yǎng)基粉、煮枝液、甘露醇成分可促進(jìn)載孢體及分生孢子快速產(chǎn)生。在10 種植物組織培養(yǎng)基上培養(yǎng)20 d 后，K9（CMA+碎粒）產(chǎn)生的分生孢子成熟率為90.91%，其他處理孢子成熟率在1.11%～29.41%，在可產(chǎn)生分生孢子的12 種合成培養(yǎng)基培養(yǎng)20 d 后，孢子成熟率在3.33%～50.00%。

本次研究結(jié)果表明，培養(yǎng)溫度對百香果可可毛色二孢莖基腐病菌分生孢子產(chǎn)生的影響較大，溫度過低或過高都不利于分生孢子產(chǎn)生。培養(yǎng)10 d時，只有在20～30 ℃條件下產(chǎn)生孢子，25 ℃產(chǎn)孢量最高，≤10 ℃或≥35 ℃時，沒有產(chǎn)生分生孢子；培養(yǎng)18 d時，在15～30 ℃條件下產(chǎn)生孢子，25 ℃產(chǎn)孢量最高，≤10 ℃或≥35 ℃時，沒有產(chǎn)生分生孢子，培養(yǎng)18 d產(chǎn)生的分生孢子量高于培養(yǎng)10 d 產(chǎn)生的分生孢子量。因此，百香果可可毛色二孢莖基腐病菌分生孢子產(chǎn)生的最適宜培養(yǎng)溫度條件為25 ℃。pH 值對病原菌產(chǎn)孢量的影響較大，史國英等[13]研究結(jié)果表明，可可毛色二孢菌在pH 3～4的PSB培養(yǎng)基上培養(yǎng)30 d后可產(chǎn)生子座及分生孢子，在其他pH值條件下沒有產(chǎn)生子座及分生孢子。本研究結(jié)果表明，百香果可可毛色二孢莖基腐病菌（L. theobromae）在K20（白瓊脂粉2 g+煮枝液100 mL+維生素B13.0 mg+甘露醇2.5 g）培養(yǎng)基上培養(yǎng)10 d，pH 3～7均可產(chǎn)生分生孢子及載孢體，pH 4產(chǎn)孢量最多，其次為pH 3，偏酸性條件有利于分生孢子產(chǎn)生。光照條件對可可毛色二孢菌（L. theobromae）產(chǎn)孢量的影響較大，薛振南等[10]研究病原菌在連續(xù)光照和12 h 光暗交替處理下產(chǎn)孢結(jié)果，認(rèn)為在連續(xù)光照的OMA 培養(yǎng)基上病原菌產(chǎn)孢較快較多；楊德潔等[15]]和謝紅輝等[22]研究病原菌在全黑暗及全光照條件下培養(yǎng)產(chǎn)孢情況，認(rèn)為病原菌在黑暗條件培養(yǎng)處理沒有子實(shí)體，持續(xù)光照有利于分生孢子器的形成和分生孢子的產(chǎn)生。本研究結(jié)果認(rèn)為百香果可可毛色二孢莖基腐病菌（L. theobromae）在全黑暗條件下未形成載孢體及產(chǎn)生分生孢子，在半光半暗條件下產(chǎn)孢量最多，全光照條件下產(chǎn)孢量次之，本研究結(jié)果與楊德潔等[15]和謝紅輝等[22]研究結(jié)果一致，與薛振南等[10]有些不同，可能與所研究的光照強(qiáng)度、病原菌寄主不同有關(guān)，可繼續(xù)在光照強(qiáng)度、光暗間隔時間等方面進(jìn)一步研究。病原菌在隨機(jī)挑選的15 種不同植物枝條培養(yǎng)基上培養(yǎng)均形成載孢體及產(chǎn)生分生孢子，柑橘、桑樹、扶桑、堅果、百香果和桂花樹依次是較適合百香果可可毛色二孢莖基腐病菌產(chǎn)孢的植物枝條，本研究結(jié)果再次證明可可毛色二孢菌浸染寄主范圍廣泛。

4 結(jié)論

百香果可可毛色二孢莖基腐病菌在OA、CPA+枝條組織的培養(yǎng)基上培養(yǎng)產(chǎn)孢量較高，最佳合成培養(yǎng)基為配方燕麥培養(yǎng)基粉7.3 g+煮枝液100 mL+甘露醇2.5 g的K4培養(yǎng)基，最佳培養(yǎng)溫度條件為25 ℃，最適pH為4，最佳光照條件為半光半暗，柑橘、桑樹、扶桑、堅果、百香果和桂花樹依次是較適合病原菌產(chǎn)孢的植物枝條。